인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템
Summary
여기서는 자동화된 세포 배양 시스템을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 자동 배양 시스템은 iPS 세포의 유지에서 다양한 유형의 세포로의 분화에 이르기까지 유도만능줄기세포(iPS) 세포 취급에 익숙하지 않은 연구자를 포함하여 노동력을 줄이고 사용자에게 이점을 제공합니다.
Abstract
무한 자가증식 능력을 가진 인간유도만능줄기세포(hiPSC)는 희귀질환 병리의 해명, 신약 개발, 손상된 장기의 복원을 목표로 하는 재생의학 등 다양한 분야에서 응용될 것으로 기대되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 hiPSC의 사회적 구현은 여전히 제한적입니다. 이는 부분적으로는 고급 지식과 정교한 기술로도 미세한 환경 변화에 대한 iPSC의 높은 민감성으로 인해 배양에서 분화를 재현하기 어렵기 때문입니다. 자동 배양 시스템을 적용하면 이 문제를 해결할 수 있습니다. 연구자의 기술과 무관하게 재현성이 높은 실험은 여러 기관에서 공유하는 절차에 따라 기대할 수 있습니다. iPSC 배양을 유지하고 분화를 유도할 수 있는 여러 자동 배양 시스템이 이전에 개발되었지만, 이러한 시스템은 인간화된 다중 관절 로봇 팔을 사용하기 때문에 무겁고 크며 비용이 많이 듭니다. 위의 문제를 개선하기 위해 간단한 x-y-z 축 슬라이드 레일 시스템을 사용하여 더 작고 가벼우며 저렴하게 사용할 수 있는 새로운 시스템을 개발했습니다. 또한 사용자는 새로운 시스템에서 매개변수를 쉽게 수정하여 새로운 처리 작업을 개발할 수 있습니다. 작업이 설정되면 사용자는 iPSC를 준비하고, 원하는 작업에 필요한 시약 및 소모품을 미리 공급하고, 작업 번호를 선택하고, 시간을 지정하기만 하면 됩니다. 이 시스템은 공급세포가 없는 여러 통로를 통해 iPSC를 미분화 상태로 유지하고 심근세포, 간세포, 신경 전구세포, 각질형성 세포 등 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있음을 확인했습니다. 이 시스템은 숙련된 연구원 없이도 기관 전반에 걸쳐 재현성이 높은 실험을 가능하게 할 것이며, 새로운 진입에 대한 장애물을 줄임으로써 더 넓은 범위의 연구 분야에서 hiPSC의 사회적 구현을 촉진할 것입니다.
Introduction
본 논문은 당사가 기업과 공동으로 제작한 인체유도만능줄기세포(iPSC)의 자동배양 시스템에 대한 실제적이고 상세한 취급 절차를 제공하고 대표적인 결과를 제시하고자 합니다.
2007년 논문이 발표된 이래 iPSC는 전 세계적으로 주목을 받고 있습니다1. 모든 종류의 체세포로 분화할 수 있는 가장 큰 특징으로 인해 재생의학, 난치성 질환의 원인 규명, 새로운 치료약 개발 등 다양한 분야에 적용될 것으로 기대된다 2,3. 또한 인간 iPSC 유래 체세포를 사용하면 상당한 윤리적 제한이 적용되는 동물 실험을 줄일 수 있습니다. iPSC를 이용한 새로운 분석법을 연구하기 위해서는 수많은 동종 iPSC가 지속적으로 필요하지만 이를 관리하는 것은 너무 힘들다. 더욱이 iPSC는 미묘한 문화적, 환경적 변화에도 민감하게 반응하기 때문에 취급이 어렵습니다.
이 문제를 해결하기 위해 자동화된 배양 시스템은 인간 대신 작업을 수행해야 합니다. 일부 그룹은 세포 유지 및 분화를 위해 몇 가지 자동화된 인간 만능 줄기 세포 배양 시스템을 개발했으며 그 성과를 발표했습니다 4,5,6. 이 시스템에는 다중 관절 로봇 팔이 장착되어 있습니다. 로봇 팔은 인간의 팔 움직임을 매우 모방한다는 점에서 장점이 있을 뿐만 아니라 팔에 더 높은 비용, 더 크고 무거운 시스템 패키징, 목표 동작을 얻기 위해 엔지니어의 시간 소모적인 교육 노력이 필요하다는 단점도 있습니다 7,8. 경제적, 공간적, 인적 자원 소비 측면에서 더 많은 연구 시설에 장치를 더 쉽게 도입할 수 있도록 iPSC를 다양한 세포 유형으로 유지 및 분화하기 위한 새로운 자동 배양 시스템을 개발했습니다9.
새로운 시스템에 대한 우리의 이론적 근거는 다관절 로봇 팔9 대신 X-Y-Z 축 레일 시스템을 채택하는 것이었습니다. 로봇 팔의 복잡한 손과 같은 기능을 대체하기 위해 우리는 이 시스템에 새로운 아이디어를 적용하여 세 가지 유형의 특정 기능 팔 팁을 자동으로 변경할 수 있습니다. 여기에서는 프로세스 전반에 걸쳐 엔지니어의 기여에 대한 요구 사항이 없기 때문에 사용자가 소프트웨어에서 간단한 주문으로 작업 일정을 쉽게 만들 수 있는 방법도 나타냅니다.
로봇 배양 시스템 중 하나는 분화를 위한 3D 세포 응집체로 96웰 플레이트를 사용하여 배아체를 만드는 것을 시연했습니다4. 여기에 보고된 시스템은 96웰 플레이트를 처리할 수 없습니다. 하나는 인간 만능 줄기 세포가 아니었지만 세포주를 사용하여 현재의 우수 제조 관리 기준(cGMP) 등급을 달성했습니다5. 여기에 자세히 설명된 자동 배양 시스템은 이제 실험실 실험을 돕기 위한 특정 목적으로 개발되었습니다(그림 1). 그러나 레벨 IV 안전 캐비닛과 동등한 수준의 청결을 유지하기에 충분한 시스템을 갖추고 있습니다.
Protocol
간사이 의과대학 윤리위원회는 KMUR001(승인 번호 2020197)라는 건강한 지원자 유래 iPSC의 생성 및 사용을 승인했습니다. 공개적으로 모집된 기증자는 정보에 입각한 공식 동의서를 제공하고 세포의 과학적 사용에 동의했습니다.
참고: 현재 인터페이스(Windows XP 운영 체제에서 실행되는 “ccssHMI”라는 특수 소프트웨어)는 기본 작동 화면입니다. 앞서 언급한 인터페이스 아래에 일련의 탭이 배열되어 사용자가 다양한 작업을 시작할 수 있습니다.
1. 로딩 작업
- 소프트웨어의 상단 화면에서 로딩 버튼을 클릭합니다. 로딩 준비 시작(Loading Preparation Start) 버튼을 클릭합니다.
- 장치에 들어갈 접시 또는 접시를 장치의 위치에 놓습니다.
알림: 접시 식별에 필요한 정보는 각 뚜껑에 기록되어야 합니다. - 전면 슬라이딩 창을 수동으로 닫고 기계적 안전 확인 버튼을 누릅니다.
- 소프트웨어에서 접시 또는 접시의 종류와 수량을 선택합니다.
- Loading Preparation Completed 버튼을 클릭합니다. 로딩 시작 버튼을 클릭합니다.
- 접시가 시스템에 업로드된 후 소프트웨어에서 iPS 셀이 있거나 없는 경우와 같이 접시에 대한 정보를 선택합니다. 소프트웨어에서 각 요리에 대한 메모를 등록하십시오.
- 마지막에 등록 버튼을 클릭하여 로딩 작업을 완료합니다.
2. 언로딩 작업
- 소프트웨어의 상단 화면에서 언로드 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어에서 제거할 접시를 선택합니다.
- 접시를 선택한 후 하역 준비 시작 버튼을 클릭합니다. 언로드 시작 버튼을 클릭합니다.
- 접시를 인큐베이터에서 시스템의 작업대로 옮긴 후 접시 제거 버튼을 누릅니다.
- 전면 슬라이딩 창을 수동으로 열고 접시를 꺼냅니다. 전면 슬라이딩 창을 수동으로 닫고 기계적 안전 확인 버튼을 누릅니다.
3. 소모품 보충: 피펫, 튜브 및 배지
- 피펫, 튜브 및 배지와 같은 소모품을 보충하려면 소프트웨어 상단 화면에서 소모품 버튼을 클릭한 다음 보충할 항목을 선택합니다.
- 피 펫
- 파이펫 버튼을 클릭합니다. 보충 단추를 선택합니다.
- 사용자가 소프트웨어에서 보충할 랙을 선택합니다. 보충 시작 버튼을 클릭합니다.
- 작업대의 피펫 보관 영역 뚜껑이 열려 있는지 확인한 후 전면 슬라이딩 창을 수동으로 열고 필요에 따라 피펫을 보충합니다.
- 전면 슬라이딩 창을 수동으로 닫고 기계적 안전 확인 버튼을 누릅니다. 보충 완료(Replenish Completed ) 버튼을 클릭합니다.
- 보충 설정(Replenishment Setup) 버튼을 클릭하고 재고 보충에 대한 정보를 입력한 다음 등록(Registration) 버튼을 클릭합니다.
- 보충 완료(Replenish Completed) 버튼을 클릭합니다.
- 튜브
- 튜브 버튼을 클릭합니다. 보충 단추를 선택합니다.
- 사용자가 소프트웨어에서 보충할 랙을 선택합니다. 보충 시작 버튼을 클릭합니다.
- 랙이 맨 위로 이동한 것을 확인한 후 튜브 보충 버튼을 클릭합니다.
- 전면 슬라이딩 창을 수동으로 열고 필요에 따라 튜브를 보충합니다.
- 전면 슬라이딩 창을 수동으로 닫고 기계적 안전 확인 버튼을 누릅니다.
- 보충 완료(Replenish Completed) 버튼을 클릭합니다.
- 보충 설정(Replenishment Setup) 버튼을 클릭하고 재고 보충에 대한 정보를 입력한 다음 등록(Registration) 버튼을 클릭합니다. 닫기 버튼을 클릭합니다.
- 보통
- 중간 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어에서 보충 버튼을 선택합니다.
- 3개의 랙 중 사용자가 보충할 랙 1개를 선택합니다. 보충 시작 버튼을 클릭합니다.
- 매체 보관 구역의 뚜껑이 열렸는지 확인한 후 전면 슬라이딩 창을 수동으로 열고 매체를 보충하십시오.
- 전면 슬라이딩 창을 수동으로 닫고 기계적 안전 확인 버튼을 누릅니다.
- 보충 완료(Replenish Completed) 버튼을 클릭합니다.
- 보충 버튼을 클릭하고 매체의 이름과 양을 포함하여 매체에 대한 정보를 입력합니다. 필요한 경우 추가 설명을 입력합니다.
- Registration( 등록 ) 버튼을 클릭합니다.
- 닫기 버튼을 클릭합니다.
- 피 펫
4. 작업 선택
- 소프트웨어의 상단 화면에서 작업 버튼을 클릭합니다.
- 작업 설정 버튼을 선택합니다. 작업 목록에서 원하는 작업을 선택하고 다음 단계 버튼을 클릭합니다.
- 작업을 수행할 날짜와 시간을 지정하고 등록(Registration ) 버튼을 클릭합니다. 작업을 수행할 접시 또는 접시를 선택한 다음 등록 버튼을 클릭합니다.
- 선택한 작업을 다시 확인한 후 등록 버튼을 클릭합니다. 다음 화면에서 작업이 등록되었는지 확인합니다.
- 필요한 경우 동일한 방법으로 다음 작업을 설정합니다.
- 마지막에 시작 버튼을 클릭합니다. 그러면 지정된 날짜와 시간에 작업이 자동으로 시작됩니다.
알림: 모든 작업이 끝나면 즉시 UV 조명(후드 양쪽에 위치)이 자동으로 켜지고 5-30분 후 보조 설정에 따라 후드를 무균 상태로 유지하기 위해 꺼집니다. 중지하려면 사용자가 시작 단추를 클릭할 수 있습니다. - 사용자가 예약된 작업을 미리 취소하려면 중지 버튼을 클릭합니다.
- 중단할 작업을 선택한 후 작업 편집 버튼을 클릭합니다.
- 작업 취소(Task Cancel) 버튼을 클릭합니다. 다음 화면에서 작업이 삭제되었는지 확인합니다.
5. 셀 사진 확인
- 모든 작업에는 작업 전후의 현미경 관찰(사진 촬영)이 포함됩니다. 각 작업 전후에 현미경 사진 촬영 작업을 통합하여 사진으로 세포 배양의 진행 상황을 관찰합니다.
- 시간 경과에 따라 동일한 위치를 모니터링하기 위해 고정 소수점 관찰을 위해 접시 또는 웰 플레이트의 여러 특정 위치를 미리 선택하는 것을 포함하여 사전 설정된 작업 프로그램을 선택합니다.
6. 통과와 분화
- 섹션 1-5의 단계에 따라 수동 및 분화를 수행하도록 자동 세포 배양 시스템을 설정합니다. passaging, cardiomyocyte differentiation, hepatocyte differentiation, neural precursor cell differentiation, and keratinocyte differentiation에 대한 기기 설정은 각각 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5에 나타내었다.
Representative Results
Discussion
프로토콜의 중요한 단계는 사용자가 오류를 발견하면 언제든지 취소, 중지 또는 재설정 버튼을 클릭하고 첫 번째 단계부터 다시 시작하는 것입니다. 이 소프트웨어는 이중 예약, 시스템 작업이 활성화된 동안 문 열기, 보충 부족 등 사람의 실수를 방지할 수 있습니다. 원하는 체세포에 대한 성공적이고 효율적인 분화를 위한 또 다른 임계점은 만능 줄기세포주의 적절한 선택인데, 그 이유는 각각의 만능줄기세포가 그 분화 특성에서 통제할 수 없는 편향을 갖기 때문이다14,15.
유도만능줄기세포를 위한 이 자동 배양 시스템은 줄기세포를 유지하고 다양한 체세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 이 시스템의 크기는 200cm(너비), 110cm(깊이), 233cm(높이)이며 총 무게는 1.2톤입니다. 장치에 내장된 인큐베이터는 36개의 10cm 접시와 9개의 멀티웰 플레이트를 동시에 수용할 수 있습니다.
이전 모델에 비해 개선된 점은 첫째, 핸들링 암으로서 X-Y-Z축 레일 시스템이 6축 다관절 암에서 새롭게 변환되었으며, 암의 팁 도구를 접시, 튜브 및 피펫을 위한 세 가지 다른 부품으로 변경하여 작동합니다. 암은 시스템의 천장에 매달려 있으며 X-Y-Z 축을 따라 이동합니다. 둘째, 피더가 없는 유지 배양 및 통로에서 지속적으로 수행되는 분화 유도 프로토콜을 위해 세포 계수 시스템이 도입되었습니다. 단세포 현탁액을 트리판 블루 용액과 혼합한 후, 현미경 관찰 및 이미징을 위해 일회용 혈구계로 옮겼습니다. 소프트웨어는 획득한 이미지를 자동으로 분석하여 살아있는 세포의 수를 계산하고 필요한 수의 세포를 시드하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 이 이미지 분석으로 얻은 세포 수의 정확도는 수동으로 얻은 정확도와 일치했습니다.
X-Y-Z-축 레일 시스템은 이전 버전(다축 다관절 암)보다 각 작업을 더 빠르게 처리하기 위해 적용되었습니다. 이 자동 배양 시스템을 사용하여 16일 동안 5회 연속 절대를 수행했으며 iPSC는 625배± 93배 확장되었습니다. 공급세포가 없는 세포유지시간에 대한 내구성 증명은 공급세포를 사용한 이전 시연보다 짧았지만, 세포 증식은 이전 시연에 비해 더 효율적이었다6. 작업 시간 단축은 작업 중 건조로 인한 세포 손상을 방지하는 데 기여하는 것으로 보입니다.
또한, 유지 배양에서 심근세포, 간세포, 신경 전구세포, 각질 세포로의 분화에 이르는 분화 작업은 사람의 개입 없이 수행되었습니다. 이러한 일련의 과정을 거친 후, 형광 면역염색을 통해 자동 배양 시스템에서만 얻은 세포가 원하는 세포로 분화되었음을 확인할 수 있었습니다. 따라서 과제 프로그램을 공유하고 이 시스템을 활용함으로써 iPS 세포 관리에 익숙하지 않은 연구자들도 자신의 연구에 필요한 iPSC 유래 체세포를 얻을 수 있습니다. 또한 연구자나 시설 간의 재현성 차이를 최대한 없앨 수 있으며, 매번 균일한 품질의 세포를 얻을 수 있습니다.
새로운 철도 시스템을 채택함으로써 장비의 크기를 줄이고 무게를 이전보다 ~200kg 가벼운 1.2톤으로 줄일 수 있었습니다. 또한 부품 및 프로그램 설정 비용을 약 $10,000 미화 절감할 수 있습니다. 유지 보수 및 프로그래밍 비용은 13% 감소할 것으로 추정됩니다. 더 많은 연구자들이 iPS 세포 관련 연구에 쉽게 진입할 수 있도록 동기를 부여하기 위해서는 장비 비용을 낮게 유지하는 것도 중요하다6. 우리는 현재 및 차세대 자동 배양 시스템이 보다 균일한 품질의 iPSC 및 iPSC 유래 분화 세포를 제공하는 데 기여할 수 있기를 바랍니다.
이 시스템의 주요 한계는 배양액의 임시 보관을 위한 냉장고의 제한된 용량과 소량(<100μL)의 액체를 처리하는 데 약점이 있다는 것입니다. 또한 정교한 인공 지능이 없기 때문에 정시 셀 상태에 따른 자동 최적화가 비활성화됩니다. 사소한 제한 사항은 시스템 제조업체에서 제공하는 특수 피펫 팁의 요구 사항입니다 4,5. 우리는 배지 제제를 위해 소량의 액체를 처리할 수 있는 차세대 배양 시스템을 개발하고 있으며 고성능 인공 지능(시스템 학습)을 기반으로 한 피드백 최적화 시스템을 포함합니다. 우리의 협력 제조업체9는 사용자의 특별한 요구에 따라 맞춤형 시스템을 구축할 수 있는 충분한 노하우를 보유하고 있습니다. 이 외에도 보다 일반적이고 광범위한 기능을 갖춘 차세대 시스템이 곧 출시될 예정입니다. 또한 모든 사용자에게 최신 시스템을 공급하기 위해 구독 기반 렌탈 시스템도 검토하고 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
| β <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="margin: auto;"/> Tublin mouse | Promega | G712A |
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