이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

2.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

2024년 1월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

환자 유래 종양 오가노이드는 기초 및 중개 연구를 위한 정교한 모델 시스템입니다. 이 방법 기사에서는 다양한 오가노이드 표현형의 동시 역학 평가를 위한 다중 형광 라이브 셀 이미징의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

초록

암 환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 암 세포주와 비교하여 인간 질병을 더 잘 재현하는 다기능 연구 시스템입니다. PDO 모델은 세포외 기저막 추출물(BME)에서 환자 종양 세포를 배양하고 3차원 돔으로 도금하여 생성할 수 있습니다. 그러나 단층 배양에서 표현형 분석에 최적화된 시판되는 시약은 BME와 호환되지 않는 경우가 많습니다. 여기에서는 자동화된 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 PDO 모델을 도금하고 약물 효과를 평가하는 방법을 설명합니다. 또한 kinetic 측정과 호환되는 형광 염료를 적용하여 세포 건강과 세포 사멸을 동시에 정량화합니다. 이미지 캡처는 며칠에 걸쳐 일정한 시간 간격으로 발생하도록 사용자 지정할 수 있습니다. 사용자는 개별 Z 평면 이미지 또는 여러 초점면의 연속 이미지의 Z 프로젝션에서 약물 효과를 분석할 수 있습니다. 마스킹을 사용하여 PDO 번호, 면적 및 형광 강도와 같은 특정 관심 파라미터를 계산합니다. 당사는 세포 독성 물질이 세포 건강, 세포 사멸 및 생존력에 미치는 영향을 입증하는 개념 증명 데이터를 제공합니다. 이 자동화된 키네틱 이미징 플랫폼은 암의 PDO 모델에서 다양한 치료 효과를 이해하기 위해 다른 표현형 판독으로 확장될 수 있습니다.

서론

환자 유래 종양 오가노이드(PDO)는 암 발생 및 치료 반응을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 빠르게 부상하고 있습니다. PDO는 원발성 종양 1,2의 복잡한 게놈 프로필과 구조를 재현하는 3차원(3D) 세포 배양 시스템입니다. 불멸화된 암 세포주의 전통적인 2차원(2D) 배양과 달리, PDO는 종양 내 이질성 3,4을 포착하고 유지하므로 기계론적 연구와 중개 연구 모두에 유용한 도구입니다. PDO가 점점 더 대중화된 모델 시스템이 되고 있지만, PDO 배양과 호환되는 세포 효과에 대한 상업적으로 이용 가능한 시약 및 분석 방법은 제한적입니다.

치료 반응의 미묘한 변화를 분석할 수 있는 강력한 방법이 없기 때문에 임상 번역이 방해를 받습니다. 3D 배양에서 최고의 세포 건강 시약인 CellTiter-Glo 3D는 ATP 수준을 세포 생존율의 결정 요인으로 활용합니다 5,6. 이 시약은 종말점 분석에 유용하지만 몇 가지 주의 사항이 있으며, 특히 분석 완료 후 다른 목적으로 샘플을 사용할 수 없다는 점이 가장 두드러집니다.

살아있는 세포 이미징은 형광 시약과 결합할 때 세포사멸 7,8,9 및 세포 독성10을 포함하여 PDO 모델 내에서 다양한 세포 건강 판독값을 정량화할 수 있는 정교한 형태의 키네틱 현미경입니다. 실제로, 살아있는 세포 이미징은 2D 플랫폼에서 화합물의 고처리량 스크리닝에 필수적이었습니다11,12. Incucyte와 같은 시스템은 기술을 저렴하게 만들어 다양한 환경에서 연구 그룹에 액세스할 수 있도록 했습니다. 그러나 3D 배양을 분석하기 위한 이러한 시스템의 적용은 아직 초기 단계에 있습니다.

여기에서는 다중 생세포 이미징을 사용하여 암의 PDO 모델에서 약물 반응을 평가하는 방법을 설명합니다(그림 1). 명시야 이미지 분석을 통해 PDO 크기 및 형태 변화를 운동학적으로 모니터링할 수 있습니다. 또한 세포 사멸을 위한 Annexin V Red Dye 및 세포 독성을 위한 Cytotox Green Dye와 같은 형광 시약을 사용하여 시간 경과에 따라 세포 과정을 동시에 정량화할 수 있습니다. 제시된 분석법은 Cytation 5 live-cell imaging system에 최적화되어 있지만, 이 프로토콜은 다양한 live-cell imaging 플랫폼에 적용될 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

인간 종양 표본을 사용한 연구는 아이오와 대학교 IRB(Institutional Review Board), 프로토콜 #201809807의 검토 및 승인을 받았으며 1964년 헬싱키 선언 및 이후 개정안에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 연구에 참여한 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 포함 기준에는 암 진단과 종양 표본의 가용성이 포함됩니다.

1. 96웰 플레이트에 온전한 PDO 도금

  1. 시약을 준비합니다.
    1. 96웰 플레이트를 37°C에서 밤새 예열하고 BME를 4°C에서 밤새 해동합니다.
    2. 관심 있는 암 유형 배양에 최적화된 전체 오가노이드 배양 배지를 준비합니다. 본원에 제시된 실험에 사용되는 특정 배양 배지는 보충 표 1에 나와 있다.
      참고: 종양 유형에 따라 미디어 구성 요소를 수정해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 오가노이드 배양 배지는 부인과 종양에 대해 100nM 에스트라디올로 보충된다13. 준비된 배지는 4°C에서 1개월 동안 안정적입니다. 장기 보관을 위해 배지를 50mL 튜브에 분주하고 -20°C에서 보관합니다.
  2. 4°C 및 37°C에서 오가노이드 배양 배지의 두 가지 부분 표본을 준비합니다. 예를 들어, 60웰을 96웰 플레이트에 도금하는 경우 따뜻한 오가노이드 배양 배지 6mL와 얼음처럼 차가운 오가노이드 배양 배지 150μL를 사용합니다.
  3. 오가노이드 세척 완충액 준비: 10mM HEPES, 1x Glutamax, 5mM EDTA 및 10μM Y-27632로 1x PBS를 보충합니다. 4 °C에서 보관
  4. 24웰 플레이트에서 배양된 PDO를 수확합니다. 달리 명시되지 않는 한 얼음 위나 4°C에서 모든 단계를 수행하십시오.
    1. 진공 라인 시스템을 사용하여 각 웰에서 매체를 흡입합니다.
    2. 500 μL의 얼음처럼 차가운 오가노이드 세척 버퍼를 추가하고 1000 μL 피펫터를 사용하여 2-3배 부드럽게 피펫팅합니다. 접시를 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    3. 각 웰의 내용물을 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 모든 PDO가 현탁액에 있는지 확인하려면 추가로 300μL의 오가노이드 세척 완충액으로 각각을 잘 헹구고 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 350 x g 에서 5분 동안 원심분리기
    4. 진공 라인 시스템을 사용하여 BME/오가노이드 펠릿에서 상층액을 흡입하고 튜브에 ~ 5mL를 남깁니다. 20mL의 오가노이드 세척 완충액을 추가하고 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    5. 4°C의 350 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. PDO 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 진공 라인 시스템으로 상층액을 흡입합니다.
  5. 96웰 플레이트에 PDO 도금: 달리 명시되지 않는 한 얼음 위에서 모든 단계를 수행합니다.
    1. PDO 펠릿을 적절한 양의 얼음처럼 차가운 오가노이드 배양 배지에 재현탁시켜 PDO 현탁액을 생성합니다. PDO 현탁액을 얼음처럼 차가운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      참고: 오가노이드 배양 배지의 양을 계산하려면 PDO가 오가노이드 배양 배지와 BME의 1:1 비율로 5μL 돔에 도금된다는 점을 고려하여 96웰 플레이트에 도금할 웰 수를 결정합니다. 예를 들어, 하나의 96웰 플레이트를 도금하고 내부 60웰만 사용할 때 필요한 PDO 현탁액의 총량은 300μL(150μL 오가노이드 배양 배지 및 150μL BME)입니다. 서로 다른 BME 비율에서 최적의 성장을 보이는 모델의 경우 이 단계에서 BME: 배지의 비율이 수정될 수 있지만 각 특정 모델에 대한 모든 분석에서 비율을 표준화하는 것이 중요합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 각 구성 요소에 10%의 부피를 추가하십시오.
    2. PDO 수를 계산합니다.
      1. PDO 현탁액 2.5μL를 얼음처럼 차가운 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮기고 2.5μL의 BME와 혼합합니다. 5μL 혼합물을 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 옮깁니다. 슬라이드를 덮지 마십시오. 혼합물은 돔으로 응고됩니다.
      2. 명시야 현미경을 사용하여 4x로 시각화합니다. 5μL 혼합물의 PDO 수를 계산합니다. 목표는 5 μL 돔 당 약 25-50 개의 PDO를 갖는 것입니다.
        참고: 테스트 혼합물에서 원하는 밀도에 도달하지 못한 경우 오가노이드 배양 배지를 더 추가하거나 PDO 현탁액을 원심분리하고 PDO 펠릿을 더 적은 부피의 얼음처럼 차가운 오가노이드 배양 배지에 다시 현탁시켜 PDO 현탁액의 최종 부피를 조정합니다. 이 단계에서 PDO 서스펜션이 어떻게 수정되는지에 관계없이 BME의 최종 비율: 1.5.3단계의 PDO 서스펜션. 1:1이어야 합니다.
    3. 넓은 보어 팁이 있는 200μL 피펫터를 사용하여 PDO 현탁액과 동일한 양의 BME를 조심스럽게 혼합하여 오가노이드 배양 배지와 BME의 1:1 비율을 달성합니다. 돔의 무결성을 방해하는 기포를 피하십시오.
    4. 20μL 피펫터를 사용하여 예열된 96웰 플레이트의 각 웰 중앙에 5μL 돔을 파종하고 내부 60웰만 파종합니다. PDO의 균등한 분포를 보장하기 위해 직경이 넓은 팁이 있는 200μL 피펫터로 1.5mL 튜브의 내용물을 주기적으로 피펫팅합니다.
    5. 모든 우물에 씨를 뿌린 후 접시에 뚜껑을 놓고 부드럽게 뒤집습니다. 거꾸로 된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양하여 돔이 응고되도록 합니다.
      참고: 플레이트를 뒤집으면 BME/오가노이드 배양 배지 돔이 3D 구조를 유지하여 PDO 형성을 위한 적절한 공간을 제공합니다.
    6. 접시를 뒤집어 뚜껑을 덮고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.

2. 멀티플렉싱을 위한 형광 염료의 처리 및 첨가

  1. BME 돔이 96웰 플레이트에서 응고되는 동안 형광 라이브 셀 이미징 시약의 희석액을 준비합니다. Annexin V Red Dye 및 Cytotox Green Dye를 멀티플렉싱하기 위한 특정 파라미터가 본원에 주어진다.
  2. 형광 시약 준비(-1일): 각 웰이 100μL의 염료 주입 배지로 처리된다고 가정하고 처리할 웰 수를 기준으로 오가노이드 배양 배지의 적절한 부피를 계산합니다. 예열된 오가노이드 배양 배지에서 염료를 원하는 농도로 희석합니다.
    참고: 필요한 용지의 총량은 실험에 따라 다릅니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 최종 부피에 10%를 추가합니다. 예를 들어, 96웰 플레이트의 내부 60웰을 처리하려면 6.6mL의 염료 주입 배지를 준비합니다(표 1).
  3. 100μL의 2x 염료 투여 오가노이드 배양 배지로 각각을 잘 처리합니다. 200μL의 멸균 1x PBS를 플레이트의 외부 빈 웰에 추가합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    알림: 주변 웰의 PBS는 내부 웰에서 매체의 증발을 감소시킵니다.
  4. 약물/처리제 추가(0일): 웰당 100μL의 부피로 2배 농도로 예열된 오가노이드 배양 배지에서 약물을 준비합니다.
    참고: DMSO는 고농도의 세포에 독성이 있을 수 있습니다. 이 연구에서 수행된 실험에서 0.1% DMSO의 농도는 초과되지 않습니다. 약물 외에도 일부 형광 시약은 DMSO 용액으로 배포됩니다. 이러한 시약으로 작업할 때 총 DMSO 농도를 고려하는 것이 중요합니다.
  5. 각 웰에 100μL의 2x 염료 주입 배지를 추가합니다. 거품을 만들지 마십시오.

3. 이미징 파라미터 설정

  1. Cytation 5에 플레이트를 놓습니다. 열다 Gen5 소프트웨어. 새 작업 > Imager Manual Mode(이미저 수동 모드)를 클릭합니다. 지금 캡처를 선택하고 다음 설정을 입력합니다: 대물렌즈(원하는 배율 선택); 필터(마이크로플레이트 선택); 마이크로플레이트 형식(웰 수 선택); 및 용기 유형(플레이트 유형 선택). 뚜껑 사용 및 느린 이동통신사 속도 사용을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
    참고: 용기 유형: 플레이트에 대한 정보를 선택할 때 가능한 한 구체적으로 작성해야 하는데, 이는 소프트웨어가 플라스틱의 각 플레이트 유형 및 두께에 대해 대물렌즈에서 플레이트 바닥까지의 특정 거리로 보정되기 때문입니다.
    느린 캐리어 속도: 플레이트를 로드/언로딩할 때 돔이 중단되지 않도록 하려면 이 상자를 선택합니다.
  2. 전체 BME 돔을 이미지화할 Z-Stack을 만듭니다.
    1. 보려는 관심 웰을 선택합니다(왼쪽 패널, 히스토그램 아래).
    2. Bright Field(명시야) 채널(왼쪽 패널, 상단)을 선택합니다. 자동 노출을 클릭하고 필요에 따라 설정을 조정합니다.
    3. Z-Stack의 하단과 상단을 설정합니다. 이미징 모드 탭(왼쪽 패널, 가운데)을 확장합니다. Z-Stack 상자를 선택합니다. 코스 조정 화살표(왼쪽 패널, 가운데)를 사용하여 모든 PDO가 초점이 맞지 않고 흐릿해질 때까지 아래쪽 조정을 클릭합니다. 이것을 Z-Stack의 맨 아래로 설정합니다. 코스 조정 화살표를 사용하여 반대 방향으로 반복하여 Z-Stack의 상단을 설정합니다.
    4. Z-스택 설정이 관심 있는 다른 웰에 적합한지 확인하려면 다른 웰(왼쪽 패널, 히스토그램 아래)을 선택하고 Z-스택의 상단과 하단을 시각화합니다.
    5. 초점 위치를 수동으로 입력하려면 미세 조정(왼쪽 패널, 상단) 옆에 있는 세 개의 점을 클릭합니다. 창이 열립니다. 맨 위 Z-Stack 값(왼쪽 패널 중앙, 이미징 모드 아래에 있음)을 입력합니다. 맨 아래 Z-스택 값에 대해 반복합니다. 필요에 따라 3.2.3단계를 반복하여 원하는 Z 범위를 캡처하도록 조정합니다. 조정이 필요한 경우 다른 웰을 선택하여 설정을 확인합니다.
  3. 형광 채널의 노출 설정을 지정합니다. 설정은 두 개의 형광 채널(GFP 및 TRITC)에 대해 설명되어 있습니다. 형광 채널의 구체적인 수는 실험과 살아있는 세포 이미징 시스템에 설치된 형광 큐브에 따라 다릅니다.
    알림: 실험이 끝날 때 신호 강도가 상당히 높을 것으로 예상되는 경우 사용자는 실험이 끝날 때 초기 매개변수를 설정할 때 적용할 수 있는 최적의 노출 설정을 결정하기 위해 테스트 실험을 수행하는 것을 고려해야 합니다.
    1. 이미징 모드 탭(왼쪽 패널, 가운데)을 확장하고 이미징 단계 편집을 엽니다. 팝업 창이 나타납니다.
    2. 채널에서 원하는 채널 수에 대한 풍선을 클릭합니다. 명시야에 대해 하나의 채널을 지정하고 각 형광 채널에 대해 추가 채널을 지정합니다. 이 예에서 채널 1 = Bright Field; 채널 2 = GFP; 채널 3 = TRITC. 색상 드롭다운 메뉴를 사용하여 각 채널에 적합한 설정을 선택합니다. [확인]을 클릭하여 편집 창을 닫습니다.
    3. 각 형광등 채널을 설정합니다.
      1. 채널을 GFP(왼쪽 패널, 상단)로 전환합니다.
      2. 자동 노출(왼쪽 패널, 상단)을 클릭합니다. 노출 탭(왼쪽 패널, 가운데)을 확장하고 노출 설정을 조정하여 배경 신호를 최소화합니다.
      3. 3.3.3.3-3.3.3.6 단계에 따라 노출 설정을 이미지 모드 탭에 복사합니다.
      4. 이미징 단계 편집(Edit Imaging Step) 상자 옆에 있는 복사(Copy) 아이콘을 클릭합니다. 이미징 단계 편집을 클릭하면 다른 창이 열립니다.
      5. GFP 채널 아래의 노출 라인에서 클립보드 아이콘을 클릭하여 조명, 통합 시간 및 카메라 게인 설정을 채널에 추가합니다.
      6. TRITC 채널에 대해 3.3.3.4-3.3.3.5단계를 반복합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
  4. 이미지 전처리 및 Z-투영 단계를 설정하여 이미지 전처리를 자동화합니다.
    1. 카메라 아이콘(왼쪽 패널, 하단 모서리)을 클릭합니다. 새 창이 열립니다.
    2. Add Processing Step(처리 단계 추가)(왼쪽 패널, 하단)에서 Image Preprocessing(이미지 전처리)을 클릭합니다. 새 창이 열립니다.
    3. [Bright Field] 탭에서 [Apply Image Preprocessing]을 선택 취소합니다.
    4. 각 형광 채널(Fluorescent Channel ) 탭에서 이미지 사전 처리 적용(Apply Image Preprocessing )이 선택되어 있는지 확인합니다. [채널 1과 동일한 옵션 사용]을 선택 취소하고 [확인]을 클릭합니다. 창이 닫힙니다.
    5. 처리 단계 추가(Add Processing Step)에서 Z 투영(Z Projection)을 클릭합니다. 새 창이 열립니다. 원하는 경우 슬라이스 범위를 조정합니다(예: Z 범위 좁히기). 확인을 선택하여 창을 닫습니다.
  5. 프로토콜을 만듭니다.
    1. 도구 모음에서 이미지 세트를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 Create experiment from this image set(이 이미지 세트에서 실험 만들기)를 클릭합니다. 이미징 창이 닫히고 절차 창이 열립니다.
      알림: Imager Manual Mode 에서 선택한 매개변수는 자동으로 새 창에 로드되어 실험 프로토콜을 생성할 수 있습니다.
    2. 온도 및 기울기 설정하기: 동작 머리말(왼쪽) 아래에서 온도 설정을 클릭하십시오. 새 창이 열립니다. Incubator On(인큐베이터 켜기)을 선택하고 Temperature(온도)에 원하는 온도를 수동으로 입력합니다. 그런 다음 그라데이션에서 수동으로 1을 입력합니다. 확인을 선택하여 창을 닫습니다.
      알림: 1°C 기울기를 생성하면 플레이트 뚜껑에 결로가 형성되는 것을 방지할 수 있습니다.
    3. 이미지에 웰을 지정합니다.
      1. Description(설명)에서 Image Step(이미지 단계)을 두 번 클릭합니다. 전체 플레이트(오른쪽 모서리, 상단)를 클릭합니다. 그러면 플레이트 레이아웃 창이 열립니다.
      2. 커서를 사용하여 관심 있는 우물을 강조 표시합니다. 확인을 클릭합니다. 원하는 경우 Autofocus Binning 및 Capture Binning 상자를 선택합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
        알림: 비닝은 위의 3.3.3.2단계에서 설명한 대로 노출 조정이 필요합니다. 이 기능을 사용할 수 있는 특정 시나리오에 대해서는 토론 섹션을 참조하십시오.
    4. 키네틱 이미징의 간격을 설정합니다.
      1. Other(기타) 제목 아래에 있는 Options(옵션)를 클릭합니다(왼쪽). 불연속 운동 절차(Discontinuous Kinetic Procedure) 상자를 선택합니다.
      2. 예상 총 시간에 실험의 실행 시간(예: 5일)을 입력합니다. Estimated Interval(예상 간격)에 플레이트를 이미지화할 간격(예: 6시간마다)을 입력합니다.
      3. 각 실행 후 일시 중지를 클릭하여 플레이트가 인큐베이터로 옮겨질 시간을 허용합니다. 확인을 선택하여 창을 닫습니다.
    5. 데이터 축소 단계를 업데이트합니다.
      1. OK(확인)를 클릭하여 Procedure Window(절차 창)를 닫습니다. 데이터 축소 단계를 업데이트할 수 있는 탭이 열립니다. 예를 선택합니다. Image Preprocessing(이미지 전처리)을 두 번 클릭합니다. 다른 채널을 클릭하여 설정을 확인하고 확인을 클릭합니다.
      2. Z 투영을 두 번 클릭합니다. 다른 채널을 클릭하여 설정을 확인합니다. 확인을 클릭합니다. 그런 다음 확인을 다시 클릭하여 데이터 축소 창을 닫습니다.
    6. 플레이트 레이아웃의 서식을 지정합니다.
      1. 플레이트 레이아웃 마법사를 열고 3.6.2-3.6.3단계에 따라 웰 유형을 지정합니다.
      2. 도구 모음(왼쪽 모서리, 상단)에서 플레이트 레이아웃 아이콘을 클릭하여 플레이트 레이아웃 마법사를 엽니다.
      3. 실험에 사용된 웰 유형 옆에 있는 상자를 선택합니다. Assay Controls(분석 제어)에서 화살표를 사용하여 다양한 제어 유형의 수를 입력합니다. Next(다음 )를 클릭하여 Assay Control #1 창을 엽니다.
      4. 3.6.5-3.6.8 단계에 따라 분석 제어 웰 조건을 설정합니다.
      5. Assay Control #1 창에서 플레이트 레이아웃 ID(Plate Layout ID) 상자에 컨트롤 라벨을 입력합니다. 원하는 경우 옆에 있는 상자에 전체 이름을 입력합니다. 화살표를 사용하여 각 제어 조건에 대한 반복실험 횟수를 선택합니다.
      6. 제어 내에서 여러 농도 또는 희석 시리즈를 사용하는 경우 희석/농도 정의를 클릭하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 유형을 선택합니다. 표의 각 농도/희석에 대한 값을 입력합니다.
        알림: 농도가 일정한 증분으로 변하는 경우 자동 기능을 사용할 수 있습니다.
      7. 도구 모음에서 색상 탭을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 원하는 텍스트 색상과 제어할 배경색을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
      8. 추가 컨트롤을 사용하여 필요에 따라 반복합니다.
      9. 설정 샘플 웰 조건 3.6.10-3.6.12에 따릅니다.
      10. Sample Setup(샘플 설정) 페이지에서 샘플 ID 접두사(예: SPL)를 입력합니다. 화살표를 사용하여 반복실험 횟수를 선택합니다. 처리 농도가 다양한 시료를 사용하는 경우 유형 드롭다운 메뉴에서 농도 또는 희석을 선택합니다. 표에 희석/농도를 입력하고 단위 상자에 단위를 입력합니다.
      11. 도구 모음에서 Identification Fields(식별 필드 )를 선택합니다. 표에 원하는 범주 이름 (예: 샘플 ID, 약물)을 입력합니다.
      12. 도구 모음에서 색상 탭을 선택합니다. 각 처리 그룹/샘플에 대해 다른 색상을 선택합니다. Finish(마침)를 클릭합니다. 그러면 플레이트 레이아웃 페이지가 열립니다.
        알림: 왼쪽의 숫자는 다른 샘플 번호와 관련이 있습니다.
      13. 3.6.14-3.6.16단계에 따라 샘플 ID를 할당합니다.
      14. 고르다 왼쪽 패널의 SPL1. 커서를 사용하여 우물을 선택합니다.
        참고: 자동 선택 도구는 직렬 할당 상자에서 조정할 수 있습니다. 반복실험 횟수와 레이아웃의 방향을 미리 지정할 수 있습니다.
      15. 다른 샘플로 반복하여 플레이트 레이아웃을 완성합니다. 만족스러우면 확인을 클릭합니다 .
      16. 파일 도구 모음에서 샘플 ID를 선택합니다. Sample ID 열에 각 샘플에 대한 적절한 정보(예: 약물 유형)를 입력합니다. OK를 누릅니다.
    7. 프로토콜을 저장합니다.
      1. 도구 모음에서 File( 파일 ) > Save Protocol as(다른 이름으로 프로토콜 저장)를 클릭합니다. 파일을 저장할 위치를 선택합니다. 파일 이름을 입력합니다. Save(저장 )를 클릭하여 창을 닫습니다.
      2. 도구 모음에서 File(파일) > Exit(종료 )를 클릭합니다. Imager Manual Mode 에 대한 변경 사항을 저장할 수 있는 탭이 열립니다. 아니요를 선택합니다.
      3. 실험 1에 대한 변경 사항을 저장할 수 있는 탭이 열립니다. 아니요를 선택합니다. 프로토콜 정의를 업데이트하기 위한 탭이 열립니다. 업데이트를 선택합니다. 소프트웨어를 닫습니다.
  6. 프로토콜을 BioSpa OnDemand로 가져오고 실험 설정을 완료합니다.
    1. BioSpa OnDemand(스케줄링 소프트웨어) 소프트웨어를 엽니다.
    2. 소프트웨어에서 사용 가능한 슬롯을 선택합니다.
    3. 살아있는 세포 이미징 시스템에서 플레이트를 제거합니다. 서랍 열기 를 클릭하여 스케줄링 소프트웨어의 해당 슬롯에 액세스하고 플레이트를 삽입합니다. [서랍 닫기]를 클릭합니다.
      참고: 이 단계는 위의 3.5.7단계에서 프로토콜을 만든 후 언제든지 수행할 수 있습니다. 그러나 플레이트는 아래 단계 5에서 타이밍 실행을 수행하기 위해 Cytation 3.6.4.3에 있어야 합니다.
    4. 프로토콜을 가져옵니다.
      1. Procedure Info(절차 정보) 탭의 드롭다운 메뉴에서 User(사용자)를 선택합니다. Protocol(프로토콜) 슬롯 옆에 있는 Select > Add a new entry(새 항목 추가)를 클릭합니다.
      2. Protocol(프로토콜) 슬롯 옆에 있는 Select(선택)를 클릭합니다. 그러면 파일 아키텍처에서 원하는 프로토콜로 이동할 수 있는 새 창이 열립니다. Open(열기 )을 클릭하여 프로토콜을 스케줄링 소프트웨어로 가져옵니다.
      3. 플레이트를 이미지화하는 데 필요한 시간을 입력합니다. 확인을 클릭하여 Gen5 프로토콜 목록 창을 닫습니다.
        참고: 이 단계는 한 번에 여러 실험을 실행할 때 특히 중요합니다. 이미지를 만드는 데 필요한 시간을 결정하려면 지금 타이밍 실행 수행을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
    5. 이미징 간격을 설정하고 실험을 예약합니다.
      1. 간격(Interval)에 3.5.4단계에서 지정한 이미징 간격을 입력합니다.
      2. Start Time Options(시작 시간 옵션)에서 When Available(사용 가능한 경우)을 선택합니다. 기간(Duration)에서 고정(Fixed) 또는 연속(Continuous)을 선택합니다.
        참고: 사용 가능한 다음 시간에 프로토콜을 실행하는 대신 특정 시작 시간을 지정할 수 있습니다. 고정 기간을 선택하면 실험에 대한 특정 엔드포인트가 설정되며 사용자가 실험 기간을 지정해야 합니다. 연속 기간을 사용하면 끝점 없이 실험을 실행할 수 있으며 사용자가 실험을 중지해야만 종료할 수 있습니다.
      3. 플레이트/베슬 예약(Schedule Plate/Vessel)을 클릭합니다. 그러면 플레이트 검증 시퀀스(Plate Validation Sequence) 가 열립니다. 제안된 첫 번째 읽기 시간과 함께 탭이 열립니다. Yes(예)를 클릭하여 이 일정을 수락합니다.

4. Gen5 소프트웨어의 이미지 분석 (그림 2)

  1. 이미지 분석 모듈을 엽니다.
    1. Gen5를 엽니다. Task Manager(작업 관리자)에서 Experiments(실험) > Open(열기)을 선택합니다. 실험을 선택하여 파일을 엽니다. 도구 모음에서 플레이트 > 뷰(Plate View)를 클릭합니다.
    2. 데이터 드롭다운 메뉴를 Z 투영으로 변경합니다. 관심 있는 우물을 두 번 클릭합니다. 새 이미지 분석 데이터 축소 단계를 설정하려는 > 분석을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
  2. 세포 분석
    1. 기본 마스크
      1. Analysis Settings(분석 설정)에서 Type: Cellular Analysis and Detection Channel: ZProj[Tsf[Bright Field]](왼쪽 패널, 중앙)를 선택합니다.
      2. 옵션을 클릭합니다. 그러면 Primary Mask and Count 페이지가 열립니다. Threshold(임계값) 상자에서 Auto(자동)를 선택하고 Apply(적용)를 클릭합니다. 객체 강조 표시 상자(오른쪽 패널, 하단)를 클릭하여 지정된 임계값 내에 있는 객체를 표시합니다. 관심 있는 개체를 포함하도록 필요에 따라 조정합니다.
        참고: 임계값 설정은 픽셀 강도를 기반으로 합니다. 예를 들어 임계값을 5000으로 설정하면 강도가 5000보다 큰 픽셀이 분석에 포함됩니다.
      3. 객체 선택에서 최소 및 최대 객체 크기(μm)를 지정합니다. 세포 파편/단일 세포를 제외하도록 필요에 따라 조정합니다.
        알림: PDO 크기는 모델 및 유형에 따라 크게 다를 수 있습니다. Gen5 소프트웨어의 측정 도구를 사용하여 각 모델의 최소 및 최대 PDO 크기 임계값을 결정합니다. 사용자는 약물 처리 후 이후 시점에서 PDO 단편이 배제되는 것을 방지하기 위해 측정 도구에서 제공하는 값에 비해 더 작은 최소 PDO 크기 임계값을 선택할 수 있습니다.
      4. 분석을 웰의 특정 영역으로 제한하려면 [전체 이미지 분석] 을 선택 취소하고 [플러그]를 클릭합니다. 이미지 플러그 창에서 드롭다운 메뉴를 사용하여 플러그 모양을 선택합니다. 관심 영역에 맞게 필요에 따라 크기 및 위치 매개변수를 조정합니다.
        알림: 플러그 내의 PDO 수를 최대화하는 동시에 배경을 최소화하기 위해 PDO 없는 영역을 제외하는 것이 중요합니다. 반복실험에서 관심 객체의 대부분을 일관되게 캡처할 수 있는 플러그 크기를 지정합니다. 돔의 가장자리를 제외하는 플러그를 생성하는 것은 가장자리 주변의 돔의 극단적인 곡률에서 빛의 굴절로 인해 왜곡되어 나타날 수 있는 물체를 제외하기 때문에 중요합니다. 기본 에지 오브젝트 포함 을 선택 취소하여 플러그 내의 전체 PDO만 캡처할 수도 있습니다.
    2. 하위 모집단 분석. 하위 모집단 지정의 예가 그림 3에 나와 있습니다.
      1. Cellular Analysis(세포 분석) 도구 모음에서 Calculated Metrics(계산된 메트릭)를 클릭합니다. 관심 있는 개체 수준 메트릭 선택 또는 만들기(오른쪽 모서리, 하단)를 클릭합니다. Available Object metrics(사용 가능한 개체 메트릭)에서 관심 있는 메트릭(예: 순환성)을 선택하고 Insert(삽입) 버튼을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
        참고: 각 PDO 모델의 형태와 밀도는 하위 모집단을 구별하는 데 가장 적합한 메트릭을 결정합니다.
      2. Cellular Analysis(세포 분석) 도구 모음에서 Subpopulation Analysis(하위 집단 분석)를 클릭합니다. 추가를 클릭하여 새 하위 모집단을 만듭니다. 팝업 창이 열립니다.
      3. 원하는 경우 하위 모집단의 이름을 입력합니다. Object Metrics(개체 메트릭)에서 관심 있는 메트릭을 선택하고 Add Condition(조건 추가)을 누릅니다. Edit Condition(조건 편집 ) 창에서 선택한 Object Metric(객체 메트릭)에 대한 파라미터를 입력합니다. 필요에 따라 추가 메트릭을 사용하여 반복합니다.
        알림: 매개변수는 수동으로 조정하거나 파인더 도구를 사용하여 설정할 수 있습니다. 예를 들어, 파편을 제외하기 위해 사용자는 면적을 객체 메트릭으로 추가하고 800보다 작은 객체를 선택할 수 있습니다. 개체 메트릭으로서의 원형도는 일상적으로 사용되며 모델에 따라 원형도가 0.2-0.5보다 큰 모든 개체가 포함됩니다.
      4. 창 하단의 표에서 표시할 결과를 확인합니다. OK(확인) > Apply(적용)를 클릭합니다.
      5. 하위 모집단 내의 개체를 보려면 개체 세부 정보 드롭다운 메뉴(오른쪽 패널, 가운데)를 사용하여 하위 모집단을 선택합니다. 매개변수에 속하는 개체는 이미지에서 강조 표시됩니다.
        참고: 기본 마스크와 하위 모집단의 강조 색상을 변경하려면 설정(오른쪽 패널, 하단)을 클릭합니다.
      6. 부분인구 파라미터를 조정하려면 Cellular Analysis(세포 분석) 도구 모음에서 Subpopulation Analysis(부분인구 분석) 창을 다시 엽니다. 하위 모집단을 선택하고 편집을 클릭합니다. 단계 추가를 클릭합니다.
        참고: 이렇게 하면 모든 시점에서 실험 내의 모든 웰에 동일한 분석이 적용됩니다. 매트릭스 페이지의 드롭다운 메뉴에서 개별 보기에 대해 다른 메트릭을 선택할 수 있습니다.

5. Gen5에서 Excel로 데이터 내보내기

  1. 내보낼 데이터 파일을 사용자 정의하려면 도구 모음에서 Report/Export Builders 아이콘을 선택합니다. 팝업 창에서 Excel로 새로 내보내기를 클릭합니다.
  2. 팝업 창의 Properties 페이지에서 Scope > Plate 및 Content > Custom을 선택합니다. 도구 모음에서 Content 옵션을 클릭합니다. 템플릿 편집을 클릭하면 Excel 프로그램이 열립니다.
  3. 스프레드시트 내에서 추가 기능 > Table > Well Data를 선택합니다. 다양한 선택 항목 위로 마우스를 가져가면 내보내기 옵션을 볼 수 있습니다. 관심 있는 메트릭(예: Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]])을 선택합니다.
    참고: 플레이트 레이아웃은 Add-ins(추가 기능) > Protocol Summary(프로토콜 요약) > Layout(레이아웃)을 선택하여 스프레드시트 분석 템플릿에 추가할 수 있습니다.
  4. 편집 창이 열립니다. 웰(Wells) 상자에서 내보낼 웰을 Well-ID 또는 Well #으로 지정합니다. 확인을 선택합니다. 템플릿이 스프레드시트 파일에 로드됩니다. 스프레드시트를 닫습니다. 템플릿이 자동으로 저장됩니다.
  5. Excel로 새 내보내기 창에서 확인을 클릭하고 보고서/내보내기 빌더 창을 닫습니다.
  6. Gen5 도구 모음에서 내보내기 아이콘을 클릭합니다. 원하는 내보내기 파일 옆에 있는 상자를 선택합니다. 확인을 클릭합니다. Gen5는 스프레드시트 템플릿을 자동으로 채우고 Excel에서 파일을 엽니다.

6. 외부 데이터 분석

  1. Excel에서 내보내기 파일(.xlsx)을 엽니다.
  2. 각 웰에 대해 각 개별 값을 해당 웰의 0:00 시점 값으로 나눕니다. 이렇게 하면 시점 0이 1로 설정되고 그 이후의 각 값은 초기 판독값을 기준으로 합니다.
  3. 데이터 분석 소프트웨어에서 새 파일을 엽니다. XY 배치 옵션을 선택합니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 GraphPad Prism(버전 9.5.1)이 사용되었습니다.
  4. 각 데이터 그룹에 대한 입력 레이블입니다. 각 처리 그룹에 대한 시간 점과 해당 정규화 값을 복사하여 프리즘 테이블에 붙여넣습니다. 데이터에 대한 그래프가 자동으로 생성되며 그래프에서 찾을 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

우리의 목표는 PDO 치료 반응을 평가하기 위해 다중 라이브 셀 이미징을 사용하는 타당성을 입증하는 것이었습니다. 개념 증명 실험은 자궁내막암의 두 가지 개별 PDO 모델인 ONC-10817 및 ONC-10811에서 수행되었습니다(ONC-10811 데이터는 보충 그림 1 및 보충 그림 2 참조). 세포사멸(Apoptosis, annexin V 염색) 및 세포독성(Cytotox Green uptake)은 세포사멸 유도제인 스타우로스포린(staurosporine)에 반응하여 운동학적으로 모니터링되었습니다. 구체적으로, PDO를 96웰 플레이트에 도말하고, Annexin V Red 및 Cytotox Green 염료로 처리하고, 그림 1의 다이어그램과 같이 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 배치했습니다. 두 개의 독립적인 PDO 모델에서 Annexin V 및 Cytotox Green 염료를 사용한 처리가 독성이 없음을 확인...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

PDO 배양은 세포 반응과 거동을 반영할 수 있는 능력으로 인해 체외 모델 시스템에서 점점 더 인기를 얻고 있다2. PDO 생성, 배양 및 확장 기술에서 상당한 발전이 이루어졌지만 치료 반응을 분석하는 방법은 뒤처져 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 3D 생존도 키트는 용해 종말점 분석으로, 잠재적으로 가치 있는 역학 반응 데이터를 놓치고 다른 방법에 의한 후속 분석을 제한한다8. 새로운 연구에서는 PDO 모델에서 약물 반응을 평가하기 위해 라이브 셀 이미징을 적용하고 있습니다. 여기에서는 다중 형광 생세포 이미징을 활용하여 시간 경과에 따른 PDO 치료 반응을 평가하는 방법을 제시합니다. 형광 염료를 다중화하면 서로 다른 세포 반응을 동시에 정량화할 수 있습니다. 세포사멸 및 세포독성 외에도 이 접근법은 PDO의 다른 표현형 효과를 조사하기 위해 향후 연구에서 확장될 수 있을 것으로 예상합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

KWT는 Immortagen Inc.의 공동 소유주이며, CJD는 애질런트의 직원입니다. JSdB는 Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo 및 Vertex Pharmaceuticals로부터 자문 위원회에서 활동하며 수수료를 받았습니다. AZ, 아스텔라스, 바이엘, 셀센트릭, 다이이치, 제넨테크, 젠맙, GSK, 얀센, 머크 세로노, MSD, 메나리니/실리콘 바이오시스템즈, 오리온, 사노피 아벤티스, 시에라 온콜로지, 타이호, 화이자, 버텍스로부터 연구 연구에 대한 자금 지원 또는 기타 지원을 받은 암 연구소(ICR)의 직원이며, DNA 복구 결함 암에서 아비라테론, PARP 억제에 상업적 관심을 가지고 있습니다. 및 PI3K/AKT 경로 억제제(개인 소득 없음); 코르티코스테로이드와 함께 아비라테론 아세테이트의 사용을 다루는 Janssen이 제출한 특허 8 822 438에 대한 재정적 이해관계가 없는 발명자로 지명되었습니다. 많은 업계 후원 임상 시험의 CI/PI였습니다. 미국 국립보건연구소(NIHR) 선임 연구원입니다. 다른 저자는 공개할 잠재적인 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

환자 종양 표본을 제공해준 아이오와 대학의 조직 조달 코어(Tissue Procurement Core)와 크리스틴 콜먼(Kristen Coleman) 박사, PDO 모델 생성에 도움을 준 산부인과의 소피아 가브릴로비치(Sofia Gabrilovich) 박사에게 감사드립니다. 또한 원고를 비판적으로 분석해 주신 Valerie Salvatico 박사(미국 애질런트)에게도 감사드립니다. 우리는 다음과 같은 자금 출처를 인정합니다 : NIH / NCI CA263783 및 DOD CDMRP CA220729P1 KWT로; 영국 암 연구(Cancer Research UK), 영국 전립선암 협회(Prostate Cancer UK), 전립선암 재단(Prostate Cancer Foundation) 및 의학 연구 위원회(Medical Research Council)에서 JSdB로 이동합니다. 연구비 지원자들은 실험의 설계나 분석, 출판 결정에 아무런 역할도 하지 않았다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Dot Scientific Inc1008113
15 mL 원추형 원심분리기 튜브Sarstedt62.554.100
554 NM LED 큐브애질런트1225012
96-웰 플레이트Corning Costar3596 37도로 예열됨; C
96웰 플레이트Agilent204626-10037°C로 예열됨; C
A83-01Tocris2939최종 농도는 500 nM (오가노이드 배양 배지의 성분)
고급 DMEM/F-12Gibco12634-010오가노이드 배양 배지의 성분
B27 보충제Gibco17504044최종 농도는 1x(유기노이드 배양 배지의 성분)
BioTek BioSpa 8 자동 인큐베이터AgilentBIOSPAG-SN탁상 인큐베이터; BioSpa OnDemand 스케줄링 소프트웨어는 Gen5와 결합하여 이미징을 위해 BioSpa와 Cytation 5 간에 플레이트를 전송합니다(이 프로토콜은 버전 1.01.10 사용)
BioTek Cytation 5 세포 이미징 멀티모드 리더, AgilentCYT5PW-SN플레이트 리더; 이 장치에는 Gen5 소프트웨어가 사용됩니다(이 프로토콜은 버전 3.12.08 사용)
Cultrex UltiMatrix 저성장 인자 기저막 추출물R& D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035DMSO
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2438
EDTA (0.5 M)Thermo FisherAM9260G
ForskolinTocris1099최종 농도는 10 µ입니다. M (오가노이드 배양 배지의 성분)
GlutamaxGibco35050-061최종 농도는 1x (오가노이드 배양 배지의 성분)
HEPESGibco15630-080최종 농도는 10 mM (오가노이드 배양 배지의 성분)
인간 EGF, 동물 무첨가 재조합 단백질GibcoAF-100-15-1MG최종 농도는 0.5 ng/mL (오가노이드 배양 배지의 성분)입니다.
Human FGF-10 Recombinant ProteinGibco100-26-1MG최종 농도는 10ng/mL(오가노이드 배양 배지의 성분)
Human R-Spondin 1 Recombinant ProteinGibco120-38-5UG최종 농도는 250ng/mL(오가노이드 배양 배지의 성분)
Hydrocortisone Stock SolutionStemCell Technologies7926최종 농도는 500ng/mL(오가노이드 배양 배지의 성분)입니다.
이미징 필터 큐브 - GFPAgilent1225101
이미징 필터 큐브 - TRITCAgilent1225125
Imaging LED GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Red DyeSartorius4641오가노이드 배양 배지에서 재구성
Incucyte Cytotox Green DyeSartorius4633DMSO 솔루션
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250최종 농도는 1.25mM(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI 염색 용액Fisher-Scientific133661691:50 부피
추가 NicotinamideSigma-AldrichN0636최종 농도는 10mM(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)
NogginR& D Systems6057-NG최종 농도는 100ng/mL(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122최종 농도는 10 units/mL(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)
인산염 완충 식염수(1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05최종 농도는 100 µ입니다. g/mL (오가노이드 배양 배지의 성분)
재조합 인간 헤레굴린&베타;-1Pepro Tech100-03최종 농도는 37.5 ng/mL (오가노이드 배양 배지의 성분)
스트렙토마이세스 sp.의 스타우로스포린 용액입니다.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000최종 농도는 5 &마이크로입니다. M (오가노이드 배양 배지의 성분)
β -EstradiolSigma-AldrichE2758최종 농도는 100 nM (오가노이드 배양 배지의 성분)입니다.
°

참고문헌

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

환자 유래 오가노이드약물 반응 분석멀티플렉스 이미징오가노이드 약물 스크리닝형광 염료키네틱 이미징Z-스택 이미징세포 사멸 정량 분석세포 표현형 분석
암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.