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방법 논문

유도 가능한 조골 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정 치아 운동 중 치조골 리모델링 연구

2.3K 조회수

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DOI:

10.3791/65613

⸱

2023년 7월 21일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하기 위한 프로토콜을 제공하고, 치아 교정 운동 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 실마리를 제공합니다.

초록

회전율이 높은 치조골은 신체에서 가장 활발하게 리모델링되는 뼈입니다. 치아 교정 운동(OTM)은 기계적 힘에 반응하여 치조골 뼈를 리모델링하는 일반적인 인위적인 과정이지만 근본적인 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 기존 연구들은 동물모델 관련 제약으로 인해 시간과 공간에 구애받지 않는 뼈 리모델링의 정확한 메커니즘을 밝힐 수 없었다. 전사 3의 신호 변환기 및 활성제(STAT3)는 뼈 대사에 중요하지만 OTM 중 조골세포에서 그 역할은 불분명합니다. STAT3가 특정 시점과 OTM 중 특정 세포에서 OTM에 참여한다는 생체 내 증거를 제공하기 위해 타목시펜 유도 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스 모델을 생성하고 교정력을 가하고 치조골 표현형을 분석했습니다.

마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT)과 입체 현미경을 사용하여 OTM 거리에 접근했습니다. 조직학적 분석은 조골세포와 파골세포의 대사 활성을 평가하기 위해 상악골의 단면에서 첫 번째 대구치(M1)의 3개 뿌리 내에 위치한 영역을 관심 영역(ROI)으로 선택하여 치조골에 대한 교정력의 효과를 나타냅니다. 요컨대, 우리는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하고 OTM 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 새로운 빛을 비추는 프로토콜을 제공합니다.

서론

일반적으로 뼈는 울프의 법칙 1,2에 따라 기계적 힘에 반응하여 일생 동안 지속적으로 재건되는 것으로 알려져 있습니다. 중력 및 일상적인 운동과 같은 적절한 기계적 자극은 골량과 강도를 유지하고 조골세포와 파골세포를 모두 자극하여 뼈 손실을 방지합니다. 골 흡수를 담당하는 파골세포(osteoclast)3,4,5,6,7와 골 형성을 담당하는 조골세포(osteoblast) 8,9,10은 뼈의 항상성을 유지하고 뼈 리모델링의 생물학적 과정에서 공동으로 기능합니다. 대조적으로, 장기간의 미세중력 하에서 우주비행사와 같이 하중 자극이 없는 경우, 뼈는 10%의 골밀도 손실을 겪고, 따라서 골다공증의 위험이 증가한다

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프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 관련 방법은 상하이 자오퉁 대학 의과대학 상하이 제9인민병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(82101048번).

1. 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스 확립

참고: Stat3 fl/fl 마우스는 상업적으로 획득되었습니다. Col1α2CreERT2균주는 선물이었습니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 표준화된 실험실 펠릿 먹이와 물 및 표준 실험실 환경 조건(22°C 내지 26°C의 실온 및 50%-55%의 습도)이 모든 동물에게 제공되었다.

  1. 성적으로 성숙한 수컷 쥐 한 마리와 암컷 쥐 두 마리를 같은 케이지에 넣습니다. 18일 후에는 매일 신생아를 확인하십시오. 임신한 암컷 쥐를 빈 케이지로 옮기고 필요한 경우 혼자 두십시오. 암컷 쥐가 30일 이내에 임신하지 않으면 수컷 쥐를 다른 번식 케이지에 넣습니다.
  2. Stat3fl/+ 생성; Stat3 fl/fl 마우스를 Col1α2 CreERT2 마우스와 ....

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결과

이 프로토콜을 사용하여 유도 가능한 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스(Stat3Col1α2ERT2) 모델을 구축하여 교정 힘에 의한 폐포골 리모델링에 대한 STAT3 결실의 효과를 조사했습니다(그림 1A,B). 조골세포에서의 STAT3 결실은 폐포골의 면역형광 염색에 의해 확인되었습니다(그림 1C).

입체 현미경은 WT 마우스의 OTM 거리가 d4, d7 및 d10에서 증가했음을 나타냈습니다. 그러나 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서는 OTM 거리가 감소했습니다(그림 2B). 이 현상은 d10에 대한 Micro-CT 분석에서도 확인되었으며, 이는 조골세포 Stat3 결실이.......

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토론

부정교합은 호흡, 저작, 말하기, 심지어 외모를 손상시키는 가장 흔한 구강 장애 중 하나이기 때문에 이전 역학 조사에 따르면 발생률이 70%에서 93%로 증가하는 등 교정에 대한 수요가 나날이 증가하고 있습니다31,32. 치열 교정 치료의 효율성을 안전하게 높이기 위해 치조골 리모델링을 가속화하는 방법은 이 분야에서 뜨거운 주제가 되었습니다. 따라서 OTM에 의한 치조골 리모델링의 기전을 명확히 할 필요가 있다. 이전 연구에서 연구자들은 생체 내 약물 주입을 사용하여 동물 모델21,33에서 OTM의 메커니즘을 연구했는데, 이는 간단하고 쉬웠지만 다른 시스템의 세포에 대한 약물의 영향을 배제하기는 어려웠습니다. 따라서 생체 내 교정력에 의한 뼈 재형성의 기전을 연구하는 것이 매우 필요합니다........

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 상하이 자연과학재단(21ZR1436900, 22ZR1436700); 상하이 학술/기술 연구 리더 프로그램(20XD1422300); SHDC의 임상 연구 계획(SHDC2020CR4084); 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원의 학제간 연구 기금(JYJC201902, JYJC202116); 상하이 고급 지역 대학의 혁신 연구팀(SSMUZLCX20180501); 연구 규율 기금 no. KQYJXK2020 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 구강학 대학 출신; 상하이 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(JYYC003)의 독창적인 탐사 프로젝트; Shanghai Jiao Tong University School of Medicine의 200명의 인재 프로젝트; 생체 재료 및 재생 의학 연구소 협력 연구 프로젝트, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(2022LHB02); 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원 바이오뱅크 프로젝트(YBKB201909, YBKB202216).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x PBS베이징 솔라바이오 사이언스 & 테크놀로지 주식회사 P1020
4% 파라포름알데히드무한 Servicebio Technology Co., Ltd.G1101
Alizarin redSigma-AldrichA5533
Anti-CTSK 항체Santa Cruzsc-48353
Anti-OPN 항체R& D Systems, Minneapolis, MN, USAAF808
CalceinSigma-AldrichC0875
폐쇄 코일 스프링혁신 재료 및 장치, 상하이, 중국CS1006B
Col1α 2CreERT2 마우스중국과학원(Chinese Academy of Sciences) 상하이 생물과학연구소(Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences)의 빈 저우(Bin Zhou)가 준 선물.
Dexmedetomidine hydrochlorideOrionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTABeyotime BiotechanologyST069
임베딩 탱크Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd80106-1100-16
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
ImageJ 소프트웨어NIH, Bethesda, MD, USA
DAPI Beyotime BiotechanologyP0131이 있는 장착 매체
Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.HK105
파라핀상곤 생명공학 주식회사
유전형 분석을Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease KSigma-Aldrich539480
자가 경화 수복 수지3M ESPE, St. Paul, MN, USA712-035-035
Stat3fl/fl miceGemPharmatech Co., LtdD000527
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TRAP 염색 키트시그마-알드리치387A
트리스-HClBeyotime BiotechanologyST780
범용 조직 고정제우한 서비스바이오 테크놀로지 Co., Ltd.G1105
크실렌시노팜 화학 시약 Co., Ltd.
ZoletilVIRBAC 
100092183마우스 해부 플랫폼 위한 A601889 프라이머 10023418

참고문헌

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M.

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