OVA 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로서의 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산

보조제는 면역 체계가 백신에 더 강하게 반응하도록 자극하여 특정 병원체에 대한 면역력을 증가시킴으로써 백신의 효능을 향상시키는 데 자주 사용됩니다¹. 나노에멀젼(NE) 보조제는 유상과 수성을 일정 비율의 유화하여 W/O(water-in-oil) 또는 O/W(oil-in-water) 형태의 에멀젼을 생성함으로써 열역학적 안정성을 가진 콜로이드 분산 시스템을 말합니다.². O/W 나노에멀젼 보조제는 주사 부위에서 사이토카인과 케모카인을 생성하고, 단핵구, 호중구, 호산구와 같은 중요한 면역 세포의 빠른 응집 및 증식을 유도하고, 면역 반응을 향상시키고, 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있습니다³. 현재 3종의 나노에멀젼 보조제(MF59, AS03, AF03)가 백신에 사용 허가를 받았으며 우수한 안전성과 효능을 보이고 있다⁴.

그러나, 점막 면역은 기존의 비경구 백신 접종에서 현재 허가된 보조제 제형으로는 잘 다루어지지 않았다⁵. 레티노산(RA)은 면역 세포의 장 귀환을 유도하는 것으로 보고되었지만, 극성이 낮고 물에 대한 용해도가 낮으며 빛과 열 안정성이 낮기 때문에 강력한 장 백신 접종에 사용하는 데 제한이 있습니다. 나노 에멀젼은 친유성이 높은 약물의 생체 이용률을 높일 수있는 기회를 제공하며 O / W 에멀젼 보조제의 오일 코어는 RA⁶ 와 같은 비극성 물질을 용해시키는 데 적합합니다. 따라서, 나노 에멀젼은 전신 면역과 점막 면역의 이중 반응 효과를 달성하기 위해 RA의 담체로 사용될 수 있습니다.

중성 또는 음이온 전달 시스템과 비교하여, 양이온 전달 시스템은 상대적으로 효율적인 항원 캡슐화 및 전달 능력을 가지며, 이는 항원 ^7,8,9의 면역원성을 향상시킬 수 있습니다. 다양한 보조제 시스템의 양이온 표면 전하는 보조제 효과에 중요하다 10,11,12. 양이온 전하는 주사 부위에서 백신 머무름을 연장하고, 항원 제시를 증가시키며, 체내 세포 면역 자극을 연장하는 데 중요한 요소이다¹².

위의 고려 사항을 바탕으로 RA와 항원을 효과적으로 공동 전달하기 위해 양이온성 나노에멀젼을 개발했습니다. 나노에멀젼의 입자 크기 및 제타 전위는 동적 광산란(DLS)을 사용하여 측정하고, OVA와 결합된 나노에멀젼의 전신 및 점막 면역 반응을 근육 주사¹³에 의해 평가하였다.

동물실험은 실험동물의 사용 및 관리 가이드에 따라 수행되었으며 제3군 의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 나노 에멀젼(NE)의 제조

1. 수성 상 준비를 위해 40°C에서 교반하면서 0.15g의 폴리소르베이트 80을 28.2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시킵니다.
2. 유상 제조를 위해, 표 1에 나타낸 나노에멀젼의 유상 제형을 사용한다. 40°C에서 교반하면서 sornitan trileate 85, DOTAP 및 RA를 스쿠알렌에 용해시킵니다.
3. 1차 O/W 에멀젼 준비의 경우 1400rpm에서 오일 상을 자기적으로 저어주면서 수성을 1mL/분의 속도로 천천히 적가합니다. 30,000rpm에서 고전단 유화제를 사용하여 6분 동안 혼합물을 사전 유화합니다.
4. 고압 균질화(HPH)의 경우 위에서 준비한 1차 O/W 에멀젼을 900bar에서 12사이클 동안 고압 균질화기로 처리하여 160-190nm 범위의 균질한 나노 에멀젼을 얻습니다.
5. 공정이 끝나면 50mL 플라스크에 에멀젼을 모으고 0.2μm PES 필터 멤브레인을 통해 에멀젼을 필터 멸균합니다.
6. 카테터를 통해 플라스크를 Schlenk Line에 연결하고 3방향 스톱콕을 회전시켜 시스템을 진공관에 연결하고 진공 펌프를 켜서 플라스크에 진공을 생성합니다. 그런 다음 3 방향 마개를 회전시켜 시스템을 아르곤 튜브에 연결하고 아르곤으로 채웁니다. 이 단계를 3번 반복하여 플라스크에 아르곤이 채워지도록 합니다.
7. 코르크와 밀봉을 파라핀 필름으로 교체하고 플라스크를 은박지로 싸서 4°C에서 보관합니다.

2. 나노 에멀젼의 특성 분석

1. 입자 크기 및 제타 전위 검출
   1. 기기를 켜고 레이저 광원이 안정화될 때까지 30분 동안 기다립니다.
   2. NE를 초순수로 50배 희석하고 해당 샘플 셀에 1mL의 샘플을 추가합니다.
   3. 입자 크기를 측정하려면 온도를 25°C로 설정하고 물을 분산 매체로 선택한 다음 일회용 플라스틱 접시를 측정 셀로 선택합니다. 샘플을 로드하고 자동으로 측정합니다. 각 샘플에 대해 세 번 반복된 측정의 평균값을 최종 결과로 보고합니다.
   4. 제타 전위를 측정하려면 온도를 25°C로 설정하십시오. 수성상을 분산 매체로 선택했기 때문에 Smoluchowsi 모델을 선택하고 접힌 모세관 셀을 측정 셀로 선택합니다. 샘플을 로드하고 자동으로 측정합니다. 각 표본에 대한 3번의 반복 측정 평균을 최종 결과로 보고합니다.
2. 캡슐화 속도(encapsulation rate) 및 약물 로딩 속도(drug loading rate)의 결정
   1. NE에 로드된 RA의 양을 측정하려면 절대 에탄올을 사용하여 NE에서 RA를 탈유화하고 추출합니다. 5 μL의 샘플에 995 μL의 에탄올을 추가하고 355 nm에서 분광 광도계를 사용하여 용액의 RA 함량을 측정합니다. 흡광도를 표준 곡선과 비교합니다. 다음 방정식을 사용합니다.
      캡슐화 = 실제 RA 부하/추가된 약물의 중량
      약물 로딩 속도 = 실제 RA 로딩 / 샘플의 품질

3. 예방접종 절차 및 검체 채취

1. 예방 접종 절차 및 그룹화
   1. 다음 실험 그룹에 따라 0일, 14일, 28일에 면역을 위해 6-8주 되고 체중이 약 18-21g인 암컷 Balb/C 마우스를 5개 세트로 그룹: (1) PBS 그룹, (2) 오브알부민(OVA) 그룹, (3) OVA+ NE-RA(OVA/NE-RA) 그룹, (4) OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA) 그룹.
   2. 200 μL의 다양한 백신 제형으로 상부 대퇴사두근에 근육 주사로 모든 마우스를 면역시킵니다 : 100 μL의 에멀젼과 100 μL의 PBS에 흡수 된 15 μg OVA는 투여 전에 혼합됩니다. 뒷다리 100μL를 주입합니다. 대조군의 마우스의 경우 PBS를 단독으로 투여합니다.
   3. 안락사: 세 번의 예방 접종 완료 후 2주 후에 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg의 복강 내 주사로 모든 마우스를 안락사시킵니다.
   4. 검체 채취 및 처리: 안락사 후 가위를 사용하여 쥐의 가슴을 절개하고 주사기를 심장에 직접 삽입하여 약 0.5mL의 전혈을 흡인합니다. 혈액을 실온에서 2시간 동안 그대로 둔 다음 1800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 혈청을 채취하고 부분 표본을 채취하여 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
   5. 전혈, 비장, 질 세척액(VLF), 기관지 폐포 세척액(BALF), 비강 세척액(NLF) 및 소장 세척액(SILF)을 수집합니다.
2. 비장 림프구의 분리
   1. 간단한 살균을 위해 생쥐를 에탄올 75%(v/v)에 담그고 생쥐를 깨끗한 벤치로 옮깁니다. 왼쪽 복부의 피부를 가위로 자르고 비장을 노출시켜 제거합니다.
   2. PBS 3mL가 들어있는 페트리 접시에 비장을 놓고 체(200 mesh, 70 μm)와 연삭 막대를 사용하여 15mL 원심분리기 튜브에 분쇄 및 여과합니다.
   3. 실온에서 650 x g 에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 3mL의 적혈구 용액으로 침전물을 현탁시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 튜브에 PBS 10mL를 넣고 잘 흔들어 반응을 종료한 다음 실온에서 650 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
   5. 상층액을 버리고 10mL의 PBS에 세포를 재현탁시키고 세포 계수를 위해 20μL의 세포 희석액을 자동 세포 카운터에 추가합니다.
   6. 실온에서 650 x g 에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포를 1640 완전 배지(1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청)로 1 x 10⁶ cells/mL로 희석합니다.
3. VLF 수집: 75μL의 1%BSA/PBST로 질을 4배 헹구고, 세척액을 결합하여 1.5mL 원심분리기 튜브에 수집하고, 4°C에서 5000 x g 에서 20분 동안 원심분리한 후 피펫으로 상층액을 수집하여 -80°C에서 보관합니다.
4. BALF 및 NLF 컬렉션
   1. 희생 후 75%(v/v) 에탄올로 생쥐를 소독합니다. 쥐 배를 위로 잡고 목을 곧게 펴십시오. 가위를 사용하여 쥐 목의 피부를 세로로 절개하고 집게를 사용하여 근육을 분리하고 기관을 적절하게 노출시킵니다.
   2. 작은 가로 구멍을 통해 기관을 절단하고 호스를 폐쪽으로 삽입하고 주사기를 호스에 부착하고 PBS 0.5mL를 폐에 주입하고 빼내고 3회 헹굼을 반복하고 4°C에서 650xg에서 5분 동안 원심분리하고 상층액(BALF)을 -80°C에서 보관합니다.
   3. 호스를 비강으로 역전시키고 주사기를 호스에 부착하고 0.5mL의 PBS를 주입하면 액체가 비강을 통해 1.5mL 원심분리기로 흐릅니다. 원심분리기 튜브에서 세척액을 흡인하고 헹굼을 2회 반복한 다음 4°C에서 650 x g 으로 5분 동안 원심분리하고 상층액(NLF)을 -80°C에서 보관합니다.
5. SILF 컬렉션
   1. 0.1mg/mL 트립신 억제제, 50mM/L EDTA-2Na, 1mM/L 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)를 함유한 PBS 용액을 소장 세척액으로 준비합니다. 실온에서 저어 녹인 후 4°C에서 보관합니다.
   2. 대장을 따라 열린 소장을 절개하고 소장 세척액 3mL를 담급니다. 4 °C에서 30분 동안 15rpm에서 수직으로 흔들어 혼합합니다. 4°C에서 1440 x g 으로 20분 동안 원심분리하고 피펫으로 상층액을 채취한 다음 4°C에서 5000 x g 으로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액(SILF)은 -80°C에서 보관하십시오.

4. 근육내 투여 후 OVA 특이적 항체 반응 평가

1. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 통해 IgG의 혈청 수준, IgG1, IgG2a의 하위 분류 및 VLF, BALF, NLF 및 SILF의 특정 sIgA 수준을 측정합니다.
2. 항원 코팅의 경우 코팅 완충액을 사용하여 OVA를 5μg/mL로 희석하고 웰당 100μL의 OVA 용액으로 4°C에서 밤새 96웰 ELISA 플레이트를 코팅합니다.
3. PBST로 ELISA 플레이트를 5배 세척하고 37°C에서 2시간 동안 250μL의 1%BSA/PBST로 배양하여 차단합니다.
4. PBST로 ELISA 플레이트를 5배 세척한 다음 아래 설명된 대로 희석한 샘플 100μL를 추가하여 테스트하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 0.5% BSA/PBST로 희석된 혈청, VLF, BALF, NLF, 20% 태아 송아지 혈청(FCS)/PBST로 묽은 SILF.
   1. 2단계 희석 절차를 사용하여 혈청을 1000배 희석하는 것으로 시작합니다: 혈청 20μL를 1mL로 희석한 다음 이 희석된 혈청 25μL를 500μL로 희석합니다. 이 혈청 희석액을 사용하여 IgG1, IgG2a를 검출합니다.
5. 1000x로 희석된 혈청 200μL를 코팅판의 첫 번째 줄에 추가하고 첫 번째 줄을 제외한 모든 웰에 0.5% BSA/PBST 100μL를 추가합니다. 첫 번째 줄에서 두 번째 줄로 100μL를 옮기고 피펫과 10x 혼합합니다. 이 단계를 8행까지 반복하고 100μL의 액체를 버리면 IgG 검출을 위해 다양한 농도의 혈청이 얻어집니다.
6. BALF, NLF 및 SILF를 1:1로 희석하여 IgA를 검출합니다. VLF에 대해 혈청과 동일한 희석 절차를 사용하십시오.
7. PBST로 ELISA 플레이트를 5번 세척합니다. 100μL의 HRP 접합 염소 항마우스 IgG/IgG1/IgG2a/IgA(PBST로 1:10000으로 희석)를 적절한 웰에 추가하고 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
8. PBST로 ELISA 플레이트를 5번 세척하고 TMB ELISA 기판 100μL(고감도)를 추가한 다음 플레이트를 5분 동안 빛으로부터 보호되는 장소로 옮깁니다. TMB 기질에 대해 100μL의 450nm 정지 용액을 즉시 추가하여 반응을 중지합니다.
9. 각 웰에 대해 450nm에서 흡광도(OD)를 측정하고 blank group mouse의 혈청 값의 2.1배를 양성 반응 값으로 취하여 항체 역가를 계산합니다.

5. ELISpot 분석

1. ELISpot Plus에 대한 지침을 따르고 키트의 마우스 IFN-γ(ALP)를 사용하여 분석을 수행합니다.
2. 밀봉된 패키지에서 플레이트를 제거하고 멸균 PBS(200μL/웰)로 4회 세척합니다. 1640 완전 배지(200 μL/well)로 플레이트를 컨디셔닝하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
3. 배지를 제거하고 step3.2.2(100μL/well)에서 준비한 조정된 농도의 림프구 현탁액을 플레이트에 추가한 다음 자극제 100μL, 즉 20μg/mL OVA257~264 또는 OVA323~339 또는 1640 완전 배지를 포함하는 1640 완전 배지를 추가합니다. 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에 5% CO₂ 로 48시간 동안 넣습니다. 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 감쌉니다.
4. 셀 현탁액을 버리고 PBS(200μL/well)로 플레이트를 5번 세척합니다. 검출 항체(R4-6A2-비오틴)를 0.5% 태아 송아지 혈청(PBS-0.5% FCS)이 포함된 PBS에서 1μg/mL로 희석합니다. 100 μL/웰을 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
5. 5.2단계와 같이 플레이트를 세척합니다. 스트렙타비딘-ALP(1:1000)를 PBS-0.5%FCS에 희석하고 100μL/웰을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 5.2단계와 같이 플레이트를 세척합니다. 0.45μm 필터를 통해 바로 사용할 수 있는 기판 용액(BCIP/NBT-plus)을 여과하고 100μL/웰을 추가합니다. 뚜렷한 반점이 나타날 때까지 개발하십시오.
7. 수돗물로 광범위하게 세척하여 발색을 멈추고 부드러운 플라스틱을 제거하고 접시를 건조시키십시오.
8. ELISpot 리더의 스폿을 검사하고 계수합니다.

6. 통계 분석

1. 일원 분산 분석으로 4개 그룹의 데이터 간의 차이를 분석한 후 Tukey 다중 비교 사후 테스트를 수행합니다. 모든 결과를 평균 ± SD로 표현합니다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었습니다.

총 4개의 나노에멀젼 제형이 제조되었으며 표 2에 제시된 바와 같이 입자 크기(그림 1), 제타 전위 및 캡슐화 효율로 특성화되었습니다. 입자 크기는 약 160-190nm에 집중되었으며 DOTAP을 첨가하면 나노 에멀젼의 제타 전위가 역전되었습니다. OVA 특이적 혈청 IgG 및 혈청 내 하위 그룹 항체 수준은 3차 면역 접종 2주 후에 검출되었습니다. 나노에멀젼 보조 백신은 혈청 내 OVA 특이적 IgG, IgG1 및 IgG 2a 항체 역가를 크게 증가시켰습니다(그림 2). 더 중요한 것은 OVA를 CNE-RA로 보강했을 때 질 세척액과 소장 세척액의 특정 sIgA 수치가 크게 향상되었다는 것입니다(그림 3). ELISpot 분석에서 유의미한 반점이 발견되지 않았습니다.

그림 1: 크기, 직경 및 분포. (A) NE-RA의 크기, 직경 및 분포. (B) CNE-RA의 크기, 직경 및 분포. d.nm은 입자의 평균 지름(nm)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 혈청 내 OVA 특이적 혈청 IgG 및 그 하위 그룹 항체 수준. OVA 특이적 혈청 IgG 및 3회 면역 완료 후 2주 후 혈청 내 하위 그룹 항체 수준. (A) IgG 역가의 Log2 값. (B) 450nm에서의 IgG1 광학 밀도. (C) 450nm에서 IgG2a 광학 밀도. 데이터는 평균 ± SD(n=5), ***: P<0.001로 표현됩니다. 그룹과 PBS 그룹 간의 차이점 비교는 그림의 열 바로 위에 표시되며 ns: 유의성 없음, #p<0.05, ###p<0.001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: OVA 특이적 sIgA. 질 세척액, 기관지 폐포 세척액, 비강 세척액, 소장 세척액의 OVA 특이적 sIgA. (A) 질 세척액, (B) 기관지 폐포 세척액, (C) 비강 세척액, (D) 소장 세척액. 데이터는 평균 ± SD(n=5)로 표현되며, ns: 유의성 없음, *p<0.05; 피<0.001. 그룹과 PBS 그룹 간의 차이점 비교는 그림의 열 바로 위에 표시되며 ns: 유의성 없음, ###p<0.001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: NE의 유상 제형.

표 2: NE의 물리화학적 특성.

저자는 이 작업에 대한 이해 상충이 없음을 선언합니다.