형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

면역형광은 앨버트 쿤스(Albert Coons)가 처음 개발한 현대 세포 생물학의 초석 기술로, 본래 세포 구획에서 분자를 검출하고 세포 내 세포 소기관 또는 기계의 분자 조성을 특성화할 수 있습니다¹. 유전자 조작과 결합된 면역형광은 단백질 국소화가 그 기능에 필수적이라는 현재 잘 받아들여지고 있는 개념을 확립하는 데 도움이 됩니다². 특정 1차 항체 및 밝은 형광 염료 외에도 이 기술의 성공은 세포 형태를 보존하고 항원을 고정하며 세포 내 구획에 대한 항체의 접근성을 높이는 고정 및 투과화라는 예비 공정에 달려 있습니다. 필연적으로 고정 및 투과화 과정은 세포를 죽이고 모든 생물학적 과정을 종료합니다³. 따라서 면역형광은 단백질의 생애 여정에 대한 스냅샷만 제공합니다. 그러나 세포 이동 및 분열과 같은 많은 생물학적 과정은 본질적으로 동적이므로 공간-시간적으로 분해되는 방식으로 단백질 거동을 조사해야 합니다 ^4,5.

살아있는 유기체의 단백질 역학을 조사하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)⁶ 및 고속 컨포칼 현미경과 같은 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 기반으로 하는 라이브 이미징 방법이 개발되었습니다. 간단히 말해서, 관심있는 단백질은 GFP⁷과 융합되도록 유전적으로 조작 될 수 있으며, cytomegalovirus (CMV) ⁸ 또는 upstream activation sequence (UAS) ⁹와 같은 바이러스 또는 효모 프로모터로부터 ectopically 발현 될 수 있습니다. GFP는 성격에서 autofluorescent 이기 때문에, 아무 형광단도 결합한 항체는 기정 침투성의 예비적인 과정의 필요를 우회하는 표적 단백질의 지방화를 계시하기 위하여 요구되지 않습니다. 지난 20년 동안 전체 파장 스펙트럼에 걸쳐 형광 태그가 개발되어¹⁰ 여러 표적 단백질의 다색 라이브 이미징을 동시에 수행할 수 있습니다. 그러나, AlexaFluor 또는 ATTO와 같은 화학적으로 조작된 형광 염료와 비교하여, 이러한 유전적으로 암호화된 형광 단백질의 자가형광은 내인성 프로모터로부터 발현될 때, 특히 장시간 스케일에 걸친 라이브 이미징 중에 상대적으로 약하고 불안정하다¹⁰. 이러한 결핍은 형광 표지된 표적 단백질을 과발현시킴으로써 완화될 수 있지만, 키나아제 및 인산가수분해효소와 같은 효소 활성을 가진 많은 단백질은 생리학적 수준에서 발현되지 않을 경우 정상적인 생물학적 과정을 심각하게 방해합니다.

이 프로토콜은 실시간 이미지 설정에서 광안정성 항체 기반 표적 조명을 가능하게 하는 방법을 제시하며, 기본적으로 고정 또는 투과화 과정 없이 면역형광을 허용합니다(그림 1). 간단한 NHS 기반 1차 아민 반응⁽¹¹)을 통해 AlexaFluor 488 또는 594와 같은 형광 염료를 본질적으로 모든 1차 항체 또는 GFP/HA/Myc nanobody⁽¹²)와 접합할 수 있습니다. 모든 초파리 배아 세포가 싱크리튬(syncytium) 단계¹³ 동안 공통 세포질을 공유한다는 발달적 특징을 이용하여, 염료 접합 항체를 주입한 후 전체 배아에 걸쳐 항원 결합 및 조명을 달성할 수 있습니다. 초파리(Drosophila ) 및 다른 모델 시스템⁽¹⁴)에서 이용 가능한 내인성 표지 단백질의 라이브러리가 확장됨에 따라, 이 방법은 살아있는 조직에서 저농도 형광 표지 단백질 및 기타 비형광 표지(HA/Myc-표지) 단백질의 역학을 밝혀냄으로써 잠재적으로 이들 라이브러리의 응용을 확대할 수 있다.

실험은 SUSTech University의 생명 과학 대학의 지침 및 승인에 따라 수행되었습니다. 사용된 유기체는 Drosophila melanogaster이며, 유전자형은 Notch-Knockin-GFP(염색체 X) 및 Sqh-sqh-GFP(염색체 II)이며, 각각 Francois Schweisguth 박사(파스퇴르 연구소)와 Jennifer Zallen 박사(슬론 케터링 연구소)의 실험실에서 아낌없이 제공합니다. 이 프로토콜은 주로 항체 표지 및 실시간 이미징의 측면에 초점을 맞추고 있지만, 초파리 배아 수집 및 주입에 대한 보다 자세한 설명은 출판된 보고서를 참조하기 바란다^15,16.

1. 항체의 형광 표지

1. 바람직하게는, 관심 단백질에 대해 단클론 항체 또는 나노바디를 사용합니다. 항체의 스톡 농도를 1mg/mL 이상으로 준비합니다.
   주: 이 학문에서는, GFP nanobody는 ( 물자의 테이블 보십시오) 보기로 이용됩니다. 상업적으로 이용 가능한 GFP nanobody는 1.0 mg/mL의 농도 및 250 μL의 부피로 포장됩니다. 추가적으로, 상업적으로 이용 가능한 항체 레테르를 붙이는 장비 ( 물자의 표 참조)는 숙시니미딜 에스테르 반응¹¹을 통해 단백질의 1 차적인 아민에 Alexa Fluor 594를 접합한다. 중요한 것은 이 표지 과정이 항체 농도를 크게 변화시키지 않는다는 것입니다.
2. 1mL의 탈이온수에 성분 B(항체 라벨링 키트에 제공됨)를 재현탁하여 1M 중탄산나트륨 용액을 준비합니다.
3. 항체 농도를 1.0mg/mL로 조정한 다음 1M 중탄산나트륨 용액의 1/10^부피( 100μL GFP 나노바디의 경우 10μL)를 추가합니다.
4. 110μL의 항체 혼합물(1.3단계)을 Alexa Fluor 594 염료가 포함된 튜브에 직접 추가합니다. 뒤집어서 혼합하고(와류 금지) 실온에서 1시간 동안 회전근에서 배양합니다.
5. 접합 키트에서 정제 컬럼을 조립합니다( 재료 표 참조). 1.5mL 레진 베드(항체 라벨링 키트에 제공)를 준비하고 컬럼을 실온(RT)에서 3분 동안 1100 x g 으로 원심분리하여 레진에서 과도한 액체를 제거합니다.
6. 반응 혼합물(단계 1.4)을 수지 컬럼 상단에 적가하고 4°C에서 5분 동안 1100 x g 으로 원심분리하여 라벨링된 항체를 수집합니다. 수집된 항체는 분홍색으로 나타나야 하며 부피는 100μL보다 약간 작아야 합니다. 호일로 포장된 튜브 또는 어두운 색상의 튜브에 넣어 4°C에서 보관합니다.

2. 초파리 배아의 준비

1. 갓 부화한 성체 초파리 200마리를 수컷 대 암컷 비율이 1:10인 플라스틱 원기둥 모양의 케이지(지름 = 5cm, 높이 = 8cm)에 넣습니다. 환기를 위해 한쪽을 다공성 금속 메쉬로 밀봉하고 다른 쪽을 과일 주스/효모 페이스트 한천 플레이트로 밀봉합니다.
2. 배아 채취 전 3일 동안 12시간마다 플레이트를 교체합니다. 이를 통해 초파리 알을 낳을 수 있고 수집 효율성이 향상됩니다.
3. 주사 당일에는 케이지를 최소한의 효모 페이스트가 있는 과일 주스 접시로 바꾸고 25°C에서 1시간 동안 배아를 채취합니다. 첫 번째 채취에서 충분한 배아(<50개 배아)가 나오지 않으면 첫 번째 플레이트를 폐기하고 1시간 이내에 100개 이상의 배아가 낳을 때까지 두 번째 채취를 위해 이 단계를 반복합니다.
4. 케이지에서 플레이트를 꺼내 알을 낳는 것을 멈추고 25°C에서 2시간 더 배양하여 2-3시간 된 배아를 얻습니다. 배아의 정확한 단계는 항체 주입의 성공에 매우 중요합니다.
5. 배아의 달걀 껍질을 제거하려면 과일 주스 접시에 50% 표백제 2mL를 넣고 붓을 사용하여 접시에서 배아를 부드럽게 제거합니다(그림 2A-4). 종종 배아는 효모 페이스트 바로 위에 놓입니다. 이 경우 효모 페이스트를 표백제 용액에 솔질하여 모든 배아를 수집하는 것이 허용됩니다.
6. 떠다니는 배아를 50% 표백제에 2분 동안 배양하고 30초마다 과일 주스 접시를 휘저어 달걀 껍질 제거 효율성을 높입니다.
7. 배아/표백제 혼합물을 70μm 나일론 세포 여과기에 부어 옮깁니다(그림 2A-7). 물병을 사용하여 배아를 철저히 씻어 잔여 표백제와 효모 페이스트를 제거합니다. 종이 타월로 세포 여과기를 완전히 건조시키고 배아 주변의 과도한 물이 제거되도록 합니다.

3. 배아 정렬 및 건조

1. 5cm x 5cm x 0.5cm(너비, 길이, 높이) 4% 아가로스 겔(그림 2A-9)을 준비하고 겔을 실온으로 식힙니다. 깨끗한 면도날을 사용하여 1cm x 3cm x 0.5cm(너비, 길이, 높이)의 아가로스 블록을 자르고 블록을 유리 슬라이드에 놓습니다(그림 2A-2). 해부 스코프 아래의 겔 블록을 검사하여 가장자리가 똑바로 절단되고 표면이 평평하고 건조한지 확인합니다.
2. 페인트 브러시를 사용하여 여과기에서 젤 블록으로 배아를 옮깁니다. 부드럽게 칫솔질하여 블록의 정중선을 따라 배아를 고르게 펴십시오. 이상적으로는, 배아의 군집은 서로 접촉하지 않고 단일 배아 또는 이중선으로 분리됩니다.
3. 하나의 가는 팁을 만들기 위해 두 다리를 단단히 테이프로 붙인 핀셋을 준비합니다(그림 2A-5). 해부 스코프에서 핀셋을 사용하여 개별 배아를 집어 겔 블록의 긴 가장자리를 따라 놓습니다. 20-30개의 배아를 정렬하여 전방 후방 축이 가장자리와 평행하도록 합니다(그림 2C).
4. 24mm x 50mm 커버슬립(그림 2A-1)의 중앙에 10μL 헵탄 접착제(재료 표 참조)를 피펫팅하고 피펫 팁을 사용하여 접착제를 0.5cm x 3cm 직사각형 영역으로 펼칩니다. 사용하기 전에 접착제가 완전히 마를 때까지 기다리십시오.
5. 젤 블록이 있는 유리 슬라이드를 책상 가장자리에 놓고 배아가 바깥쪽을 향하도록 합니다. 납작한 핀셋(그림 2A-6)을 사용하여 접착제로 커버슬립을 들어 올리고 접착제 면이 약 45도 기울어진 각도로 배아를 향하도록 하여 배아 위에 가만히 유지합니다.
   알림: 배아가 접착제에 닿도록 커버슬립을 젤 블록에 부드럽게 누른 다음 빠르게 압력을 해제하고 커버슬립을 들어 올립니다. 배아가 너무 세게 눌려서 터지지 않고 접착제에 안정적으로 부착될 수 있도록 가해지는 장력의 양이 중요합니다.
6. 새 유리 슬라이드의 중앙에 10μL의 물을 피펫팅하고 배아의 측면이 위쪽을 향하도록 하여 배아가 있는 커버슬립을 그 위에 놓습니다(그림 2B). 커버슬립의 이 면은 실시간 이미징을 위해 컨포칼 렌즈 바로 위에 배치되므로 커버슬립을 유리 슬라이드에 부착할 때 매니큐어나 기타 접착 접착제 대신 물을 사용해야 합니다.
7. 배아를 건조 챔버(그림 2A-3)(재료 표 참조)에서 vitelline 막 주름이 생길 때까지 10-15분 동안 건조시킵니다(그림 2E). 필요한 시간은 실내의 습도에 따라 다를 수 있으며 각 실험실 조건에 대해 실험적으로 테스트해야 합니다.
8. 피펫 40 μL의 할로카본 오일(부피가 1:1 비율로 유형 27과 유형 700의 혼합, 재료 표 참조). 할로카본 오일이 배아의 전체 표면을 덮을 때까지 슬라이드를 기울입니다.

4. 항체 주입 및 이미징

1. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 몇 개의 주입 유리 바늘을 준비하고(매개변수 설정은 재료 표 참조) 각 바늘에 5μL의 AlexaFluor 표지 항체 용액을 로드합니다(1.6단계).
2. 유리 슬라이드 위에 25mm x 25mm 커버슬립을 놓습니다. 할로카본 오일 40μL를 피펫팅하고 커버슬립의 가장자리를 따라 펴 바릅니다.
3. 주입 스코프 아래에서 바늘 끝을 오일 아래의 커버슬립 가장자리에 맞춥니다. 피코 펌프의 분사 공기 압력( 재료 표 참조)을 조정하여 하나의 펌프가 항체로 채워진 하나의 기포를 생성하도록 합니다. 기포 직경은 20-50μm로 제한되어야 합니다(그림 2F).
4. 빈 유리 슬라이드를 기름 아래에 있는 배아가 들어 있는 슬라이드로 교체합니다. 주사 바늘 끝을 배아의 전방-후방 축에 수직으로 맞춥니다(그림 2D,G).
5. 배아의 단계를 확인하여 대부분이 세포화를 시작했지만 아직 위형성을 시작하지 않았는지(4단계 및 5단계) syncytium으로 남아 있는지 확인합니다(그림 2F,G).
   참고: 이 단계의 특징은 홈이나 주름이 없고 배아 중앙에 타원형의 어두운 색의 난황낭이 있다는 것입니다. 기름 아래 배아 단계의 형태학적 특성은 Volker Hartenstein¹⁷의 책 "Stages of Drosophila Embryogenesis"를 기반으로 합니다.
6. X-Y 스테이지 매니퓰레이터를 사용하여 팁이 노른자 중앙에 도달할 때까지 배아를 바늘 쪽으로 이동합니다. 두세 번 펌핑하여 노른자에 항체를 주입합니다. 성공적인 주입은 항체 용액에서 배아가 부피를 얻음에 따라 vitelline 막 주름이 빠르게 사라지는 것으로 나타납니다(그림 2G).
7. X-Y 스테이지 매니퓰레이터를 사용하여 주입 후 배아를 바늘에서 멀리 이동시키고 다음 배아로 아래쪽으로 이동합니다. 슬라이드의 모든 배아가 주입될 때까지 6단계를 반복합니다.
8. 주입된 배아가 있는 유리 슬라이드를 습도 챔버로 옮깁니다(그림 2A-8). 원하는 배아 발달 단계에 도달할 때까지 25°C에서 배양합니다.
9. 유리 슬라이드에서 24mm x 50mm 커버슬립을 들어 올려 현미경의 슬라이드 홀더에 직접 넣습니다. 배아가 없는 쪽은 목표를 향하게 될 것입니다. 명시야 조명 아래에서 저배율 렌즈를 사용하여 배아를 찾고 고해상도 형광 라이브 이미징을 위해 40x 또는 63x 렌즈로 전환합니다.

형광 태그 기반 라이브 이미징 또는 면역 형광에 비해 항체 주입 방법의 이점을 입증하기 위해 저농도 막관통 수용체인 Notch의 동적 국소화와 살아있는 배아에서 티로신 인산화라고 하는 일종의 번역 후 변형을 특성화하는 두 가지 사례 연구가 제공됩니다.

노치 신호전달 활성은 배아 발생 및 성인 장기 항상성 동안 세포 운명 결정에 중요한 역할을 합니다18,19. 리간드 델타/들쭉날쭉한 리간드(20)에 의해 활성화되면, 막관통 수용체 노치(Notch)의 세포내 도메인이 절단되어 핵(21)으로 방출되어, 세포의 운명 변화를 유도하기 위한 다운스트림 전사 프로그램(downstream transcriptional program)이 시작된다(22). Notch 수용체의 정적 국소화는 포름알데히드 고정 조직에서 면역형광에 의해 잘 특성화되었습니다. 그러나, 리간드 결합 또는 세포내 분할 과정 동안에 노치의 동적 국소화는 대체로 알려지지 않은 채로 남아 있다23, 이는 이러한 상대적으로 낮은 존재비 단백질을 고속 방식으로 생중계하는 방법의 부족으로 인해. 여기에서, 우리는 내인성 유전자좌20에서 GFP 태그가 붙은 노치를 발현하는 배아에 AlexaFluor 접합 GFP nanobody를 주입했습니다. 주입하지 않으면 Notch-GFP는 표준 라이브 이미징 조건에서 거의 감지할 수 없으며 형광 신호는 타임 랩스 이미징 중에 빠르게 표백됩니다. 주입 후 Notch 수용체의 신호 대 잡음비는 면역형광의 신호 품질과 비교할 수 있도록 크게 개선됩니다(그림 3A). 또한 항체 주입을 통해 5분 이미징 기간 동안 신호 강도의 명백한 손실 없이 45초 간격으로 Notch 국소화의 시간적 특성 분석이 가능합니다(그림 3B).

티로신 인산화(Tyrosine phosphorylation)는 많은 생물학적 경로에서 신호 전달을 매개하는 번역 후 단백질 변형의 주요 유형이다24. 포스포티로신(p-Tyr)에 대한 매우 특이적인 단클론 항체(예: PY20 및 4G10)는 면역형광 및 웨스턴 블롯을 사용하여 전체 티로신 인산화의 국소화 및 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다25. 어떤 형광 태그도 인산화 변화를 추적할 수 없지만, 조직 또는 세포는 시간 경과에 따른 인산화 상태의 스냅샷을 제공하기 위해, 신호 활성화 시 티로신 인산화의 동역학을 연구하기 위해 서로 다른 시점에서 고정되고 염색되거나 용해되고 블롯트될 필요가 있다26 (예를 들어, 성장 인자 처리). 이 접근법의 시간 간격은 최소 몇 분 이상이며 고정 또는 세포 용해와 같은 절차에 필요한 가변적인 시간으로 인해 본질적으로 부정확합니다.

여기에서 항체 주입 방법을 통해 살아있는 배아의 인산화 상태를 직접 시각화할 수 있으며, 규칙적인 초 단위 시간 간격으로 티로신 인산화의 국소화 및 강도 변화를 추적할 수 있다는 증거가 제시됩니다. AlexaFluor-conjugated PY20 항체를 GFP 표지 미오신 경쇄를 발현하는 배아에 주입하고 45초 간격으로 이중 색상 라이브 이미징을 수행했습니다. 이전에 나타난 바와 같이, 티로신 인산화는 삼세포 접합부(tricellular junctions)27에서 매우 농축되며, 이 패턴은 면역형광(immunofluorescence)에 의해서도 재현됩니다(그림 4A). 흥미롭게도, 실시간 이미징은 면역형광을 사용하여 관찰되지 않는 정점 막의 중심 아래에 있는 새로운 두 번째 p-Tyr 신호 집단을 밝혀냈습니다(그림 4B). 이중 색상 이미징을 통해 이 p-Tyr 신호 집단이 내측 미오신 (그림 4B, 클로즈업)에 근접한 것으로 밝혀졌으며, 이는 실시간 이미징 조건에서만 유사하게 뚜렷하지만 면역 형광을 사용하여 거의 검출할 수 없는 미오신28의 하위 모집단입니다. 또한, p-Tyr의 내측 모집단은 이전에 내측 미오신28에 대해 나타난 바와 같이 유사한 박동성 유착 및 소산 패턴을 나타낸다(그림 4C). p-Tyr의 내측 부분 모집단의 정체와 기능은 아직 알려져 있지 않습니다. 이러한 결과는 항체 주입 방법이 저농도 단백질의 거동을 특성화하고 면역형광 과정에서 중단되었을 수 있는 새로운 국소화 패턴을 밝히기 위한 기존 접근 방식을 크게 보완할 수 있음을 보여줍니다.

그림 1: 항체 주입 워크플로우. 항체 주입 방법과 관련된 단계를 보여주는 개략적인 워크플로우. 배아 채취에서 항체 주입에 이르는 전체 과정은 일반적으로 완료하는 데 약 4-5시간이 걸립니다. 항체 주입 후, 배아는 실시간 이미징 전에 원하는 발달 단계까지 습도 챔버에서 배양될 수 있습니다. 알을 낳은 후 AEL; RT, 실온; Ab, 항체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 배아 정렬 및 주입. (A) 커버슬립, 유리 슬라이드, 건조 상자, 붓, 핀셋, 세포 여과기, 습도 챔버 및 아가로스 겔을 포함하여 주입 전에 필요한 항목에 대한 개요. (B) 커버슬립 중앙의 헵탄 접착제에 부착된 정렬된 배아를 건조 비드 위에 놓습니다. (C) 배아의 전방-후방 축이 아가로스 겔의 가장자리와 평행하게 정렬됩니다. (D) 주입 설정의 개요. (E) 건조 후 유리체 막의 주름에 초점을 맞춘 건조 과정 전후의 배아 형태 비교. (F) 피코 펌프를 한 번 누른 후의 주입 기포 크기. (G) 항체 주입 전과 후의 배아 형태 비교, 주사 후 막 주름의 소실을 강조합니다. (E-G)는 명시야 현미경을 사용하여 10배 배율 대물 렌즈로 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 초기 배아에서 Notch 수용체의 실시간 이미징. (A) 면역형광을 통한 내인성 GFP 태그 노치 수용체의 국소화(왼쪽), GFP 자가형광을 기반으로 한 직접 라이브 이미징(가운데) 및 AlexaFluor 594 접합 GFP 나노바디 주입(오른쪽). (B) 항체 주입 후 45초 간격으로 이미징된 Notch-GFP의 동적 국소화. 모든 이미지는 배아의 앞쪽이 왼쪽이고 복부 쪽이 아래를 향하도록 하여 획득되었습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 배아 포스포티로신 패턴의 실시간 이미징. (A) 면역형광을 통한 고정 배아에서 인산화된 티로신(p-Tyr)의 국소화. (B) GFP-표지된 미오신 경쇄(녹색)를 발현하는 살아있는 배아에서 p-Tyr(자홍색)의 국소화. 흰색 점선 상자는 정점 막 아래의 포스포티로신과 미오신의 내측 집단을 클로즈업하여 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. (C) 살아있는 배아에서 45초마다 이미징된 p-Tyr 및 GFP-myosin의 국소화. 흰색 화살표는 p-Tyr 및 myosin의 중간 모집단을 나타냅니다. 모든 이미지는 배아의 앞쪽을 왼쪽으로, 복부 쪽을 아래로 향하게 하여 캡처되었습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.