만성 저산소증 유발 인지 기능 장애의 마우스 모델에서 침술 치료

전 세계 인구는 현재 심각한 노화 문제에 직면해 있으며, 이로 인해 인지 장애의 유병률이 급격히 증가하고 있습니다. 전 세계적으로 인지 장애의 발생률은 1,000인년당 약 53.97명입니다¹. 혈관 기능 장애 또는 순환기/호흡기 장애로 인한 만성 뇌 저산소증은 노화 관련 치매의 주요 위험 요인 중 하나이다². 이전 연구에서는 대뇌 저산소증이 BACE1 발현을 수정하여 아밀로이드 β 침착을 증가시킬 수 있음을 입증했습니다³. 또한 저산소증은 신경교세포 조절 장애 및 신경염증과 관련이 있습니다 ^4,5. 이 문제의 규모가 커지고 있음에도 불구하고 만성 저산소증으로 인한 인지 기능 저하를 예방하기 위한 효과적인 서양 의학은 현재 부족합니다. 비약리학적 한의학, 특히 침술은 인지 장애를 치료하기 위해 수천 년 동안 사용되어 왔으며 신경퇴행성 질환을 완화하는 데 유망한 결과를 보여주었습니다 ^6,7. Baihui, Shenting 및 Zusanli 경혈은 인지 기능 장애 치료에 효과적인 포인트입니다 ^8,9. 임상연구에 따르면 전기침술치료는 혈관인지장애 환자의 몬트리올 인지평가(Montreal Cognitive Assessment, MoCA)와 간이 정신상태검사(Mini-Mental State Examination, MMSE) 점수를 유의하게 향상시키고 인지기능 장애를 효과적으로 개선하는 것으로 나타났다⁸. 침술이 동맥 결찰술을 가진 쥐의 기억력을 크게 향상시킬 수 있다는 연구 결과가 있지만(급성 대뇌 저산소증 모델¹⁰), 급성 대뇌 저산소증 모델, 만성 저산소증 유발 인지 장애가 있는 설치류 모델에서 침술의 효과에 대한 보고는 없습니다. 메커니즘에 대한 연구의 부족은 임상 적용을 상당히 방해했습니다.

이전 연구에서는 쥐를 8주 동안 저산소 환경에 노출시키면 뇌의 산화 스트레스와 염증 수치가 크게 증가하여 기억 기능이 저하될 수 있음을 입증했다¹¹. 본 연구는 우리의 이해를 넓히기 위해 침술이 설치류 모델에 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로 합니다. 그러나 반복적인 자극 동안 동요의 가능성 때문에 설치류의 침술 치료 중에 일반적으로 마취가 필요하다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 대부분의 마취제는 신경 활동을 억제하고 정보 처리를 방해하여 행동 장애를 유발할 수 있기 때문에 장기간의 마취는 생쥐의 인지 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다¹². 여러 연구에 따르면 2.5% 세보플루란을 6시간 동안 투여하면 생쥐의 공간 기억력, 학습 능력 및 주의력이 현저히 손상될 수 있다¹³. 더욱이, 증거는 고용량의 마취가 마우스에서 신경 세포 사멸 또는 신경 손상을 초래할 수 있음을 시사한다¹⁴. 따라서 사용되는 전체 마취량을 최소화하기 위해 적절한 접근 방식을 식별하는 것이 필수적입니다. 이 연구에서는 인지 장애가 있는 쥐를 치료하기 위한 효과적인 침술 방법과 기억력을 평가하기 위한 행동 테스트를 소개합니다. 중요한 것은 실험 중에 투여되는 마취의 총 투여량을 효과적으로 줄일 수 있는 수정된 치료 전 마취 기술을 제시한다는 것입니다.

동물 실험은 허베이 이링 의학 연구소 동물 연구 및 윤리 위원회(승인 번호: N2022148)의 승인을 받아 수행되었습니다. 18-22g 무게의 수컷 C57BL/6J 마우스( 재료 표 참조)를 허베이 이링 의학 연구소의 신약 평가 센터에 수용했습니다. 그들은 정상적인 음식과 깨끗한 물을 제공받았고 매일 12시간 동안 인공 조명에 노출되었습니다. 실내는 20-26 °C의 온도 범위와 40%-70%의 상대 습도를 유지했습니다.

1. 만성 저산소증 마우스 모델 구축(그림 1)

1. 실험을 시작하기 전에 정상 대기압의 동물 케이지와 지속적인 저산소 환경의 케이지를 준비하십시오. 자동 가스 제어 전달 시스템을 활용하여 순수한 산소와 질소의 혼합물로 챔버를 세척함으로써 지속적인 저산소 환경을 구축합니다.
   알림: 이 시스템은 전자기 밸브 스위치를 제어하도록 프로그래밍되어 시간과 농도 측면에서 가스의 정확한 전달을 보장합니다.
2. 생쥐를 무작위로 대조군(Con), 모델군(CH), 전기침술군(EA + CH)의 세 그룹으로 나눕니다. 대조군과 모델/전기 침술 마우스를 두 개의 케이지에 별도로 배치하고 케이지당 10마리의 마우스를 배치합니다. 조명 주기를 12시간/12시간(밝음/어두움)으로 유지합니다.
   알림: 대조군에서 치료 또는 저산소증이 유도되지 않습니다(Con). 모델 그룹(CH)은 만성 저산소증이 있는 마우스로 구성됩니다. 전기 침술 그룹(EA + CH)은 전기 침술로 치료된 저산소증 유발 마우스로 구성됩니다.
3. 만성 저산소증이 발생하려면 디지털 산소 측정기를 사용하여 가스 유량을 조절하고 산소 농도를 10%로 유지하여 저산소 챔버의 매개변수를 설정합니다. 오전 9:00에 동물을 저산소 챔버에 넣고 오후 5:00에 제거하면 3개월 동안 하루에 총 8시간 동안 저산소에 중단 없이 노출됩니다.
   알림: 산소 농도를 낮추기 위해 질소 가스 공급을 설정할 때 질소 가스가 한 번에 과도하게 유입되면 동물 사망으로 이어질 수 있으므로 천천히 진행하는 것이 좋습니다.
4. 조직학 검사 및 행동 검사(개방 필드 테스트¹⁵ 및 물 미로 테스트¹⁶)를 사용하여 만성 저산소증 유발 인지 기능 장애 모델을 평가합니다.

2. 마취(그림 2)

1. 작은 동물 마취 기계( 재료 표 참조)와 항온 가열 패드를 준비합니다.
   알림: 마취 중에 동물은 저체온증에 걸리기 쉬우므로 단열을 위해 항온 가열 패드를 사용해야 할 필요성이 강조됩니다.
2. 마우스를 마취 유도 상자에 넣고 약 1분 동안 산소에 2%-2.5% 이소플루란으로 빠르게 유도합니다( 재료 표 참조).
   참고: 이 단기 전처리는 마우스가 저농도 용량에서 장기간 번성할 수 있도록 하는 중요한 단계입니다.
3. 흥분성이 줄어들면 쥐의 발가락을 꼬집어 반사 신경을 확인합니다. 그런 다음 마우스를 항온 가열 패드(37°C)에 옮깁니다.
4. 마취 유량을 약 0.5% 농도로 조정합니다. 마취기를 마우스의 입과 코에 연결합니다. 마취를 유지하면서 전기 침 치료를 진행합니다.
   참고: 마취 효과는 마우스가 깜박임을 멈췄을 때 확인되었습니다. 마취 효과는 최소 30분 동안 지속될 수 있습니다.

3. 전기 침술 치료

1. 인지 기능 장애를 효과적으로 개선하기 위해서는 한의학 이론과 임상 경험을 바탕으로 백후이(GV20), 셴팅(GV24), 양측 주산리(ST36)와 같은 특정 경혈을 선택해야 합니다(그림 3). 모델링 과정이 완료되기 2주 전에 전기 침술 치료를 시행합니다.
   1. GV20 경혈은 이마 정중선, 귀 끝을 연결하는 선의 중간 지점에 위치합니다⁷. 침 삽입 깊이는 2mm여야 합니다.
   2. GV24 경혈은 이마 1.3의 정중선에서 마우스 눈의 중간 지점 바로 위^17mm에 위치합니다. 침 삽입 깊이는 2mm여야 합니다.
   3. ST36 경혈은 비골 머리 아래 약 2mm 무릎 관절 바깥쪽에 있습니다^18,19. 침 삽입 깊이는 3-4mm여야 합니다.
2. 절차를 위해 일회용 침술 바늘( 재료 표 참조)과 전기 침술 장치( 재료 표 참조)를 준비합니다(그림 4).
3. 0.5% 이소플루란으로 약한 마취 하에 쥐를 엎드린 자세로 놓고 머리와 팔다리가 움직이지 않도록 합니다. 엄지, 검지, 중지를 사용하여 오른손으로 스테인리스 바늘(직경: 0.18mm, 길이: 7mm)을 잡습니다.
4. GV20 및 GV24 경혈을 가로로 2mm 깊이로 침을 치료하고 왼손으로 쥐 머리의 피부를 들어 올립니다. 마우스 무릎 관절 측면의 비골두를 만지고 왼쪽 엄지손가락으로 피부를 눌러 ST36 경혈을 3-4mm 깊이로 수직으로 찔렀습니다.
   참고: 머리에 있는 경혈은 GV24와 GV20의 순서로 바늘을 삽입하는 것이 좋습니다. 이 주문은 운영 편의성을 촉진합니다. 경혈은 고정점이 아닌 별개의 해부학적 위치입니다. 결과적으로, 바늘 삽입 각도의 약간의 편차는 치료 효과에 영향을 미치지 않으며, 임상 환경에서 전기 침술 치료를 받는 환자에서도 유사하게 볼 수 있습니다.
5. GV20과 왼쪽 ST36을 한 전극 세트에 연결하고 GV24와 오른쪽 ST36을 다른 전극 세트에 연결하여 전자 침술 장치를 바늘에 연결합니다(그림 4). 전류 강도가 2mA이고 주파수가 2Hz^20,21인 연속파 모드를 선택합니다. 경혈에서 국부적인 경미한 떨림과 마우스의 조용한 내성을 관찰하여 이상적인 치료를 확인하십시오.
   1. 전기 침술을 연결할 때 바늘의 근위 끝을 연결하십시오. 이는 연결 라인의 무게로 인한 충격을 최소화하고 결과적으로 바늘 분리 방지를 개선하는 데 도움이 됩니다. 필요한 경우 접착 테이프를 사용하여 수평으로 삽입된 바늘과 연결 라인을 고정합니다.
6. 연속 6일 동안 매일 30분 동안 매일 치료를 시행하고 각 치료 주기 사이에 하루의 휴식을 취합니다.

4. 오픈 필드 테스트(그림 5)

참고: 오픈 필드 테스트는 새롭고 낯선 환경에서 실험 동물의 자율적 행동, 탐색적 행동, 인지 능력 및 불안 행동을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다²². 오픈 필드 반응 상자와 기록 장치로 구성됩니다.

1. 테스트를 수행하려면 50cm × 50cm × 30cm 크기의 흰색 벽 큐브를 준비하고 바닥은 10cm × 10cm 크기의 25개의 동일한 정사각형으로 나뉩니다.
2. 적응을 위해 마우스를 오픈 필드 반응 상자에 넣습니다. 적응 기간 동안 마우스가 시험실을 탐색하고 새로운 환경에 익숙해지도록 합니다. 마우스를 실험 환경에 1시간 동안 적응시킨 후 오픈 필드 테스트를 수행합니다.
   알림: 이는 환경 변화로 인한 불안이나 스트레스를 최소화하여 후속 행동 평가 중에 보다 정확한 결과를 가능하게 합니다.
3. 마우스를 상자 중앙에 놓고 마우스가 10분 동안 환경에 적응하도록 한 후 2분 동안 모니터링합니다.
   1. 비디오 추적 시스템( 재료 표 참조)을 사용하여 마우스의 이동 궤적, 총 이동 거리, 중앙 영역에서 보낸 시간, 중앙 영역을 가로지르는 속도 및 테스트 중 중앙 영역으로의 진입 횟수를 기록합니다.
   2. 비디오 추적 시스템의 제품 설명서에 설명된 대로 관련 작업을 수행합니다. 각 마우스는 단일 테스트를 거치고 상자 내의 동일한 위치에서 탐색을 시작합니다.
   3. 각 테스트 후에는 마우스를 사용할 때 냄새 간섭으로 인한 잘못된 결과를 방지하기 위해 75% 에탄올로 오픈 필드 상자를 청소하십시오.

5. 물 미로(그림 5)

참고: 물 미로 테스트는 공간 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 쥐를 대상으로 한 실험에서 행동 평가 도구로 자주 사용됩니다²³.

1. 직경 120cm, 깊이 30cm의 원형 물탱크를 준비합니다. 탱크를 I, II, III 및 IV의 4 개의 동일한 사분면으로 나눕니다. 실험에서 검은 쥐를 사용하는 경우 흰색 물 탱크를 사용하십시오. 흰 쥐의 경우 검은 물 탱크를 사용하십시오.
2. 실험 중에 쥐가 연구원을 볼 수 없도록 원형 물 탱크 주위에 커튼을 놓습니다.
3. 물탱크의 상단 표면에 다른 마커를 배치하여 공간 방향에 대한 시각적 신호를 제공합니다. 일관성을 유지하기 위해 이러한 마커가 실험 내내 고정되어 있는지 확인하십시오.
4. 물탱크의 III사분면에 직경 10cm의 원형 플랫폼을 지정된 대상 영역으로 배치합니다. 플랫폼을 원하는 위치에 쉽게 이동하고 고정할 수 있는지 확인합니다.
5. 실험 내내 22-24°C의 온도 범위를 유지하면서 탱크에 물을 주입합니다.
   1. 수위가 목표 플랫폼보다 1cm 높게 일관되게 유지되도록 합니다. 물에 20% 농도의 무독성 이산화티타늄을 포함하여 검은색 마우스와 흰색 배경 사이의 뚜렷한 대비를 달성합니다. 이 대비는 카메라가 마우스의 움직임과 관련 매개변수를 쉽게 기록할 수 있도록 합니다.
6. 각 마우스를 사분면 I, II, III 및 IV에 순차적으로 배치하여 5일 연속 공간 탐색 테스트를 수행합니다.
   1. 마우스가 벽을 향하도록 놓습니다. 마우스가 실험자의 위치를 기준점으로 사용하지 못하도록 미로에서 멀리 이동합니다. 마우스가 플랫폼을 찾는 데 걸리는 시간을 기록합니다.
   2. 마우스가 90초 이내에 수중 플랫폼을 찾지 못하면 마우스를 플랫폼으로 안내하고 30초의 학습 시간을 제공합니다. 또한 대기 시간을 90초로 기록합니다.
   3. 마우스가 90초 이내에 수중 플랫폼을 찾으면 물 탱크에서 제거하기 전에 학습을 위해 플랫폼에 10초 동안 그대로 두십시오.
   4. 수건으로 쥐를 말리고 케이지에 다시 넣습니다.
   5. 각 사분면에 있는 각 마우스의 위치를 20분마다 회전합니다. 비디오 추적 시스템( 재료 표 참조)을 사용하여 플랫폼을 찾는 데 걸린 각 마우스의 수영 거리, 속도 및 시간(대기 시간)을 기록하고 제품 설명서의 지시에 따라 관련 작업을 수행합니다.
   6. 1일차에 플랫폼을 수면 위로 1cm 높이에 설정합니다. 1-2일차에 수면 아래 5cm 깊이에 플랫폼을 놓습니다.
7. 6일차에 대상 사분면에서 플랫폼을 제거하고 공간 탐색 테스트를 수행합니다.
   1. 마우스를 사분면 I에 놓으면 90초 동안 자유롭게 탐색할 수 있습니다. 컴퓨터는 마우스의 수영 궤적, 목표 사분면에서 보낸 시간, 플랫폼을 가로지르는 횟수를 기록합니다.
      NOTE: 인적 요인으로 인한 실험 오류를 최소화하기 위해서는 수중 미로 실험에서 기준점의 위치를 고정하는 것이 중요합니다. 또한 실험자는 마우스를 물에 넣은 후 즉시 후퇴해야 합니다. 실험이 완료된 후 쥐를 수건으로 말리고 체온을 유지하기 위해 케이지에 다시 넣어야 합니다.

6. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색(그림 6)

참고: 해마 부위의 조직학적 검사는 저산소증 모델의 확립을 평가하고 침술 치료의 효능을 결정하는 데 도움이 됩니다.

1. 행동 실험 후 20mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 복강 내 주사로 마우스를 마취하고 10% 파라포름알데히드 용액( 재료 표 참조)을 관류하여 완전한 신체 관류를 보장합니다. 뇌 조직을 분리하고 10% 파라포름알데히드 용액에 실온(RT)에서 3일 동안 담가 고정합니다.
2. 뇌 샘플을 임베딩 상자에 넣습니다. 그런 다음 처리된 뇌 샘플을 흐르는 물로 6시간 동안 세척합니다.
3. 자동 조직 처리기를 사용하여 농도가 증가하는 일련의 알코올 용액, 즉 1시간 동안 60% 에탄올, 1시간 동안 70% 에탄올, 1시간 동안 90% 에탄올, 2시간 동안 95% 에탄올, 마지막으로 2시간 동안 100% 에탄올을 사용하여 샘플을 탈수합니다.
4. 투명도를 얻기 위해 조직 표본을 크실렌에 2시간 동안 담그십시오. 이어서, 탈수 과정이 완료된 후, 투과된 샘플을 3시간 동안 60°C로 가열된 파라핀 왁스로 옮긴다. 마지막으로 자동 프로세서에 포함합니다.
5. 회전식 슬라이서를 사용하여 4μm 절편을 얻습니다. 그 후, 3-8분 동안 헤마톡실린 염색을 한 다음 1-3분 동안 에오신 염색을 실시합니다.
6. 염색된 부분을 순차적으로 순수한 알코올과 크실렌의 분리된 용기로 옮깁니다. 그런 다음 광학 현미경으로 병리학적 검사를 준비하기 위해 염색된 부분을 중성 검으로 밀봉하고 고정합니다.
7. 슬라이드 스캐너( 재료 표 참조)를 사용하여 슬라이스를 스캔합니다. 그 후, 관찰 소프트웨어를 사용하여 해마 영역에 대한 HE 염색 결과를 얻습니다. 뉴런의 배열과 뉴런 핵의 응축을 비교합니다.

야외 실험에서 쥐의 운동 궤적 특성화
궤적 지도는 정상 그룹의 쥐가 낯선 환경에서 탐험하려는 깊은 성향을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 그들의 활동 궤적은 주로 구석에 집중되어 있으며 전체 열린 필드(왼쪽 패널)를 덮고 있습니다. 대조적으로, 장기간 저산소증 모델 그룹의 마우스는 새로운 환경을 탐험하려는 욕구가 현저히 감소했습니다. 그들은 주로 열린 들판의 중앙(중간 패널)을 향한 탐색 행동을 보이지 않고 구석에 머뭅니다. 침술 치료 후, 저산소증 유발 쥐의 탐색 활동이 개선되고, 열린 들판의 중앙을 향해 모험을 하는 행동이 복원되었습니다(오른쪽 패널)(그림 5A).

생쥐의 공간 학습과 기억의 특성화
정상 그룹에서 마우스는 목표 사분면에서 상대적으로 더 많은 시간을 보냈고 궤적 맵(왼쪽 패널)에 표시된 것처럼 플랫폼을 더 자주 교차했습니다. 마우스의 장기 저산소 모델 그룹은 지정된 시간 내에 대상 사분면을 찾을 수 없는 것으로 표시된 것과 같이 정상 그룹에 비해 약한 공간 기억 능력을 보여주었습니다(중간 패널). 침술 치료 후, 쥐는 저산소증으로 인한 공간 기억 능력이 크게 향상되었음을 보여주었습니다. 그들은 더 조직적인 탐색 행동을 보였고 목표 사분면(오른쪽 패널)에서 눈에 띄게 더 많은 시간을 보냈습니다(그림 5B).

쥐 뇌의 조직학적 검사
대조군에서는 생쥐의 해마 부위(왼쪽 위 패널)에서 뉴런의 배열이 규칙성을 보인 반면, 장기 저산소 모델 그룹(오른쪽 위 패널)에서는 방해를 받았습니다. 반대로, 치료군은 뉴런의 배열(하부 패널)이 개선되었습니다. 또한, 모델군은 대조군에 비해 생쥐 신경세포핵의 수축이 악화되었으나, 치료군에서는 이러한 효과가 부분적으로 완화되었다. (그림 6).

그림 1: 저산소증 유발 인지 장애에 대한 마우스 모델 설정. 마우스는 1일째부터 90일째까지 저산소증에 노출되었습니다. 전기 침 요법은 75일째부터 매일 시행되었으며, 각 치료 주기는 6일간, 총 2회 치료 주기로 진행되었습니다. 주기 사이에 1일의 휴식이 있었습니다. 행동 검사는 93일째에 실시되었습니다. 조직학적 검사 및 행동 검사는 해마 영역에서 모델의 확립을 확인하기 위해 65일째에 수행할 수 있습니다. 약어: 월: 월. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 전기 침술 전 마취 전처리. 전기 침술 치료를 받기 전에, 마우스는 (A) 마취 장치를 사용하여 마취시켰다. 이어서, 마우스를 챔버 내에 (C) 2% 이소플루란과 함께 (B) 챔버 박스에 넣었다. (D) 변형 마취 방법의 지속 시간은 고전적 마취 방법에 비해 짧았다. (E) 약한 마취를 받은 마우스는 발 자극에 대한 반응을 유지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 쥐 머리에 있는 경혈의 해부학적 구조. 이 그림은 생쥐에서 GV20(Baihui), GV24(Shenting) 및 ST36(Zusanli)의 해부학적 위치를 나타냅니다. (A) 전두골과 두정골을 보여주는 쥐 머리의 해부학적 모습. (B) 경골, 비골 및 비골 머리를 보여주는 쥐 다리의 해부학적 보기. (C) 쥐 머리의 경혈 위치. (D) GV20은 이마의 정중선, 귀 끝 사이의 중간 지점, 정수리 뼈 바로 위에 위치합니다. GV24는 전두골과 두정골의 접합부 바로 앞쪽인 이마 정중선에 위치합니다. ST36은 뒷다리의 바깥쪽, 비골두 아래 약 2mm에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 전기 침술 치료. 마우스는 마취 상태에서 GV20(Baihui), GV24(Shenting) 및 양측 ST36(Zusanli)의 특정 지점에서 바늘 자극을 받았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 전기 침술 치료 후 오픈 필드 테스트와 물 미로 테스트의 대표적인 결과. (A) 만성 저산소증(CH) 및 침술(EA) 치료를 받은 마우스의 행동 변화를 평가하기 위해 오픈 필드 테스트를 수행했습니다. 테스트에서 세 가지 대표적인 궤적 플롯이 생성되었습니다. (B) 물 미로 테스트는 만성 저산소증 및 침 치료를 받은 쥐의 공간 기억을 평가하기 위해 수행되었습니다. 테스트에서 세 가지 대표적인 궤적 플롯이 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 전기 침술 치료 후 쥐 뇌의 조직학적 검사. 대조군(왼쪽 위 패널), 저산소증 그룹(오른쪽 위 패널) 및 치료 그룹(아래 패널)에 있는 마우스의 조직학적 사진. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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