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Research Article
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
여기에서 우리는 설치류를 위해 설계된 해마 의존 공간 학습 패러다임인 활성 장소 회피 테스트를 위한 프로토콜을 제시합니다. 주요 매개변수를 변경하면 처리 전후 또는 시간이 지남에 따라 동물을 다시 테스트할 수 있습니다.
설치류의 해마 의존 공간 학습은 다양한 방법을 사용하여 테스트되었습니다. 여기에는 MWM(Morris water maze), Y-maze 및 NOL(Novel Object Location) 작업이 포함됩니다. 최근에는 APA(Active Place Avoidance) 작업이 이러한 전통적인 접근 방식의 대안으로 개발되었습니다. APA 작업에서 마우스는 고정된 충격 영역을 피하기 위해 회전하는 경기장 주변에 배치된 공간 신호를 사용해야 합니다. 조정할 수 있는 여러 매개변수로 인해 APA 작업은 매우 다양한 접근 방식임이 입증되었습니다. 그것은 쥐의 동일한 집단을 위해 세로로 그리고 반복적으로 사용되기에 적합하다. 여기에서는 APA 작업을 성공적으로 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 공간 학습의 다양한 구성 요소를 검사하는 데 사용할 수 있는 대안적인 APA 접근 방식을 강조합니다. 데이터 수집 및 분석 프로세스에 대해 설명합니다. 테스트를 성공적으로 수행할 가능성을 높이기 위해 APA 작업 중 중요한 단계에 대해 설명합니다. APA 작업은 기존의 공간 탐색 테스트에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 노화된 마우스 또는 알츠하이머병과 같은 질병 표현형이 있는 마우스와 함께 사용하는 것이 적절합니다. 작업의 복잡성을 쉽게 변경할 수 있으므로 광범위한 마우스 변형을 테스트할 수 있습니다. 또한, APA 과제는 뇌졸중이나 외상성 뇌 손상과 같은 운동 또는 신경 기능에 영향을 미칠 수 있는 수술 또는 실험적 중재를 받은 동물을 테스트하는 데 적합합니다.
APA(Active Place Avoidance)는 설치류 1,2,3,4에서 해마 의존 공간 학습을 테스트하는 효과적인 도구입니다. APA 과제 동안, 동물은 회전하는 경기장에 놓여지며 시각 신호를 사용하여 방향을 잡고 혐오스러운 충격 구역5을 피해야 한다. 경기장의 회전은 마우스가 탐색을 위해 특이한 접근 방식을 사용할 수 없도록 하며, 이러한 신호는 충격 영역이 정지 상태로 유지되는 동안 플랫폼에서 회전하기 때문에 냄새 표시를 사용할 수 없습니다5. 경기장의 속도와 방향, 충격 구역 및 시각적 단서의 위치를 변경하면 마우스를 여러 번 다시 테스트할 수 있습니다 6,7,8. APA는 가장 널리 사용되는 공간 학습 테스트 중 하나인 MWM(Morris water maze)에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 중요한 것은, 생쥐는 수영을 싫어하고 MWM 작업이 극도로 스트레스가 많다는 것이다9. 또한, 늙은 쥐는 MWM 작업(10) 동안 떠다니는 것으로 보고되었으며, 이로 인해 많은 경우에 공간 학습 작업으로 적합하지 않습니다. 또한 MWM 작업에는 테스트 중에 마우스가 찾을 수 있는 숨겨진 수중 플랫폼이 필요합니다. 이로 인해 물이 불투명해야 하며, 이는 일반적으로 흰색 페인트를 첨가하여 달성됩니다. 행동 작업 중 동물을 추적하고 분석하려면 개체와 주변 환경 간의 충분한 대비가 필요하며, Swiss 또는 BALB/c와 같은 특정 마우스 균주는 MWM에서 테스트되지 않아야 합니다. APA 작업에서 이 문제는 그리드 아래에 검은색 플라스틱을 추가하여 우회됩니다.
다중 APA 패러다임은 공간 학습을 테스트하도록 설계되어 효과적인 행동 도구로서의 유용성을 입증했습니다. 예를 들어, 공간 학습의 습득, 유지 및 통합은 일반적으로 3-5일 6,7,11,12일 범위의 동물에 대한 일일 테스트로 수행됩니다. 기억력과 학습은 각 획득일마다 받은 충격의 수를 비교하여 정량화됩니다. 첫 진입까지의 시간과 충격 영역을 피하는 최대 시간도 과제 중 학습 능력의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있는 중요한 매개변수입니다. 또는 공간 작업 메모리는 단일 30분 APA 세션 2,13을 수행하여 테스트할 수 있으며, 여기서 공간 학습은 5분 빈에서 충격 수치와 같은 성능을 비교하여 세션 내 변화로 측정됩니다.
이 문서에서는 APA 작업에 대해 설명하고 이 공간 학습 테스트를 수행할 때 고려해야 하는 주요 기능을 강조합니다.
모든 동물 시술은 호주 국립 보건 의료 연구 위원회(National Health and Medical Research Council of Australia)의 지침에 따라 퀸즐랜드 대학교 동물 윤리 위원회(University of Queensland Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다(승인 번호: QBI/189/15).
1. APA 룸 설정
알림: APA 장치는 32cm 높이의 투명한 원형 경계로 둘러싸인 금속 격자 바닥이 있는 고가 경기장으로 구성됩니다. 금속 막대는 균일한 간격(0.5cm 간격)이며 지름은 0.3cm입니다.
2. 실험자 취급에 대한 습관화
3. APA 아레나 적응 (1일)
4. APA를 활용한 습득 교육 (1-6일)
5. 반전 취득 훈련 (선택, 1-6 일)
6. 프로브 시험(선택 사항, 1일)
7. 추적 분석
알림: 작업 성능은 다양한 추적 소프트웨어를 통해 달성할 수 있습니다. 다음은 포함된 소프트웨어를 사용하여 APA 작업 중 성능을 결정하는 방법입니다. 이 경우 데이터는 추적 분석 프로그램을 사용하여 분석됩니다.
온전한 공간 학습 능력을 가진 마우스는 연속적인 획득 시도 동안 충격 횟수가 감소하는 것을 보여줍니다(그림 4A). 마찬가지로, 충격 영역을 피하는 최대 시간은 마우스가 충격 영역에서 성공적으로 벗어나는 방법을 학습함에 따라 증가합니다(그림 4B). 그러나 효과적인 회피 전략을 학습할 수 없는 마우스는 각 획득 시도에서 일정한 수의 충격을 보여줍니다(그림 4A). 종종, 충격 구역을 식별하지 못하는 마우스는 구역에 들어갈 때마다 여러 번의 충격을 받게 됩니다. 트레이스 맵은 충격 영역을 피하는 방법을 학습하는 마우스(그림 4C)와 충격 영역을 피할 수 없는 마우스(그림 4D)의 예를 제공하는 데 유용합니다. 두 경우 모두 이러한 추적 맵은 획득의 마지막 날을 나타냅니다. 그림 4C의 마우스는 두 개의 원으로 표시된 것처럼 2번의 충격만 받았습니다. 또한 트레이스 맵은 마우스가 빨간색 쐐기로 표시되는 충격 영역의 반대쪽에서 대부분의 시간을 보내는 것을 보여줍니다. 반대로, 그림 4D의 마우스는 더 많은 충격을 받았고, 트레이스 맵은 무질서한 패턴을 보여줍니다. 충격 영역을 피하는 방법을 성공적으로 학습할 수 없는 마우스의 예로는 18개월 된 마우스(그림 4A,B-에서 수정됨)에서 볼 수 있듯이 나이가 많아 해마 신경 발생이 감소한 마우스(Blackmore et al., 20217에서 수정됨), 미성숙뉴런의 화학적 절제 또는 해마 병변(Codd et al., 2020)8.
마우스가 학습하지 못하여 실패한 시험과 장비 설정 실패를 구별하는 것이 중요합니다. 장비 고장으로 인해 결과가 좋지 않은 가장 일반적인 두 가지 원인은 마우스 추적 불량(그림 5A) 또는 마우스에 충격이 가해지지 않는 것입니다. 추적이 잘못되면 마우스가 충격 영역에 있을 때 충격을 받지 않을 수 있습니다. 또는 추적 상태가 좋지 않으면 마우스가 영역에 없을 때 부정확하게 충격을 유발할 수 있습니다. 두 경우 모두 이것은 마우스가 효과적인 회피 전략을 개발하는 데 방해가 됩니다. 추적 불량은 "From Calibrator" 탭에서 임계값을 조정하여 해결할 수 있습니다. 추적 불량은 일반적으로 10분 동안 1,000개 이상의 불량 프레임으로 정의되며 매우 드물게 발생합니다. 잘못된 추적은 탈모증이 발생할 수 있는 늙은 쥐에서 문제가 될 수 있습니다. 충격을 받으면 쥐는 긴장을 풀거나 때때로 목소리를 냄으로써 반응합니다. 마우스는 일반적으로 약간이라도 움직이며 실시간 추적 소프트웨어에서 볼 수 있습니다. 마우스가 충격 영역 내에서 완벽하게 정지하면 명확한 충격 선이 표시됩니다(그림 5B). 이것은 쇼크 박스가 켜져 있지 않거나 막대 사이에 스캣이 끼어 동물에게 전달되는 쇼크의 진폭을 줄이기 때문일 수 있습니다.

그림 1: APA 장치, 동작실 및 충격 구역 설정. (A) 테스트 경기장 및 회의실 설정의 예. APA 장치는 높이 올라가 새로운 시각적 단서로 둘러싸인 방 중앙에 배치됩니다. 흑백 시각 신호는 플랫폼과 동일한 높이에서 사용됩니다. (비). 실험 탭의 타겟 기능을 사용하면 전체 경기장을 마스킹하고 충격 영역의 위치를 생성할 수 있습니다. 이 예에서는 빨간색 쐐기로 표시되는 충격 영역이 270°로 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 알비노 마우스 균주에 대한 APA 설정. APA 아레나는 추적 탭에서 라이트 옵션을 선택하고 검은색 아레나 배경을 만들어 BALB/c와 같은 알비노 생쥐 변종에 대해 설정할 수 있습니다. 검은색 배경의 알비노 마우스는 높은 대비를 달성하고 더 나은 마우스 추적 기능을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 마우스 추적에 대한 임계값을 조정하는 것은 필수적입니다. 임상시험 기간 동안 양호한 동물 추적을 보장하기 위해 임계값을 적절하게 조정해야 합니다. 임계값은 From Calibrator 탭의 임계값 창에서 빨간색 선을 이동하여 조정합니다. (A) 개체에 주황색 단색 영역과 파란색 X가 있는 좋은 임계값 선택의 예입니다. (B) 얼룩덜룩한 주황색이 있는 불량한 임계값. 추적이 잘못되면 경기장에서 동물을 잃어버리거나 쥐가 충격 영역에 있을 때 충격을 받는 것을 방지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 5일 학습 패러다임 및 Trace 맵에서 젊은(10주) 마우스와 노년(18개월) 마우스의 성능 비교. (A) 10주 된 쥐는 5일간의 테스트 동안 18개월 된 쥐에 비해 훨씬 적은 충격을 받았습니다. 실험 첫날에 받은 충격 횟수의 차이는 그룹 간에 미미했지만, 온전한 기억을 가진 어린 쥐는 나이 든 그룹보다 더 빨리 충격 영역에 진입하는 것을 피하는 방법을 배웠습니다. (B) 최대 회피 시간은 10분 시험 동안 충격을 피하는 데 소요된 최대 시간으로 계산되었습니다. 어린 쥐는 나이 든 쥐에 비해 충격 영역에 들어가는 것을 피하는 방법을 빠르게 배웠는데, 이는 어린 쥐가 효과적으로 학습하고 있음을 시사합니다. (C) 이 추적 맵의 마우스는 이 획득 시험에서 두 개의 원으로 표시된 것처럼 두 번의 충격만 받았습니다. 이 마우스는 또한 빨간색 쐐기로 표시되는 충격 지역 맞은편 경기장에서 더 많은 시간을 보냈습니다. (D) 이 쥐는 더 많은 충격을 받았고 충격 영역 근처에서 더 많은 시간을 보냈으며, 이는 이 쥐에서 공간 학습이 달성되지 않았음을 시사합니다. Bonferroni 사후 검정을 사용한 양방향 반복 측정 ANOVA를 사용하여 유의성을 테스트했습니다. 피<0.0001. 패널 A와 B는 Blackmore et al.7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 추적 맵은 각 시험 동안 각 마우스에 대한 중요한 정보를 제공합니다. (A) 이 추적 예에 있는 직선에 유의하십시오. 이는 추적 소프트웨어가 작업 중에 마우스를 잘못 식별하기 때문입니다. (B) 시험 중 양호한 추적의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 다양한 동물 추적 프로그램에서 시각화 및 히트맵을 추적합니다. (A) 프로그램 1과 (B) 프로그램 2는 모두 동물의 위치와 움직임을 감지하여 동물이 과제나 실험적 처리의 효과를 학습하는지 육안으로 검사할 수 있는 추적 플롯을 생성합니다. 두 프로그램 모두 작업을 효율적으로 학습한 동물의 동일한 트랙 플롯을 보여줍니다. (씨) 핫스팟을 식별하고 데이터 포인트를 클러스터링하는 데 도움이 되는 히트맵도 생성할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
저자는 밝힐 것이 없습니다.
여기에서 우리는 설치류를 위해 설계된 해마 의존 공간 학습 패러다임인 활성 장소 회피 테스트를 위한 프로토콜을 제시합니다. 주요 매개변수를 변경하면 처리 전후 또는 시간이 지남에 따라 동물을 다시 테스트할 수 있습니다.
우리는 이 원고에 설명된 장치의 개발 및 유지 관리에 대해 Queensland Brain Institute(QBI) Animal Behaviour Facility에 감사드립니다.
| 정전류 소스 CS02 | 바이오시그널 그룹 | 해당 사항 없음 | Acton, 매사추세츠, 미국 |
| 컨트롤 박스 | 바이오시그널 그룹 | 해당 사항 없음 | Acton, 매사추세츠, 미국 |
| 에토비전 | 놀두스 | 버전 16 | Wageningen, 네덜란드 |
| 쇼크 스크램블러 | 바이오시그널 그룹 | 해당 사항 없음 | Acton, 매사추세츠, 미국 |
| 트랙 분석 | 바이오시그널 그룹 | 버전 2.2 | Acton, 매사추세츠, 미국 |
| 트래커 프로그램 | 바이오시그널 그룹 | 버전: 2.36 | Acton, 매사추세츠, 미국 |