당사는 오가노이드 배양의 모든 단계를 포괄하는 간세포 암종(HCC) 오가노이드 형성에 대한 기존 프로토콜에 대한 포괄적인 개요와 개선을 제공합니다. 이 시스템은 잠재적인 치료 표적을 식별하고 약물 후보 물질의 효과를 평가하는 데 유용한 모델 역할을 합니다.
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방법 논문
잠재적 표적 식별 및 약물 발견을 위한 인간 간세포 암종 환자 유래 오가노이드 모델의 개발 및 최적화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
간세포 암종(HCC)은 전 세계적으로 매우 유병률이 높고 치명적인 종양이며, 늦은 발견과 효과적인 특이적 치료제의 부족으로 인해 발병 기전 및 치료에 대한 추가 연구가 필요합니다. 오가노이드는 천연 종양 조직과 매우 유사하며 체외에서 배양할 수 있는 새로운 모델로, 최근 몇 년 동안 간암에 대한 오가노이드 모델 개발에 대한 수많은 보고와 함께 상당한 관심을 받고 있습니다. 이 연구에서는 절차를 성공적으로 최적화하고 안정적인 패시에이징 및 배양 조건을 가진 더 큰 크기의 간세포암 오가노이드를 형성할 수 있는 배양 프로토콜을 확립했습니다. 간세포암 조직 해리, 오가노이드 도금, 배양, 패로징, 동결 보존 및 소생술의 전체 과정을 포괄하는 절차의 각 단계를 포괄적으로 설명했으며 이 논문에서 자세한 예방 조치를 제공했습니다. 이러한 오가노이드는 원래 간세포암 조직과 유전적 유사성을 나타내며 종양에 대한 잠재적 치료 표적 식별 및 후속 약물 개발을 포함한 다양한 응용 분야에 활용될 수 있습니다.
서론
간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 널리 퍼져 있고 매우 다양한 종양1으로, 의학계에서 상당한 주목을 받고 있다. 간세포암에서 계통 가소성과 상당한 이질성의 존재는 다양한 환자에서 유래한 종양 세포와 동일한 환자 내의 뚜렷한 병변이 서로 다른 분자 및 표현형 형질을 나타낼 수 있음을 시사하며, 따라서 혁신적인 치료 접근법의 발전에 만만치 않은 장애물을 제시할 수 있습니다 2,3,4,5 . 결과적으로, 보다 효과적인 치료 전략의 공식화에 정보를 제공하기 위해 간세포암에서 약물 내성의 생물학적 특성과 메커니즘에 대한 이해를 높일 필요가 있습니다.
최근 수십 년 동안 연구자들은 HCC 3,4를 연구하기 위한 목적으로 체외 모델 개발에 전념해 왔습니다. 일부 발전에도 불구하고 한계는 여전히 남아 있습니다. 이러한 모델에는 세포주, ....
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프로토콜
광저우 의과대학 부속 암 병원 및 연구소의 각 환자로부터 인간 생검 조직을 얻었고 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 수술 샘플에서 환자 유래 간세포암 오가노이드 확립
참고: 간세포암 오가노이드의 확립은 조직 해리, 오가노이드 도금, 배양, 패징, 동결 보존 및 소생과 같은 다양한 단계를 포함합니다. 조직 해리 과정에는 2시간의 시간이 필요하며 플레이트에 오가노이드를 파종하는 데는 약 40분이 걸립니다. 그 후, HCC 오가노이드의 초기 생성은 HCC 분리 배지를 사용하여 10-14일의 배양 기간을 거칩니다. 만족스러운 밀도에 도달하면 1시간이 필요한 오가노이드 통로가 전도됩니다. 그런 다음 오가노이드의 후속 배양은 7-10일 동안 HCC 확장 배지를 사용하여 유지되며, 이는 오가노이드의 성장 속도와 상태에 따라 달라질 수 있습니다.
- 조직 해리
- 소모품 및 재료 준비
- 수술 전에 국소 또는 전신 치료를 받은 적이 없는 환자로부터 1-2cm3의 간세포 조직을 수집합니다....
- 소모품 및 재료 준비
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결과
앞서 언급한 절차를 시행하면 일반적으로 3일 이내에 HCC 오가노이드 스페로이드의 출현을 관찰할 수 있습니다(그림 1). 그림 1A,B는 확립된 HCC 오가노이드를 보여주며, 확립 초기에 둥근 모서리와 투과성 세포질을 특징으로 하는 소형 스페로이드를 즉시 개발합니다. HCC 오가노이드가 성장하는 동안 다양한 농도의 BME를 사용하면 오가노이드의 성장 속도에 다른 영향을 미쳤습니다. 간세포암 확장 배지에서 12일 동안 BME의 10%, 30%, 50% 및 100%에서 두 개의 환자 유래 간세포암 오가노이드를 배양한 결과(표 1) BME는 30% 및 50%에서 온전했으며 오가노이드의 크기가 비슷하고 이러한 BME 농도에서 가장 큰 직경을 가졌습니다. 10% BME에서 BME는 오가노이드 성장을 위한 좁은 공간과 가장 작은 직경으로 가장 단편화되었습니다. 100% BM.......
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토론
환자 유래 오가노이드 모델의 주목할 만한 이점 중 하나는 조직 구조와 게놈 지형을 포괄하는 종양의 생물학적 특성을 충실하게 복제할 수 있다는 것입니다. 이러한 모델은 놀라운 수준의 정확도를 보여주며 장기간 배양 기간에도 종양의 이질성과 진행을 효과적으로 반영합니다 6,8,9. 이 정교한 오가노이드 배양 프로토콜의 활용을 통해 환자 유래 간세포 오가노이드 모델을 효과적으로 확립하여 체외에서 지속적인 성장을 촉진할 뿐만 아니라 실험 목적에 필요한 오가노이드를 냉동 보존하고 이후 소생시킬 수 있는 능력을 갖추었습니다. 이전 프로토콜과 비교하여 이러한 오가노이드는 향상된 성장률을 나타내며 배양에서 더 큰 차원을 달성할 수 있습니다. 그 후, 잘 확립된 오가노이드에 사전 스크리닝된 잠재적 발암 표적에서 파생된 항체 결합 약물을 투여하여 in vivo.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82122048; 82003773; 82203380)과 광둥 기초 및 응용 기초 연구 재단 (2023A1515011416)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL 마이크로튜브 | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ 억제제) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), 비타민 A 뺀 | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), 무혈 | Thermo Fisher Scientific | ||
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| 세포 여과기 크기 100 μ m | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| 콜라겐 분해 효소 D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, 개별 포장, 멸균 | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, 개별 포장, sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R& D SYSTEMS | 3700-100-01 | 오가노이드 수확 솔루션 |
| Cultrex 감소 성장 인자 BME, 유형 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| 덱사메타손 | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco의 개조 이글 미디엄 / 햄의 F-12 | 써모 피셔 사이언티픽 | 12634028 | 고급 DMEM / F-12 |
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| 집게 | N / A | ||
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B 형광 전동 현미경 | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-아세틸시스테인 | Merck | A0737-5MG | |
| 니코틴아미드 | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
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| 재조합 인간 FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| 재조합 인간 HGF | Peprotech | 100-39 | |
| 재조합 인간 Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | 세포주 분비 |
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| 간암 환자에서 제거된 종양의 수술 표본 | 관련 암 병원 및 광저우 의과 대학 | 연구소 N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드 없음 | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | 세포주 분비 |
참고문헌
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology.
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