본 프로토콜은 토양 샘플에서 유기염소 농약 잔류물을 성공적으로 측정하기 위해 가스 크로마토그래피-질량분석법과 함께 QuEChERS에서 상 분할을 위한 포름산암모늄의 활용을 설명합니다.
현재 QuEChERS 방법은 공식 및 비공식 실험실의 다양한 매트릭스에서 잔류 농약을 분석하기 위해 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 샘플 준비 프로토콜을 나타냅니다. 포름산 암모늄을 사용하는 QuEChERS 방법은 이전에 원래 버전과 두 가지 공식 버전에 비해 유리한 것으로 입증되었습니다. 한편으로, 샘플 그램 당 0.5g의 포름산 암모늄을 간단히 첨가하면 상 분리를 유도하고 우수한 분석 성능을 달성하기에 충분합니다. 반면에 포름산 암모늄은 일상적인 분석에서 유지 보수의 필요성을 줄여줍니다. 여기에서는 포름산 암모늄을 사용하는 변형 된 QuEChERS 방법을 농업 토양의 유기 염소 살충제 (OCP) 잔류 물의 동시 분석에 적용했습니다. 구체적으로, 시료 10g을 물 10mL로 수화시킨 후 아세토니트릴 10mL로 추출하였다. 다음에, 5 g 의 포름산 암모늄을 사용하여 상 분리를 수행하였다. 원심분리 후, 상청액을 무수 황산마그네슘, 1차-2차 아민 및 옥타데실실란을 사용한 분산 고체상 추출 클린업 단계를 거쳤다. 가스 크로마토 그래피-질량 분석법이 분석 기술로 사용되었습니다. 포름산 암모늄을 사용하는 QuEChERS 방법은 토양 샘플에서 OCP 잔류물을 추출하기 위한 성공적인 대안으로 입증되었습니다.
식량 생산을 늘릴 필요성으로 인해 지난 수십 년 동안 전 세계적으로 살충제가 집중적이고 광범위하게 사용되었습니다. 살충제는 해충으로부터 보호하고 작물 수확량을 증가시키기 위해 작물에 적용되지만 잔류 물은 일반적으로 토양 환경, 특히 농업 지역에서 끝납니다1. 또한 유기 염소 살충제 (OCP)와 같은 일부 살충제는 구조가 매우 안정적이어서 잔류 물이 쉽게 분해되지 않고 토양에 오랫동안 남아 있습니다2. 일반적으로 토양은 특히 유기물 함량이 높은 경우 잔류 농약을 축적 할 수있는 능력이 높습니다3. 결과적으로 토양은 잔류 농약으로 가장 오염 된 환경 구획 중 하나입니다. 예를 들어, 현재까지의 완전한 연구 중 하나는 유럽 연합 전역의 317 개 농업 토양 중 83 %가 하나 이상의 잔류 농약으로 오염 된 것으로 나타났습니다4.
잔류 농약에 의한 토양 오염은 잔류 물5,6의 높은 독성으로 인해 먹이 사슬을 통해 비 표적 종, 토양 기능 및 소비자 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 결과적으로, 토양의 잔류 농약 평가는 특히 살충제 사용에 대한 엄격한 규정이 없기 때문에 개발 도상국에서 환경 및 인체 건강에 대한 잠재적 인 부정적인 영향을 평가하는 데 필수적입니다7. 이로 인해 살충제 다중 잔류 물 분석이 점점 더 중요 해지고 있습니다. 그러나, 토양에서 잔류 농약의 신속하고 정확한 분석은 많은 수의 간섭 물질뿐만 아니라 이러한 분석 물질의 낮은 농도 수준 및 다양한 물리 화학적 특성으로 인해 어려운 과제입니다4.
모든 잔류 농약 분석 방법 중에서 QuEChERS 방법은 가장 빠르고, 쉽고, 저렴하고, 가장 효과적이고, 강력하고, 안전한 옵션8이 되었습니다. QuEChERS 방법에는 두 단계가 포함됩니다. 첫 번째 단계에서는 수성 층과 아세토니트릴 층 사이의 염석을 통한 분할을 기반으로 하는 마이크로 스케일 추출이 수행됩니다. 제 2 단계에서, 분산 고체상 추출 (dSPE)을 채용하여 세정 공정이 수행되고; 이 기술은 소량의 다공성 흡착제 조합을 사용하여 매트릭스 간섭 성분을 제거하고 기존 SPE9의 단점을 극복합니다. 따라서 QuEChERS는 매우 정확한 결과를 제공하고 무작위 및 시스템 오류의 잠재적 원인을 최소화하는 용매/화학 물질 낭비가 거의 없는 환경 친화적인 접근 방식입니다. 실제로 수백 가지 살충제의 고처리량 일상 분석에 성공적으로 적용되었으며 거의 모든 유형의 환경, 농식품 및 생물학적 샘플 8,10에 강력하게 적용할 수 있습니다. 이 작업은 농업 토양에서 OCP를 분석하기 위해 이전에 개발되고 GC-MS에 결합된 QuEChERS 분석법의 새로운 수정을 적용하고 검증하는 것을 목표로 합니다.
1. 저장 용액의 준비
알림: 전체 프로토콜 동안 니트릴 장갑, 실험실 코트 및 보안경을 착용하는 것이 좋습니다.
2. 샘플 수집
3. 포름산암모늄을 사용한 변형된 QuEChERS 방법을 통한 시료 전처리
참고: 그림 1 은 수정된 QuEChERS 분석법의 개략도를 보여줍니다.
4. GC-MS에 의한 기기 분석
5. 데이터 수집
QuEChERS 방법의 원래9 및 두 공식 버전13,14는 황산마그네슘을 염화나트륨, 아세테이트 또는 구연산염 염과 함께 사용하여 추출 중에 아세토니트릴/물 혼합물 분리를 촉진합니다. 그러나 이러한 염은 질량 분석법(MS) 소스의 표면에 고체로 증착되는 경향이 있으므로 액체 크로마토그래피(LC)-MS 기반 방법의 유지 관리가 증가합니다. 이러한 단점을 극복하는 측면에서 González-Curbelo et al.15는 휘발성이 높은 포름산 암모늄이 LC- 및 GC- 탠덤 질량 분석법 (MS / MS) 모두에 대해 상 분리 및 잔류 농약 추출을 유도하는 데 효과적이라고보고했습니다. 후속 연구에서는 다양한 복합 매트릭스16,17,18,19에서 잔류 농약을 추출하기 위해 샘플 그램 당 0.5g의 포름산 암모늄을 사용했습니다. 또한, 암모늄 포르메이트의 사용은 더 적은 양의 공동 추출 물질(20)을 제공하는 것으로 나타 났으며, 이는 GC-MS 기반 방법에 대한 사용을 정당화한다. 본 연구는 처음으로 토양21의 잔류 농약을 분석하기 위해이 버전을보고합니다.
토양과 같은 복잡한 매트릭스에서 농약 잔류 물의 GC 분석은 살충제의 도구 반응에 대한 공동 추출 매트릭스 성분의 작용으로 인해 몇 가지 한계가 있으며, 이는 부정확 한 결정과 낮은 감도를 유발합니다22,23. 따라서, 매트릭스 효과를 최소화하기 위해 몇 가지 개선이 이루어졌으며, 최적화된 클린업 단계(21)를 포함한다. 그럼에도 불구하고 매트릭스 효과는 여전히 발생하며 가능한 한 많이 수정해야합니다. 이러한 의미에서, 매트릭스-매칭 교정은 순수한 용매(24)의 것과 관련하여 크로마토그래피 신호의 향상을 보상하는데 매우 실용적이기 때문에 사용된 주요 접근법이었다. 따라서, 본 연구에서, 순수한 아세토니트릴에서 검량선을 구축하고 토양 추출물을 사용하여 선형성을 평가하였으며, 모든 OCP에 대해 0.99 이상의R2 값을 두 접근법을 모두 사용하여 수득하였다. 그러나 두 검량선을 비교했을 때 –49%에서 191% 범위에서 상당한 행렬 효과가 발견되었습니다(그림 2). 강력한 매트릭스 효과를 겪은 살충제의 수는 17 개 (endrin, endrin ketone 및 methoxychlor) 중 3 개에 불과했지만 매트릭스 효과를 더 많이 보상하기 위해 매트릭스 일치 검량 곡선을 사용하여 후속 연구를 수행했습니다.
토양의 잔류 농약에 대한 최대 잔류 한계 (MRL)는 설정되지 않았지만 모든 OCP에 대해 5 μg / kg의 LCL이 설정되었으며, 이는 농식품의 잔류 농약 분석을위한 국제 법률 (규정 396/2005) 11에 의해 10 μg / kg으로 설정된 매우 까다로운 표준 MRL보다 낮습니다. 또한 5μg/kg의 LCL은 모든 OCP에 대해 약 10의 신호 대 잡음비(S/N)를 제공했습니다. 이 방법의 높은 민감도는 QuEChERS 방법에 이어 GC-MS를 사용하여 토양의 OCP를 분석 한 다른 연구에서 얻은 것과 유사하거나 훨씬 우수합니다. 예를 들어, 한 연구에서 구연산염 완충액을 사용하는 QuEChERS 방법의 공식 버전을 사용하여 34개의 OCP를 분석했으며 정량화 한계(LOQ)는 7μg/kg25 이상이었습니다. 특히, α-BHC, β-BHC, 린단 및 δ-BHC의 LOQ 값은 206 μg/kg 내지 384 μg/kg 사이였다. 다른 연구에서, 린단과 딜드린은 동일한 버전의 QuEChERS 방법을 사용하여 분석되었고, 각각 42 μg/kg 및 292 μg/kg의 LOQ 값이 얻어졌다26. 마찬가지로, 또 다른 연구 연구에서도 QuEChERS 및 GC-MS를 사용하여 알드린과 헵타클로르를 결정했으며, LOQ 값은 각각 13 및 23μg/kg으로27입니다.
회수율 및 재현성 평가는 3 중 (n = 9)의 3 가지 농도 수준 (낮음, 중간 및 높음)에서 개발되었습니다. 이를 위해 포름산암모늄을 사용하는 QuEChERS 방법 적용 초기에 스파이크된 토양 샘플에서 얻은 살충제 피크 면적/IS(4,4′-DDE-d8) 피크 면적 비율을 매트릭스 일치 보정의 비율과 비교하여 전체 회수 값을 결정했습니다. 모든 경우에, 각각의 반복실험은 동일한 순서로 2회 주입되었다. 동위원소 라벨이 부착된 표준물질인 IS를 사용하면 전체 절차 중에 발생하는 살충제의 가능한 손실과 매트릭스 효과 및/또는 기기의 가능한 변동성을 보상할 수 있습니다. 결과에 따르면 대부분의 살충제는 각 스파이크 수준 70에서 RSD ≤20 %로 120 % –28 % 회수 값의 허용 기준을 충족하여 방법의 효과와 반복성을 입증했습니다. 그럼에도 불구하고 전체 회수 값 (n = 9)은 헵타 클로르 (122 %), 엔드 린 (121 %) 및 β- 엔도 술판 (130 %)의 경우 120 %보다 약간 높았지만 일관성이있었습니다 (RSD <13 %). 이러한 의미에서 세 가지 스파이크 수준에서 전체 복구 값을 고려할 때 RSD 값 ≤20 %와 함께 30 % -140 %의 허용 기준이 설정되었습니다28.
결론적으로, 포름산암모늄과 GC-MS를 결합한 QuEChERS 분석법은 농업 토양 샘플에서 OCP를 성공적으로 측정할 수 있습니다. 이 연구에서 물과 아세토니트릴 층 사이의 상 분리를 유도하기 위해 5g의 포름산암모늄을 간단히 첨가하면 선택된 살충제의 높은 회수율로 적절한 추출이 보장되는 것으로 나타났습니다. 그러나 매트릭스 효과는 계속 발생했기 때문에 분석 물 보호제 첨가와 같은 다른 접근법을 후속 연구에서 연구해야합니다. 어떤 경우든 공식 QuEChERS 버전에 대한 이 대안은 특히 일상적인 LC-MS 기반 분석에서 마그네슘 및 나트륨 염의 사용으로 인해 분석 시스템에 증착되는 바람직하지 않은 고형물을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. 후자의 경우, 암모늄 포름산염은 양성 전기 분무 이온화에서 이온화를위한 보조제이며 나트륨 부가물 대신 암모늄 부가물의 형성을 향상시킬 수 있기 때문에 더욱 흥미로울 것이다.
The authors have nothing to disclose.
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes | PYREX | 99502-15 | |
2 mL centrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | |
50 mL centrifuge tubes with screw caps | VWR | 21008-169 | |
5977B mass-selective detector | Agilent Technologies | 1617R019 | |
7820A gas chromatography system | Agilent Technologies | 16162016 | |
Acetone | Supelco | 1006582500 | |
Acetonitrile | VWR | 83642320 | |
Ammonium formate | VWR | 21254260 | |
Automatic shaker KS 3000 i control | IKA | 3940000 | |
Balance | Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co | ENTRIS224I-1S | |
Bondesil-C18, 40 µm | Agilent Technologies | 12213012 | |
Bondesil-PSA, 40 µm | Agilent Technologies | 12213024 | |
Cyclohexane | VWR | 85385320 | |
EPA TCL pesticides mix | Sigma Aldrich | 48913 | |
Ethyl acetate | Supelco | 1036492500 | |
G4567A automatic sampler | Agilent Technologies | 19490057 | |
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column | Agilent Technologies | 19091S-433UI | |
Magnesium sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | 434183-1KG | |
Mega Star 3.R centrifuge | VWR | 521-1752 | |
Milli-Q gradient A10 | Millipore | RR400Q101 | |
p,p'-DDE-d8 | Dr Ehrenstorfer | DRE-XA12041100AC | |
Pipette tips 2 – 200 µL | BRAND | 732008 | |
Pipette tips 5 mL | BRAND | 702595 | |
Pipette tips 50 – 1000 uL | BRAND | 732012 | |
Pippette Transferpette S variabel 10 – 100 µL | BRAND | 704774 | |
Pippette Transferpette S variabel 100 – 1000 µL | BRAND | 704780 | |
Pippette Transferpette S variabel 20 – 200 µL | BRAND | 704778 | |
Pippette Transferpette S variabel 500 – 5000 µL | BRAND | 704782 | |
Vials with fused-in insert | Sigma Aldrich | 29398-U | |
<strong>OCPs</strong> | <strong>CAS registry number</strong> | ||
α-BHC | 319-84-6 | ||
β-BHC | 319-85-7 | ||
Lindane | 58-89-9 | ||
δ-BHC | 319-86-8 | ||
Heptachlor | 76-44-8 | ||
Aldrin | 309-00-2 | ||
Heptachlor epoxide | 1024-57-3 | ||
α-Endosulfan | 959-98-8 | ||
4,4'-DDE-d8 (IS) | 93952-19-3 | ||
4,4'-DDE | 72-55-9 | ||
Dieldrin | 60-57-1 | ||
Endrin | 72-20-8 | ||
β-Endosulfan | 33213-65-9 | ||
4,4'-DDD | 72-54-8 | ||
Endosulfan sulfate | 1031-07-8 | ||
4,4'-DDT | 50-29-3 | ||
Endrin ketone | 53494-70-5 | ||
Methoxychlor | 72-43-5 |