이 프로토콜은 기니피그 측두골에서 둥근 창막을 이식하는 방법을 설명하여 생체 외 연구에 귀중한 리소스를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
내이에 대한 효율적이고 최소 침습적 약물 전달은 중요한 과제입니다. 내이로 들어가는 몇 안 되는 진입점 중 하나인 둥근 창막(RWM)은 연구의 중요한 초점이 되었습니다. 그러나 RWM을 분리하는 것이 복잡하기 때문에 약동학에 대한 이해는 여전히 제한적입니다. RWM은 외부 상피, 중간 결합 조직층 및 내부 상피층의 세 가지 별개의 층으로 구성되며, 각 층은 잠재적으로 고유한 전달 특성을 가지고 있습니다.
RWM을 통한 수송을 조사하기 위한 현재 모델은 세포 배양 또는 막 조각에 의존하는 생체 내 동물 모델 또는 생체 외 RWM 모델을 활용합니다. 기니피그는 내이 내 약물 약동학 조사를 위한 검증된 전임상 모델 역할을 하며, 달팽이관에 대한 전달 수단의 중개 개발을 위한 중요한 동물 모델입니다. 이 연구에서는 벤치탑 약물 전달 실험을 위해 주변 달팽이관과 함께 기니피그 RWM을 이식하는 접근 방식을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 기본 RWM 아키텍처를 보존할 수 있으며 현재 벤치탑 모델보다 운송 장벽을 보다 사실적으로 표현할 수 있습니다.
서론
감각신경성 난청 치료를 위한 새로운 종류의 치료법이 등장했습니다. 이러한 치료제를 임상 인구에 적용하는 것은 내이로 운반하는 안전하고 효과적인 경로에 의해 제한됩니다. 동물 연구에서 현재 생체 내 전달 방법은 내이로의 창호 또는 달팽이관에서 중이 공간을 분리하는 비골 장벽인 둥근 창막(RWM)을 통한 확산에 의존합니다1.
외과적 창호와 내이에 대한 미세 주입은 모두 침습적이며 잔류 내이 기능에 위험을 초래할 수 있다2. 따라서 RWM은 국소 약물 전달을 위한 중요한 경로이며, 기니피그는 RWM 전체와 의약품 개발을 위한 내이의 국소 약물 약동학을 연구하는 데 사용되는 주요 전임상 동물 모델입니다 3,4. 기니피그 RWM은 인간 RWM보다 얇지만 동일한 3층 구조를 공유합니다. 직경 약 1mm, 두께 15-25μm이며, 결합 조직층(5)을 끼우는 두 개의 상피 세포층으로 구성되어 있습니다. 중이를 향하는 상피층은 조밀하게 밀집되어 있고 단단한 접합부를 통해 연결되어 있는 반면, 내이와 스칼라 고막을....
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프로토콜
모든 동물 시술은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(GP18M226)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 하틀리 알비노 기니피그(수컷과 암컷 모두, 체중 500-700g)를 사용하였다.
1. 절차 설정 및 준비
- 실험을 시작하기 전에 모든 기구를 에틸렌옥사이드로 멸균하십시오.
- 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
알림: 현재 연구에서는 상업용 실린더에서 100% 이산화탄소(CO2)를 방출하기 위해 사전 충전되지 않은 챔버가 사용되었습니다. 인라인 제한 장치를 사용하여 가스 흐름을 조절하여 2020 AVMA 지침11에 따라 챔버 부피의 30%에서 70% 범위 내에서 유지했습니다. - 동물을 챔버에 넣고 5분 동안 이산화탄소를 분배합니다. 호흡 정지 후 1분 동안 CO2 흐름이 유지됩니다.
- 안락사를 보장하기 위해 호흡 정지 후 참수를 수행합니다.
2. 수술적 접근 및 이식
- 일반적인 방식으로 기니피그 두개골에서 측두골을 추출합니다
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결과
그림 3A에서 볼 수 있듯이 이 방법은 단단한 뼈의 고리를 둘러싼 온전한 기니피그 원형 창막을 이식할 수 있습니다. RWM은 뼈 고리에 원주방향으로 완전히 연결되어야 합니다. 달팽이관의 골절은 인정되어서는 안 됩니다. 인간의 둥근 창 표본과 비교할 때 기니피그 RWM에는 위에 가성막이 없습니다. 또한 인간과 달리 기니피그 등골의 등골 사이에는 뼈 다리가 있어 등골 상부 구조를 추출하기 전에 골절 및 제거가 필요합니다. 대표적인 RWM의 조직학적 분석(그림 3B)은 인접하고 온전한 둥근 창 틈새가 있는 명확한 3층 상피 구조를 보여줍니다.
기술 관점에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 2.7단계에서 코첵 절제술을 할 때 버 팁의 지터로 인해 달팽이관의 외상성 골절이 둥근 창 막까지 확장될 수 있으므로 팁이 아닌 드릴 비트의 적도를 사용하여 절단하는 것이 중요합니다. .......
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토론
귀에 국소 약물 전달에서 RWM은 치료제가 내이에 도달하는 주요 통로입니다. 정확하고 신뢰할 수 있는 벤치탑 모델은 새로운 전달 차량 전반에 걸친 운송 메커니즘과 투과성을 더 잘 이해하고 약물 개발을 위해 필요합니다. 이 연구에서 우리는 기니피그 RWM 이식이 약물-막 상호 작용에 대한 체계적인 조사를 가능하게 하는 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 절차임을 보여줍니다. Lundman et al. 및 Kelso et al.은 이전에 유사한 RWM 투과성 모델 2,16을 이용하는 것을 기술하였다; 그러나 외과적 적출의 구체적인 단계는 지금까지 자세히 설명되지 않았으며, 달팽이관의 취약성과 복잡한 해부학적 구조로 인해 온전한 RWM을 일관되게 일괄 채취하는 데 어려움이 있었습니다.
기니피그 RWM은 달팽이관의 스칼라 고막 끝에 위치하고 있으며 얇은 달팽이관 층으로 둘러싸여 있습니다........
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIDCD 보조금 번호 1K08DC020780 및 5T32DC000027-33과 Rubenstein Hearing Research Fund의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1mm 다이아몬드 볼 드릴 비트 | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2mm 다이아몬드 볼 드릴 비트 | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6mm 다이아몬드 볼 드릴 비트 | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus 시스템 | Anspach | EMAX2PLUS | 모든 뼈 절단 드릴링 시스템이 작동합니다 |
| Eclipse Needle 27G x 1/2 in. 분리 가능한 1 mL BD Luer-Lok 주사기 | 포함Becton, Dickinson 및 Co. | 382903057894 | 27-28g 바늘 |
| 고릴라 에폭시 | 고릴라 | 4200101 | |
| Kwik-CAST | 세계 정밀 기기 | KWIK-CAST |
참고문헌
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhanc....
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재인쇄 및 허가
