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방법 논문

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

1.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65618

⸱

2023년 10월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

이 논문에서

요약

여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

여기서는 변연 틈새 세포(LNC)의 분리 및 식별을 위한 표준 절차를 보고합니다. 안구 은행에서 얻은 림버스 조직을 LNC 분리에 사용했습니다. 조직을 무균 조건에서 12개의 조각으로 나누고, LNC 및 변연 상피 전구 세포가 있는 세포 클러스터를 얻기 위해 콜라겐분해효소 A를 사용하여 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 18시간 동안 절단했습니다. 세포 클러스터를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 37°C에서 15분 동안 추가로 절단하여 단일 세포를 얻은 후 5% Matrigel로 코팅된 플라스틱 표면에 변형된 배아 줄기 세포 배지(MESCM)에서 배양했습니다. 세포는 70% 합류 시 통과되었으며 면역형광, 실시간 정량 PCR(qPCR) 및 유세포 분석을 사용하여 LNC를 식별했습니다. 1차 LNC는 12회 이상 격리 및 통과되었습니다. P4에서 P6까지 LNC의 확산 활동이 가장 높았습니다. LNC는 BMMSC보다 더 높은 줄기세포 마커를 발현했습니다(SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, PDGFRβ). 또한, P4 LNC는 VIM, CD90, CD105 및 PDGFRβ를 균일하게 발현하는 것으로 나타났지만, LNC 식별을 위한 마커로 사용할 수 있는 Pan-CK는 발현하지 않았습니다. 유세포 분석 결과, LNC의 약 95%, 97%, 92% 및 11%가 각각 CD73, CD90, CD105 및 SCF를 발현한 반면, BMMSC에서는 68%, 99%, 20% 및 3%였습니다. LNC 분리 및 식별을 위한 표준 공정은 LNC의 광범위한 사용을 위한 신뢰할 수 있는 실험실 기반을 제공할 수 있습니다.

서론

각막 감염 및 손상으로 인해 각막 상피 줄기세포 결핍증(LSCD)1이라고도 하는 각막 상피 줄기세포 결핍증(CESD)과 각막 상피 재생(CES)의 발생률이 점점 더 시급해지고 있습니다. CESD를 제대로 치료하지 않으면 각막 이식이 필요한 실명으로 이어질 수 있습니다. 그 결과, CES 재생이 더욱 중요해지고 있습니다. CES 기능에 필수적인 지원을 제공하는 LNC(limbal niche cell)라고 하는 지지 세포 그룹이 있습니다. Limbal stromal stem cell은 Polisetty et al.2에 의해 처음 분리되었고, Xie et al.3에 의해 limbus의 limbal epithelium subjacent 및 stroma에 국한된 LNC로 확인되었습니다. LNC는 각막 가장자리의 핵심 지원 줄기세포이며 골수 유래 MSC(BMMSC)의 기능을 가지고 있으며 각막 상피 세포 및 각막 기질 세포 등으로 발달하도록 유도될 수 있습니다.3,4,5,6,7. 이전 연구에 따르면 LNC의 줄기세포 품질은 이미 임상에서 널리 사용되고 있는 BMMSCs8보다 더 원시적입니다. LNC는 특히 CESD 치료에 MSC 다음으로 실행 가능한 옵션이 될 수도 있습니다. CES의 중요한 지원 세포인 LNC는 림버스의 "틈새" 구조에서 파생된 줄기 세포이기도 합니다. LNC는 성숙한 각막 상피 세포(MCEC)를 CES9에 대한 역분화에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 그러나 LNC에 대한 연구는 여전히 상대적으로 미흡하며, LNC의 용어, 분리, 정제, 식별 및 특성에 대한 합의가 이루어지지 않고 있다. 일부 연구자들은 LNC를 윤부 생검 유래 기질 줄기 세포(limbal mesenchymal stem cells)10, 윤부 중간엽 줄기 세포(limbal mesenchymal stem cells)11, 윤부 섬유아세포 줄기 세포(limbal fibroblast stem cells) 12, 그리고 윤부 중간엽 기질 세포(limbal mesenchymal stromal cells)13로 명명했다. LNC의 성장 특성이 상세히 기술되지 않았고, 유망한 과학 및 임상 응용이 가능하고, 향후 가장 중요한 임상 도구 중 하나가 될 수 있기 때문에 LNC의 분리, 정제, 식별 및 특성을 요약할 필요가 있습니다.

선행 연구14에 따르면, LNC는 주로 변연 상피(limbal epithelium subjacent)와 변연(limbus)의 기질(stroma)에 존재한다. 이 프로토콜에는 콜라겐분해효소 A를 사용하여 변연 조직을 처리하고, LEPC 및 LNC로 구성된 클러스터를 얻고, 0.25% 트립신-EDTA(TE)를 사용하여 단일 세포로 분해하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 LNC를 변형된 배아 줄기 세포 배지(MESCM)에서 선택적으로 배양하여 정제했습니다. 이 논문에 보고된 프로토콜은 간단하며 인간 LNC를 대량으로 얻는 데 높은 효율성을 가지고 있습니다.

LNC 연구에 관심이 있는 과학자들을 위해 LNC 분리, 배양, 동정에 대한 자세한 절차를 영상에 담았으며, 필요할 때 편리하게 반복할 수 있습니다.

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프로토콜

50세에서 60세 사이의 기증자로부터 림버스 조직을 Tongji Hospital(중국 우한)의 적십자 안구 은행에서 얻었습니다. 이 의정서는 통지 윤리위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.

1. 격리

  1. 중간 각막 보관 배지에서 연봉 조직을 얻고 매우 깨끗한 작업대에서 무균 조건에서 작업합니다.
  2. 멸균 수술용 원형 칼날을 사용하여 각막 주변의 홍채와 내피를 긁어내고 제거합니다.
  3. 각막과 공막의 양쪽에 1mm가 남은 수술용 칼날을 사용하여 변막 조직을 동일한 크기의 12개 조각으로 자릅니다.
  4. 연엽 조직을 3.5cm 배양 플레이트에 옮기고 콜라겐분해효소 A 1mL(DF-12 배지 2mg/mL)를 추가하여 모든 조직을 소화를 위해 담급니다.
  5. 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에 넣고 18시간 동안 윤부 조직을 소화합니다.
    알림: 후속 절차는 일반적으로 둘째 날에 수행됩니다.
  6. 5% 기저막 매트릭스(Matrigel)로 코팅된 6웰 배양 플레이트를 준비합니다.
    1. 우물 바닥에 5% 기저막 매트릭스(MESCM[표 1]에 용해됨)를 코팅합니다.
    2. 멸균 백에 200μL 및 1mL 팁, 15mL 원심 튜브 1개, 6웰 플레이트 1개를 준비합니다.
    3. 멸균 백(팁 및 원심 튜브 포함)과 새 6웰 플레이트를 -20°C 또는 -80°C 환경에서 20분 동안 놓습니다. 기저막 매트릭스를 4°C의 냉장고에서 해동합니다.
    4. -6°C 또는 -20°C 환경에서 예냉식 팁, 원심 튜브 및 80웰 플레이트를 꺼낸 후 매우 깨끗한 작업대에서 다음 작업을 수행합니다.
    5. 200μL 팁을 사용하여 50μL 5% 기저막 매트릭스를 1mL MESCM으로 옮기고 부드럽고 고르게 혼합합니다.
    6. 사전 냉각된 1mL 팁을 사용하여 5% 기저막 매트릭스(MESCM에 용해됨)를 6웰 배양 플레이트의 웰 1개로 옮깁니다.
    7. 6-웰 플레이트를 수평으로 부드럽게 흔들고 6-웰 배양 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에 약 1시간 동안 넣은 후 다음 단계를 수행합니다.
  7. 18시간 소화 후 콜라겐분해효소 A-소화된 변부 조직을 꺼내면 눈에 보이는 작은 덩어리와 소화되지 않은 공막 조직만 남게 됩니다.
    참고: 고배율 현미경은 조밀하게 채워진 많은 세포(LNC 포함)로 구성된 클러스터를 보여줍니다.
  8. 200μL 피펫 팁을 사용하여 실체현미경으로 소화되지 않은 공막 조직에서 클러스터를 분리합니다.
  9. 클러스터를 3.5cm 배양 플레이트로 옮기고 0.25% TE에 담근 다음 플레이트를 세포 인큐베이터에 15분 동안 둡니다.
  10. 10% 녹아웃 혈청이 포함된 1mL MESCM을 추가하여 세포 분해를 중지하고 1mL 피펫 팁을 사용하여 클러스터를 개별 세포에 재현탁시키기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
  11. 셀 현탁액을 15mL 원심 튜브로 옮기고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  12. 세포 침전을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거한 다음 1mL MESCM을 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.
  13. 1mL 피펫 팁을 사용하여 하단 셀 침전이 MESCM에 고르게 현탁될 때까지 피펫팅을 2-3회 위아래로 수행하고 세포 계수를 위해 20μL 세포 현탁액을 사용합니다.
  14. 세포 현탁액을 1mL 피펫 팁이 있는 5% 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트로 옮기고 MESCM의 부피를 2.5mL로 늘립니다.
  15. 6웰 플레이트를 수평으로 부드럽게 흔들어 셀이 고르게 분포되도록 합니다.
  16. 세포를 이미징하고 기록한 후 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 매일 세포를 관찰하고 사진을 찍고 3-4일마다 배지를 교체합니다.

2. LNC의 식별

  1. 면역형광 염색
    1. 37°C 세포 인큐베이터에서 5분 동안 1mL 0.25% TE를 사용하여 플레이트 바닥에서 LNC를 분해합니다.
    2. 1mL MESCM(녹아웃 혈청 포함)을 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
    3. 1mL MESCM을 추가하여 현탁 중인 세포를 재현탁시킵니다. 4개의 슬라이드(20μL/슬라이드)를 위한 80μL 셀 현탁액(슬라이드당 4 × 103 개의 셀)을 준비하고 원심분리 시스템을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 현미경 슬라이드에 세포를 증착합니다.
    4. 약 3 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 세포 (4 단계의 슬라이드에 부착)를 고정 한 다음 PBS에서 0.2 % Triton X-100으로 슬라이드의 세포를 15 분 동안 투과시킵니다.
    5. 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 세포를 차단한 후 1차 항체(Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100])로 4°C에서 밤새 배양합니다. 배양 후 PBST(PBS + 0.1% Tween 20)로 슬라이드를 세척(5분/세척, 3회)하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.
    6. 해당 2차 항체(당나귀 항 마우스 IgG 2차 항체 TRITC [1:1000], 당나귀 항 토끼 IgG FITC [1:500], 당나귀 항 마우스 IgG 488 [1:300], 당나귀 항 토끼 IgG 594 [1:400])를 적절한 IgG 비특이적 IgG 항체와 함께 1시간 동안 배양합니다. PBST(5분/세척, 3회)를 사용하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.
    7. 5 μg/mL DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole)로 핵을 대조염색하고 슬라이드를 밀봉합니다.
    8. 형광 현미경을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다(배율: 400x; 노출 시간: 50 ms).
  2. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)
    1. RNA Isolation Kit를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 전체 RNA를 추출합니다.
    2. 고용량 cDNA 전사 키트를 사용하여 총 RNA 1-2μg을 cDNA로 역전사합니다.
    3. cDNA(100ng), TaqMan 유전자 발현 분석 믹스(1μL), 범용 PCR 마스터 믹스(10μL) 및 ddH 2O(20μL)를 포함하는20μL용액에서 역전사(42°C, 2분, 50°C, 85분) 및 qPCR(95°C, 5분, 95°C, 10초, 40사이클)을 수행합니다.
    4. 비교 CT 기법(ΔΔCT)4,9을 사용하여 상대적인 유전자 발현을 검사합니다.

3. LNC의 특성화

  1. 세포 계수(혈구계)
    1. 37°C 세포 인큐베이터에서 5분 동안 0.25% TE를 사용하여 플레이트 바닥에서 LNC를 분해합니다.
    2. 1mL MESCM(녹아웃 혈청 포함)을 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
    3. 1mL MESCM을 추가하여 세포를 재현탁시킨 다음 0.5mL 원심분리 튜브에 10μL 세포 현탁액을 넣습니다. 동일한 부피의 0.4% 트리판 블루 염색 용액을 추가합니다.
    4. 혈구계의 계수 영역에 10μL 염색 세포 현탁액을 놓고 계수를 위해 커버슬립으로 덮습니다.
      참고: 5개의 중간 사각형 영역에 있는 셀 수는 "A"로 정의됩니다. 1mL의 세포 수는 5A × 104 × 2로 계산됩니다.
  2. 유세포 분석을 통한 LNC 및 BMMSC 마커 검사15
    1. 유세포 분석 15를 사용하여 LNC 및 BMMSC에서 SCF, CD73, CD90 및 CD105의 발현을 검출합니다(2-4 ×10 6 이벤트/샘플, 각 샘플에서 2,000개의 세포를 획득하여 총 550,000개의 세포를 동시에 게이트됨).
    2. 키트 지침에 따라 사전 표지된 항체(SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] 및 CD105 [1:50])를 사용하여 차단 완충액(PBS에서 3% BSA 및 0.05% Tween-20)에서 20-30°C에서 15분 동안 세포를 수집하고 염색합니다.
    3. 유세포 분석기를 사용하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 수행합니다. 본 연구에서는 FACS Diva 소프트웨어와 FlowJo 소프트웨어를 사용하였다. 각 샘플에 대해 10,000개의 이벤트를 기록하고 살아있는 세포를 게이트 및 분석합니다.

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결과

LNC의 성장
LNC는 상술한 바와 같이 각막 공막 테두리 조직의 콜라겐분해효소 A(2mg/mL) 분해 방법에 따라 성공적으로 분리하였다(그림 1). 이전에 보고된 연구3과 일치하게, 콜라겐분해효소 A 분해 후 애벌레와 같은 클러스터가 현미경으로 시각화되었습니다(그림 2). 방추 셀의 비율은 세포 통로에 따라 점차적으로 증가했습니다. 방추 모양의 세포는 코팅된 기저막 매트릭스3 없이 플라스틱에서 배양된 세포와 달리 코팅된 5% 기저막 매트릭스 플레이트에서 자랄 수 있습니다. P1에서 P12까지의 세포는 2일에서 7일 사이의 세포 배증 시간으로 균일한 증식 속도를 나타냈습니다(표 2). 이 연구에서 LNC는 13개의 통로와 34개의 더블링으로 배양되었습니다(

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토론

각막 투명도는 일반적으로 각막 기질에 작은 섬유(직경 25-30nm)의 규칙적인 배열과 분포에 의해 유지되며, 이는 정상 시력에 매우 중요하다16. 전 세계적으로 2억 5,300만 명의 시각 장애인이 있으며, 그 중 3,600만 명이 시각 장애인입니다17. 세계보건기구(WHO)는 각막 실명을 인간의 시력에 가장 심각한 위험 중 하나로 간주하며, 전 세계 실명의 5.1%를 차지합니다16. 정상적인 CES의 각막 상피 결손은 흉터를 남기지 않고 빠르게 치유될 수 있다18. 전 세계적으로 1,270만 명 이상의 환자가 중등도에서 중증의 시력 상실로 인해 각막 이식이 필요한 것으로 추정됩니다19; 각막 이식 실패의 30%는 CESD20에 의해 발생했습니다. 그러나 전 세계 대부분의 ...

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공개 사항

저자 중 누구도 관련 재무 공개를 하지 않습니다.

감사의 글

이 작업을 지도해 준 Wei Wang, Lingjuan Xu, Rong Liu, 일부 자료를 제공한 Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You, Li Guigang, 원고를 작성해 준 Guanyu Su, 원고를 수정해 준 Xiao Zhou, Yihong Xiong, Huatao Xie, 완전한 지도를 해준 Guigang Li에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82070936, 81470606, 81570819), 후베이 성 건강 및 가족 계획 과학 연구 프로젝트 (No. WJ2017M073), 퉁지병원 10대 중개의학 연구 프로젝트(No.2016ZHYX20), 우한시 젊은 의료 개척자 양성 프로젝트(No.2015whzqnyxggrc10), 글로벌 인재 모집 프로그램(G2022154028L), 2022년 후베이성 국가위생건강위원회 프로젝트(WJ2021ZH0005), 2022년 후베이성 재무부 주제 건설 재단(42000022815T000000102)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4', 6-디아미디노-2-페닐린돌ThermoFisherD13065μ g/mL
암포테리신 B시그마V9009191.25 & g/mL
Anti-CD73Abcamab2021221:50
소 혈청 알부민MERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-IG1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-IG1:100
CD90Abcamab3077361:50
세포 인큐베이터Shanghai LishenK1119K4644HF90(HT)
원심분리기 시스템StatSpin StatSpin CytoFuge
12-Collagenase ARoche101035780012 mg/mL
컨포칼 현미경Zeiss LSM700-
배양 플레이트350035635mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.0190%
당나귀 안티 마우스 IgG (H+L) 2차 항체ThermoFisherA160161:1000
당나귀 안티 토끼 IgG (H+L) 2차 항체ThermoFisher315681:1000
FACS Diva 소프트웨어BD BiosciencesTreeStar-Flow
CytometerBD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
형광 현미경olympuscx31 
겐타마이신시그마G191450 μ g/mL
혈구분석기MERCKZ359629Bright-Line
고용량 cDNA 전사 키트ThermoFisher4374966
반전 위상차 현미경  UOPDSZ2000X
ITS (인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨)SigmaI31465 μ g/mL 인슐린, 5 μ g/mL 트랜스페린, 5ng/mL 아셀렌산나트륨
KnockOut SR Esc/iPSC용 KnockOut SR 혈청 교체gibco10828-02810%
MatrigelBioCoat
356234-Pan-CKAbcamab77531:1000
파라포름알데히드NoninBioNBS01354.00%
파라포름알데히드MKBioMM-15054%
PDGFR&베타;AbclonalA14441:100
실시간 형광 정량 PCR 기기Applied BiosystemsStep One Plus-
재조합 인간 FGF-basicPeprotech100-18B4 ng/mL
권장 인간 백혈병 억제 인자(Lif)Peprotech300-0510 ng/mL
RNeasy Mini RNA 분리 키트Qiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
실체현미경ZEISSSteREO 디스커버리. V8
멸균 수술용 원형 블레이드Careforde29500크기 10
TaqMan 유전자 발현 분석 믹스적용 바이오시스템4448489
Triton X-100MERCKX1000.20%
Trypan blueThermoFisher152500610.40%
Trypsin-EDTAGenviewGP31080.25%
Tween 20MERCKP9416-Ultra
Clean BenchLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
유니버설 PCR 마스터 믹스응용 바이오시스템4304437
Vim Abcamab925471:100

참고문헌

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