Ex Vivo 연구를 위한 기니피그 원형 창 멤브레인 이식

감각신경성 난청 치료를 위한 새로운 종류의 치료법이 등장했습니다. 이러한 치료제를 임상 인구에 적용하는 것은 내이로 운반하는 안전하고 효과적인 경로에 의해 제한됩니다. 동물 연구에서 현재 생체 내 전달 방법은 내이로의 창호 또는 달팽이관에서 중이 공간을 분리하는 비골 장벽인 둥근 창막(RWM)을 통한 확산에 의존합니다¹.

외과적 창호와 내이에 대한 미세 주입은 모두 침습적이며 잔류 내이 기능에 위험을 초래할 수 있다². 따라서 RWM은 국소 약물 전달을 위한 중요한 경로이며, 기니피그는 RWM 전체와 의약품 개발을 위한 내이의 국소 약물 약동학을 연구하는 데 사용되는 주요 전임상 동물 모델입니다 ^3,4. 기니피그 RWM은 인간 RWM보다 얇지만 동일한 3층 구조를 공유합니다. 직경 약 1mm, 두께 15-25μm이며, 결합 조직층⁽⁵)을 끼우는 두 개의 상피 세포층으로 구성되어 있습니다. 중이를 향하는 상피층은 조밀하게 밀집되어 있고 단단한 접합부를 통해 연결되어 있는 반면, 내이와 스칼라 고막을 향하는 층은 구조가 느슨하고 세포 간 유착이 크지 않습니다.

기니피그 RWM의 약물 투과성을 조사하는 현재의 전임상 연구는 생체 내 중이 주사 후 내이 내 림프액 샘플링에 의존하고 있으며, 이는 RWM 수송에 대한 특정 연구를 허용하지 않습니다 ^6,7. RWM 외식의 단편은 전임상 연구에 사용되어 왔지만, 취약성과 작은 크기로 인해 RWM² 전체에 걸쳐 방수 밀봉이 필요한 약물 및 차량 운송의 체계적인 미세유체 조사에는 적합하지 않습니다. 다른 그룹은 RWM ^8,9,10에 근접하기 위해 배양된 인간 상피 세포가 있는 시험관 내 모델을 사용했습니다. 그러나 이러한 구조의 대부분은 외부 상피층에만 초점을 맞추고 자연 조직 구조의 복잡성을 포착하지 못합니다. RWM 전반의 수송 메커니즘에 대한 보다 자세한 이해를 위해서는 표적화된 체외 연구가 필요합니다.

이 연구에서는 막 무결성을 보존하기 위해 주변 뼈 지지대와 함께 기니피그 RWM을 이식하는 방법을 시연하고 약물 전달 차량의 RWM 수송에 대한 특정 연구를 위해 설계된 실험 패러다임에서 RWM의 사용을 설명합니다.

모든 동물 시술은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(GP18M226)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 하틀리 알비노 기니피그(수컷과 암컷 모두, 체중 500-700g)를 사용하였다.

1. 절차 설정 및 준비

1. 실험을 시작하기 전에 모든 기구를 에틸렌옥사이드로 멸균하십시오.
2. 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
   알림: 현재 연구에서는 상업용 실린더에서 100% 이산화탄소(CO₂)를 방출하기 위해 사전 충전되지 않은 챔버가 사용되었습니다. 인라인 제한 장치를 사용하여 가스 흐름을 조절하여 2020 AVMA 지침¹¹에 따라 챔버 부피의 30%에서 70% 범위 내에서 유지했습니다.
3. 동물을 챔버에 넣고 5분 동안 이산화탄소를 분배합니다. 호흡 정지 후 1분 동안 CO₂ 흐름이 유지됩니다.
4. 안락사를 보장하기 위해 호흡 정지 후 참수를 수행합니다.

2. 수술적 접근 및 이식

1. 일반적인 방식으로 기니피그 두개골에서 측두골을 추출합니다¹². rongeur로 여분의 연조직을 제거하십시오. 외부 음향 고기, 측두수포 및 안면관을 식별합니다¹³ (그림 1).
2. 6mm 다이아몬드 비트( 재료 표 참조)로 측두엽 수포의 복부 측면을 뚫고 중이 공간과 외이도를 원주방향으로 노출시킵니다.
3. rongeurs를 사용하여 외이도와 고막을 부드럽게 제거하고 동시에 incudomalleolar 관절을 분리합니다. incus, incudostapedial joint, cochlea, horizontal semicircular canal 및 facial^{canal 13} 을 식별합니다(그림 2A).
4. incudostapedial joint를 분리하고 겸자를 사용하여 incus를 제거합니다. 둥근 창의 뼈 틈새를 식별하십시오.
5. 6mm 다이아몬드 비트를 사용하여 달팽이관과 고막강의 내측 벽을 텐서 고막관 쪽으로 연결하는 뼈 층을 뚫습니다. 텐서 고막의 뼈 채널을 조심스럽게 감압하고 28G 바늘을 사용하여 텐서 고막 근육을 제거합니다.
   참고: 텐서 고막 포사의 내측 벽은 RWM 주변의 달팽이관과 직접 연결되며, 둥근 창까지 확장될 수 있는 골절을 일으키지 않도록 주의해야 합니다.
6. 달팽이관과 맞닿아 있는 1mm의 뼈 돌출부가 남을 때까지 달팽이관과 고막강의 하벽을 연결하는 뼈 층을 뚫습니다(그림 2B).
7. 2mm 다이아몬드 비트( 재료 표 참조)를 사용하여 달팽이관의 기저 회전에서 달팽이루를 만들고 둥근 창에 약 2mm의 뼈를 남깁니다. 달팽이관의 정점에서 기저부를 분리하기 위해 둥근 창막과 평행한 평면에서 달팽이루를 하반으로 계속합니다.
8. 훨씬 더 조밀한 두개골 기저부를 통해 절단된 달팽이루를 확장하여 달팽이관의 기저 회전을 단면으로 볼 수 있습니다.
   알림: 드릴을 내이도의 육을 향하게 하면 둥근 창에 너무 가깝게 횡단하는 것을 피하면서 뼈 제거를 최대화하는 궤적이 됩니다.
9. 두개골 바닥 쪽에서 검체를 검사하고 아직 수행하지 않은 경우 내이도를 식별하고 달팽이관 구멍에 드릴로 뚫습니다. 28G 바늘로 달팽이관을 제거합니다.
10. 달팽이관 쪽에서 검체를 검사합니다. 기저부에서 골성 나선형 층판과 나머지 모디올러스를 겸자 또는 28G 바늘로 식별하고 제거합니다.
11. 통합 스칼라 고막-스칼라 전정 공동을 충분히 관개하여 파편을 제거합니다. 둥근 창은 위에 놓인 파편 없이 cochectomy에서 명확하게 보여야 합니다(그림 2C).
12. 다음으로 중이 쪽에서 검체를 검사합니다. 측면 반고리관과 안면관을 타원형 창 높이까지 뚫습니다. 집게를 사용하여 등골을 부드럽게 제거하고 타원형 창 틈새를 노출시킵니다. 주목할 점은 등골의 crura 사이에 crista stapedis로 알려진 뼈 다리가 있다는 것입니다.
13. 1mm 다이아몬드 드릴( 재료 표 참조)을 사용하여 둥근 창의 면을 따라 타원형 창을 확장하여 현관을 더 열고 둥근 창 틈새에 접하는 1-2mm의 달팽이관을 유지하도록 주의합니다(그림 2D).
14. 타원형 창 절단을 둥근 창의 양쪽에 있는 달팽이 절개 절단과 연결하여 측두골 절단을 완료합니다.
    참고: 달팽이우의 취약성으로 인해 검체의 텐서 고막 포사를 보존하고 절단을 피하면 RWM으로 확장되어 무결성을 손상시키는 달팽이관 골절을 예방하는 데 도움이 됩니다.
15. 내이도에 인접한 두개골 기저부의 조밀한 뼈에 최종 부착물을 만들고 부드럽게 깎아 절제된 RWM 표본을 만듭니다(그림 3A).

그림 3A에서 볼 수 있듯이 이 방법은 단단한 뼈의 고리를 둘러싼 온전한 기니피그 원형 창막을 이식할 수 있습니다. RWM은 뼈 고리에 원주방향으로 완전히 연결되어야 합니다. 달팽이관의 골절은 인정되어서는 안 됩니다. 인간의 둥근 창 표본과 비교할 때 기니피그 RWM에는 위에 가성막이 없습니다. 또한 인간과 달리 기니피그 등골의 등골 사이에는 뼈 다리가 있어 등골 상부 구조를 추출하기 전에 골절 및 제거가 필요합니다. 대표적인 RWM의 조직학적 분석(그림 3B)은 인접하고 온전한 둥근 창 틈새가 있는 명확한 3층 상피 구조를 보여줍니다.

기술 관점에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 2.7단계에서 코첵 절제술을 할 때 버 팁의 지터로 인해 달팽이관의 외상성 골절이 둥근 창 막까지 확장될 수 있으므로 팁이 아닌 드릴 비트의 적도를 사용하여 절단하는 것이 중요합니다. 둘째, 내이도를 완전히 뚫는 것이 중요한데, 이렇게 하면 달팽이관을 완전히 제거하고 골나선층판을 더 쉽게 해부할 수 있어 실험적 샘플링을 위해 달팽이관 쪽에 통일된 공동이 생깁니다 (그림 2C).

RWM을 성공적으로 추출한 후 우리 그룹은 변형된 Ussing 챔버를 사용하여 멤브레인의 약동학적 특성을 평가했습니다. 변형된 Ussing 챔버는 상피막의 수송 특성을 평가하기 위해 망막 조직뿐만 아니라 고막 및 둥근 창막의 다른 그룹에 의해 검증되었습니다14,15. 이 3D 프린팅 장치는 Poly-Jet Vero를 사용하여 구성되었으며 각각 400μL 유체 챔버가 있는 두 개의 삼각형 베이스 피스로 구성됩니다(그림 3). RWM의 뼈 테두리는 2액형 에폭시(Gorilla, 재료 표 참조)를 사용하여 베이스에 부착된 다음 방수 밀봉을 보장하기 위해 실리콘 실란트(재료 표 참조)를 사용합니다(그림 4). 에폭시 또는 실란트가 멤브레인과 접촉하지 않도록 세심한 주의를 기울입니다. RWM을 제자리에 끼운 상태에서 두 베이스를 에폭시로 접착합니다. 수송 실험 중에 로딩(중이 방향)은 전달 차량(또는 관심 분자)을 포함하는 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워지고 샘플링 챔버(스칼라 고막 방향)는 PBS로만 채워집니다. 일정한 시간 간격으로 샘플링 챔버의 유체가 완전히 흡입되고 새로운 PBS로 교체됩니다.

각 실험 중에 품질 관리 조치를 취하여 장치 내 시편 주위에 방수 밀봉이 있고 미세 천공이 없는 완전히 손상되지 않은 멤브레인이 있는지 확인합니다. 갈색의 철심 나노 입자 용액을 사용한 대표적인 결과는 다음과 같습니다. 방수 밀봉의 정량적 검증은 각 샘플링 간격 동안 샘플링 챔버의 전체 부피를 흡인하여 수행됩니다. 샘플링 챔버에서 유체가 누출되면 전체 흡인 부피보다 작아집니다. 각 실험이 끝나면 로딩 챔버의 유체 부피도 동일하게 유지되어야 합니다. 또한 대상 유체는 갈색이기 때문에 누출 시에도 쉽게 볼 수 있습니다.

멤브레인 내에서 누출이 발생하지 않도록 하기 위해 몇 가지 접근 방식이 취해졌습니다. 첫째, 이 연구에 사용된 RWM 검체는 모두 즉시 추출되며 광, 공초점 및 전자 현미경 이미지는 미세 천공 없이 온전한 세포 및 막 구조를 확인합니다(그림 3A,B). 둘째, 나노 입자 전달에 미치는 영향을 비교하기 위해 RWM 표본의 하위 집합에서 의도적으로 미세 천공을 생성했습니다. 샘플링 및 로딩 챔버 흡입의 육안 검사는 시료 무결성과 방수 부착을 추가로 확인하는 역할을 합니다. 천공이 있는 RWM에서는 로딩 및 샘플링 챔버의 빠른 평형이 이루어지며, 이는 뚜렷한 색상 변화를 통해 관찰할 수 있습니다(보충 그림 1). 또한, 미세 천공된 RWM에서의 수송은 온전한 멤브레인에서 관찰된 최대 분산보다 높은 것으로 나타났습니다(보충 그림 2). 이들은 함께 시편을 둘러싼 방수 밀봉과 RWM의 무결성을 위한 품질 관리 메커니즘 역할을 합니다.

그림 1: 기니피그 측두골의 수술 전 이미지. 고막 수포, 외이도 및 안면관(*)은 기니피그 측두골의 수술 전 이미지에 나와 있습니다. 축척 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 수술 중 이미지. 둥근 창막과 인커스(*), 달팽이관(**), 등골(†) 및 감압된 내이도(‡) 사이의 관계를 보여주는 수술 중 이미지. 음영 영역은 제거될 표본 부분을 나타냅니다. (A) 고막과 안면신경을 제거한 후 기니피그 중이강(2.3단계). (B) 텐서 고막관의 감압 후 중이강(2.6단계). (C) 달팽이루술 및 내이 내용물 제거 후 RWM의 기저 보기(2.11단계). (D) 등골 제거 및 현관 식별 후 RWM 보기(2.13단계). 눈금 막대 = A,B (1cm); C,D( 5mm)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 최종 RWM 표본 및 조직학. (A) 뼈 고리가 있는 기니피그 RWM 총 표본. 눈금 막대 = 1cm. (B) 이식된 기니피그 둥근 창막의 조직학은 온전한 3층 구조를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 막관통 수송 실험을 위한 미세유체 장치. (A) 막횡단 수송 실험에 사용되는 미세유체 장치의 다이어그램. (나,씨) 실험을 위한 인쇄된 미세유체 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 5시간 철심 나노입자 전달 실험에서 챔버 내용물을 로딩 및 샘플링합니다. (A) 온전한 RWM의 로딩 챔버는 나노 입자의 농도가 감소함에 따라 색 강도가 점진적으로 감소하는 것을 보여줍니다. (B) 온전한 RWM의 샘플링 챔버는 시간이 지남에 따라 안정적인 착색을 보이며 낮은 수준의 나노 입자 전달과 일치합니다. (C) 천공된 RWM의 로딩 챔버는 내용물이 샘플링 챔버와 평형을 이룰 때 색상 강도의 급격한 감소를 보여줍니다. (D) 천공된 RWM의 샘플링 챔버는 시간이 지남에 따라 색상이 점진적으로 증가하여 높은 수준의 나노 입자 전달과 일치합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 나노 입자 전달에 대한 대표적인 수송 결과. 기니피그 RWM을 가로지르는 나노 입자(폴리에틸렌 글리콜 코팅이 된 Fe3O4 코어, 평균 반경 77nm)의 온전한 상태와 천공이 있는 경우(평균 ± SD, n ≥ 3 RWM 실험) 전달에 대한 대표적인 수송 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 내용이 없습니다.