구강 안면 근육 섬유증 모델을 확립하기 위해 마우스 교근의 동결 손상

구강 안면 근육은 저작, 언어, 호흡 및 얼굴 표정과 같은 일상적인 생리 활동에 중요합니다¹. 그러나 선천성 구강안면 기형의 경우 이러한 근육이 위축성 및 섬유화 변화를 일으켜 신체 건강과 사회적 인지를 손상시킨다². 안면 재건 수술이 여전히 1차 치료법이지만, 수술 후 환자의 최대 30-70%가 여전히 근육 손실과 근육 기능 장애를 겪고 있습니다 ^3,4 구강 안면 근육 재생의 실패는 수술만으로는 해결할 수 없는 내인적 요인에 기인합니다.

구강 안면 근육의 출현은 복잡한 척추 동물의 머리와 방이있는 심장 ^5,6을 동반하는 진화 적 참신함입니다. 좀마이트(somite)에서 유래한 사지(limb)와는 달리, 구강안면근(orofacial muscle)은 분지아치(branchial arch)⁷에서 유래한다. 이러한 계통발생학적 및 존재론적 특성은 그들에게 뚜렷한 재생행동을 유발할 수 있다⁸. 교근(MAS) 근육은 경골 전방(TA) 근육이 동일한 정도의 부상에 노출된 후 완전히 재생되는 시점에 심각한 섬유증이 발생한 것으로 보고되었습니다 ^1,9. 그러나 재생의 근본적인 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다.

이 연구에서는 구강 안면 근육 재생에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 마우스 교근의 동결 손상 모델을 설정했습니다. 우리는 두 근육 사이에서 식별 가능한 발산이 감지될 수 있는 가장 빠른 시점이었기 때문에 섬유증 표현형을 평가하기 위한 시점으로 부상 후 14일을 선택했습니다. 부상 후 MAS가 완전히 재생되려면 최소 40주가 필요합니다¹. 일관되게, 이 연구는 MAS의 동결 손상 후 콜라겐의 현저한 침착을 손상 후 TA의 규칙적인 재생과 비교하여 밝혔습니다. 이 모델의 도움으로 근육 위축 및 섬유증에 대한 추가 기계론적 연구를 수행할 수 있으며, 이는 수술 후 구강 안면 근육 재생을 촉진하기 위한 잠재적인 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.

이 연구의 모든 동물 시술은 쓰촨대학교 중국서부구강학 학교 윤리위원회(WCHSIRB-D-2020-114)에서 검토하고 승인했습니다. 수컷 C57BL/6마리 마우스(5주령)는 습도 조절(53 ± 2%) 및 온도 조절(23 ± 2°C) 시설에서 사육되었으며 12시간 라이트/다크 사이클에 있었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 결빙 부상

1. 마취: 이소플루란에 적신 면봉으로 생쥐를 진정시키고 50mg/kg의 용량으로 틸레타민-졸라제팜을 복강내로 주입합니다. 수술 전후 진통은 1mg/kg의 용량으로 meloxicam의 복강 내 주사로 제공되었습니다. 수의사 연고로 눈을 보호하십시오. 38°C로 유지되는 가열 패드를 전체 절차 동안 수술용 드레이프 아래에 놓아 동물에게 열 지원을 제공했습니다. 마우스를 수술 테이블에 옆으로 눕힌 후 접착 테이프로 고정합니다(그림 1). 눈꺼풀 반사, 바로잡기 반사 및 페달 철회 반사의 손실로 마취의 충분성을 평가합니다.
   알림: 이소플루오란 마취를 할 때는 한 손에는 마우스를, 다른 한 손에는 이소플루오란에 적신 면봉을 잡으십시오. 불편함과 피부 자극을 피하기 위해 면봉을 동물과 멀리 두십시오.
2. 수술 전 제모: 전기 면도기를 사용하여 쥐의 종아리와 얼굴의 털을 면도하고 면봉으로 제모 페이스트를 피부에 바르고 교근과 경골 전방 근육을 덮습니다. 1-2분 후 에탄올 기반 수술용 물티슈로 페이스트를 씻어냅니다(그림 2A 및 그림 2G). 수술 부위는 요오드 기반 스크럽과 75% 에탄올로 3회 소독했습니다.
   참고: 전기 면도기만으로는 특히 교근 부위의 제모에 충분하지 않았습니다. 제모 페이스트를 바를 때 과도한 페이스트를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 피부 화상을 방지하기 위해 페이스트를 씻어낼 때 피부를 부드럽게 닦으십시오.
3. 수술 현장 노출: 수술 절차 전에 수술용 드레이프로 덮으십시오. MAS 근육의 경우 먼저 하악골의 아래쪽 가장자리를 따라 촉진합니다. 가장자리에서 5mm 떨어진 곳에서 구강 커미셔와 관마를 연결하는 선을 따라 7mm 절개를 합니다(점선은 그림 2B에서 절개 위치를 나타냄).
4. TA 근육의 경우 먼저 종아리를 따라 촉진하여 경골의 앞쪽 가장자리를 찾습니다. 무릎에서 시작하여 발목에서 끝나는 메스로 피부를 통해 가장자리에서 2mm 후방으로 자릅니다(점선은 그림 2H에서 절개 위치를 나타냄). 각 마우스에 대해 왼쪽의 MAS와 TA 근육이 부상을 입은 경우 반대쪽의 다른 근육을 대조군으로 사용합니다.
   참고: 이 절개는 절개 시 근육이 다치지 않도록 하기 위해 매우 피상적입니다. 얼굴의 절개 부위는 진통에 너무 가깝지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 이하선이 노출되어 다음 동결 과정에서 과도한 출혈이 발생합니다.
5. 드라이아이스 동결: MAS 및 TA 근육의 긴 축을 따라 예냉식 집게로 드라이아이스 한 조각을 잡습니다(각각 그림 2C 및 그림 2I). 드라이 아이스를 근육 표면에 직접 5 초 동안 올려 놓습니다. 드라이아이스를 제거한 직후 근육이 뻣뻣하고 창백한 흰색으로 보이지만(그림 2D 및 그림 2J) 22-25초 이내에 인접 근육(그림 2E 및 그림 2K)과 유사하게 정상적인 색상과 질감으로 돌아오는지 확인합니다.
   알림: 드라이 아이스를 들고 있는 집게는 드라이 아이스의 빠른 승화를 방지하기 위해 예열해야 합니다. 타이머는 5 초 결빙 부상을 수행하고 근육의 22-25 초 회복 시간을 계산하는 데 필수입니다. 회복 시간이 22초 미만이거나 25초 이상인 근육은 포기해야 합니다. 이 단계는 연습이 필요합니다.
6. 상처 봉합: 근육이 완전히 회복된 후 최소 3개의 7-0 봉합사로 피부 상처를 봉합합니다(그림 2F 및 그림 2L).
7. 소생술: 봉합이 완료되면 열 지지대가 있는 케이지에 쥐를 넣고 모든 오른쪽 반사 신경이 회복될 때까지 지속적으로 모니터링합니다.

2. 근육 수집

1. 이소플루란을 과다 투여한 후 자궁경부 탈구를 하여 쥐를 안락사시킵니다. 조직학적 분석을 위해 양쪽의 MAS 및 TA 근육을 채취합니다.
2. MAS 근육 절제술: 쥐 얼굴의 피부를 절개하고 귀밑샘을 제거하여 MAS 근육의 뒤쪽 부분을 노출시킵니다. MAS의 전방 부착부에서 하악골의 후방 부착부까지 모두 절개합니다. 흰색 점선 영역은 MAS의 노출된 부분을 나타냅니다(그림 3A).
   참고: MAS 근육은 하악골 표면에 밀접하게 부착된 깊은 구획과 표재성 구획으로 구성되어 있습니다. MAS가 완전히 격리되도록 절개 중에는 가위를 하악골에 대고 눌러야 합니다. zygomatico-mandibularis와 MAS는 zygomatico와 mandible 사이의 경계로 구별할 수 있습니다.
3. TA 근육 절개: 발목에서 무릎까지의 피부를 절개하고 근막을 제거하여 TA 근육을 노출시킵니다. 미세 절개 겸자의 끝을 사용하여 TA의 힘줄을 분리하고 무릎까지 밀어 경골에 부착된 섬유를 끊습니다. 그런 다음 발목의 힘줄을 자릅니다(그림 3B).
   알림: TA 근육의 경우 마우스 발목 주위에 몇 개의 근육 힘줄이 있습니다. 경골에 가장 크고 가장 가까운 TA의 힘줄을 식별하려면 연습이 필요합니다.
4. 예냉용 이소펜탄: 두 개의 절연 배럴을 준비합니다. 작은 배럴에 이소펜탄을 채우고 큰 배럴에 액체 질소를 채웁니다. 근육 절개 10분 전에 작은 배럴을 큰 배럴 안에 넣습니다(그림 3D).
5. 임베딩 금형 준비: 각 샘플에 대해 원통형 주석 호일 금형을 만들고 최적의 절단 온도(OCT) 화합물로 채웁니다.
6. 신선 냉동: 근육을 OCT에 담그고 OCT 화합물에 수직으로 유지합니다(그림 3C). 바늘 홀더를 사용하여 금형을 사전 냉각된 이소펜탄으로 옮깁니다. OCT가 하얗고 단색이 될 때까지 40초 동안 기다립니다(그림 3D).
   알림: 금형의 위치가 너무 낮지 않은지 확인하십시오. 그렇지 않으면 이소펜탄이 OCT와 혼합되어 근육 동결 과정을 손상시킵니다. 금형의 OCT 수준은 근육 샘플의 높이와 비슷해야 합니다. 빠르고 효율적인 냉동을 위해 과도한 양의 OCT를 피하십시오.
7. 시료 보관: 신선하게 냉동된 근육 시료를 명확하게 라벨이 부착된 24웰 플레이트에 보관합니다. 샘플을 즉시 절단하거나 장기간 사용할 수 있도록 -80 °C에서 보관하십시오.

3. 조직학적 분석

1. 저온 유지 장치를 사용하여 근육 샘플에서 10μm 두께의 절편을 표면 처리된 슬라이드로 절단합니다.
2. 슬라이드를 얼음처럼 차가운 아세톤에 20분 동안 넣고 흄 후드에서 20분 동안 자연 건조합니다.
3. 인산염 완충 식염수(PBS)로 슬라이드를 3 x 5분 동안 세척합니다.
   알림: 이 단계부터 슬라이드는 건조를 방지하기 위해 습도 챔버에 보관되었습니다.
4. 시리우스 레드 염색
   1. 0.5g의 Sirius Red 분말을 포화 피크르산 500mL에 용해시켜 Sirius Red 작업 용액을 준비합니다.
   2. 실온에서 1시간 동안 Sirius Red 작업 용액으로 슬라이드를 염색합니다.
   3. 0.5% 아세트산으로 2 x 5분 동안 슬라이드를 세척합니다.
   4. 염색 과정 후 샘플은 먼저 95% 에탄올에서 15초 동안 탈수한 다음 무수 에탄올에서 1분 동안 탈수해야 합니다. 마지막 단계는 중성 발삼으로 슬라이드를 장착하는 것입니다.
5. 면역조직학적 염색
   1. 실온에서 20분 동안 PBS에서 0.3% 트리톤으로 절편을 투과시킨 다음 PBS 세척합니다.
   2. Pax7 염색의 경우 참조된 키트와 함께 제공된 시약으로 섹션을 차단하십시오. 라미닌 및 Pdgfrα 염색의 경우 PBS의 5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 5% 당나귀 혈청으로 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
   3. Pax7, laminin 및 Pdgfrα에 대한 1차 항체가 있는 절편을 4°C에서 밤새 배양한 후 PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다.
   4. 형광 염료 접합 2차 항체로 절편을 실온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다.
   5. 실온에서 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 3분 동안 배양한 다음 PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다.
   6. 섹션에 장착 매체를 놓고 커버슬립을 그 위에 놓고 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 밀봉합니다.

HE와 Sirius Red 염색(그림 4 및 추가 그림 S1)은 이 동결 부상 모델에서 TA의 완전한 근육 재생을 보여주었습니다. 대조적으로, MAS는 손상된 근섬유 재생과 과도한 세포외 기질 침착을 나타냈습니다. 온전한 MAS 및 TA 근육의 조직학은 그림 4A, B에 나타나 있으며, 여기서 근섬유는 정렬되어 있고 섬유화 영역은 간질 공간과 다른 다발 사이에서만 나타납니다. TA 근육은 부상 후 14일 동안 손상되지 않은 대조군과 거의 동일한 근육 구조를 유지했지만(그림 4G-J), MAS 근육의 구조는 심각하게 교란되었습니다(그림 4C-F). 섬유화 부위는 MAS 근육의 전방, 중, 후방 단면에 있는 거의 모든 근섬유의 자리에 나타났다(그림 4C-F).

Pax7(보충 그림 S2) 및 Pdgfrα의 면역조직학적 염색은 각각 근육 위성 세포(MuSC) 및 섬유-지방 생성 전구세포(FAP)에 대한 추가 연구를 용이하게 했습니다. MAS 근육에서 14dpi에서 밀집된 핵이 나타났지만 비례적으로 증가된 MuSC는 없었습니다(그림 5A, B). 다수의 중앙 핵 근섬유(파란색 화살촉으로 표시)는 14dpi의 TA에서 검출되었으며(그림 5H), 근섬유의 윤곽은 손상 부위의 MAS에서 거의 눈에 띄지 않았습니다(그림 5E,F). 대신, Pdgfrα 양성 FAP와 새로 형성된 작은 직경의 근섬유(흰색 화살표로 가리킴)의 침투가 관찰되었습니다(그림 5F).

그림 1: 수술 설정의 개요. (A) 마우스를 마취하고 수술대에 고정했습니다. 왼쪽 얼굴과 다리의 털을 제거했습니다. 근육 동결 및 회복 시간을 모니터링하기 위해 타이머를 사용했습니다. (B) 직경 3.5mm, 높이 6-12mm의 드라이 아이스를 유리 비커에 넣어 동결했습니다. 겸자는 나중에 사용하기 위해 드라이 아이스로 사전 냉각되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: MAS 및 TA 동결 손상의 수술 중 기록. (A) MAS 동결을 위한 제모. (B) MAS 근육을 노출시키기 위해 피부를 엽니다. (C) MAS의 장축을 따라 드라이아이스로 얼립니다. (D) 동결 5초 직후 MAS의 모습. (E) 회복 22-25초 후 MAS의 출현. (F) 안면 상처 봉합. (G) TA 동결을 위한 제모. (H) 피부를 열어 TA 근육을 노출시킵니다. (I) TA의 장축을 따라 드라이아이스를 사용하여 동결. (J) 동결 5초 후 TA의 모습. (K) 회복 22-25초 후 TA의 모습. (L) 다리 상처 봉합. 약어 : MAS = 교근; TA = 경골 전방. 그림 2B 및 2H의 점선은 절개 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: MAS 및 TA 근육 수확. (A) 동결 부상 후 14일 시점의 MAS 근육의 모습. 빨간색 점선 타원은 MAS를 나타냅니다. 흰색 점선 삼각형은 MAS 근육의 노출을 나타냅니다. (B) 동결 부상 후 14일째에 TA 근육의 모습. 빨간색 점선 타원은 TA를 나타냅니다. (C) 근육 샘플을 OCT 화합물에 수직으로 담그십시오. (D) 근육 샘플을 질소 냉각 이소펜탄으로 옮깁니다. 약어 : MAS = 교근; TA = 경골 전방; OCT = 최적 절삭 온도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: MAS 및 TA 근육의 조직학적 분석. 온전한 (AE)의 시리우스 레드 염색 14dpi에서 MAS의 온전한 근육 부분과 MAS의 전방, 중간 및 후방 부분. (에프제이 ) 14dpi에서 TA의 온전한 근육 부분과 TA의 전방, 중, 후방 부분. 눈금 막대 = 100 μm. 약어 : MAS = 교근; TA = 경골 전방; DPI = 부상 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: MAS 및 TA 근육의 면역형광 분석. (A) 원형 MAS, (B) 14 dpi MAS, (C) 손상되지 않은 TA 및 (D) 14 dpi TA에서 Pax7 및 DAPI(파란색)의 면역염색. (E) 원형(intact) MAS, (F) 14 dpi MAS, (G) 원형(intact) TA 및 (H) 14 dpi TA에서 laminin, Pax7 및 DAPI(파란색)의 면역염색. 눈금 막대 = 20 μm. 약어 : MAS = 교근; TA = 경골 전방; DPI = 부상 후 일수; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌. 흰색 화살표는 MAS의 대표적인 작은 직경 섬유를 나타냅니다. 파란색 점선 영역과 화살표는 TA의 대표적인 재생 근섬유와 중심핵을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 근육 재생 중 지속적인 섬유증. (A) 동결 부상에 의해 유도된 TA 및 MAS 근육 재생의 개략도. (비-지) 부상 후 서로 다른 시점에서 TA 및 MAS 근육 단면에서 헤마톡실린 및 에오신 염색의 대표 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림은 Cheng et al.8에서 재현되었습니다. 약어 : MAS = 교근; TA = 경골 전방; DPI = 부상 후 일수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 근육 형성 과정의 손상. (A) TA 및 MAS 근육에서 Pax7(녹색) 및 DAPI(파란색)의 면역 형광 이미지. (B) Pax7 양성/DAPI 핵 비율의 정량화. 눈금 막대 = 100 μm * 온전한 근육 컨트롤과 크게 다름을 나타냅니다. # 같은 시점에서 다른 근육과 크게 다르다는 것을 나타냅니다. **p < 0.01, ##p < 0.01. 이 그림은 Cheng et al.8에서 재현되었습니다. 약어 : MAS = 교근; TA = 경골 전방; DPI = 부상 후 일수; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.