쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

2광자 생체 내 현미경(2P-IVM)은 생체 조직¹을 시각화할 수 있는 형광 이미징 기술입니다.

1990년대에 처음 개발된 2P-IVM은 다양한 전임상 모델에서 망막², 신장³, 소장⁴, 달팽이관⁵, 심장⁶, 기관^{7 및 뇌}의 생체 내 분석에 사용되었습니다 ^8,9. 신경과학 분야에서, 2P-IVM은 알츠하이머병¹¹, 파킨슨병¹² 및 교모세포종(GBM)13,14,15,16과 같은 신경계 질환을 연구할 뿐만 아니라, 깨어 있는 동물¹⁰에서 건강한 뇌의 실시간 이미징을 위한 기술로서 중요성을 얻고 있다^.

2P-IVM은 교모세포종 발병 중 종양 미세환경을 연구하기 위한 훌륭한 솔루션을 제공합니다. 일부 이전 연구는 in vitro¹⁷ 및 ex vivo 모델¹⁸에 초점을 맞춘 반면, 다른 연구에서는 교모세포종을 검사하기 위해 orthotopic¹⁹ 및 xenotropic²⁰ in vivo 모델을 구현했습니다. Madden et al.은 마우스 모델¹³에서 CNS-1 쥐 신경교종 세포주의 네이티브 이미징을 수행했습니다. Ricard 등은 orthotopic GL261-DsRed 쥐 모델을 사용하여 2P-IVM¹⁴에서 종양 부위의 혈관을 강화하기 위해 형광단의 정맥 투여를 수행했습니다.

여기서는 교모세포종의 orthotopic 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자(NP)의 종양 전달을 추적하기 위해 2P-IVM을 적용합니다. 두개창을 사용하여 이 방법을 사용하면 뇌에서 NP의 실시간 시공간 분포를 자세히 연구할 수 있습니다.

이 프로토콜에 설명된 동물 절차는 APLAC(Administrative Panel on Laboratory Animal Care)의 요구 사항을 따릅니다.

1. 세포 배양

1. 후드 준비
   1. 손을 씻고 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오. 생물 안전 작업대를 켜고 새시 높이를 적절한 개방 높이로 설정합니다. 후드를 3-5분 동안 퍼지시키십시오. 후드 부분에 70% 에탄올을 뿌리고 티슈 페이퍼로 닦아냅니다.
   2. 모든 시약에 70% 에탄올을 뿌리고 티슈 페이퍼로 닦아냅니다. 시약을 후드로 옮깁니다. 그릴 위에 물건을 올려 놓지 마십시오. 후드에 엎질러진 경우 물티슈로 덮고 70% 에탄올을 뿌린 다음 다시 닦으십시오.
   3. 실험이 끝나면 각 품목의 뚜껑을 조심스럽게 닫고 모든 재료를 닦고 후드에서 품목을 제거한 다음 원래 위치로 옮깁니다. 후드에 70% 에탄올을 뿌리고 닦아냅니다. 새시를 닫고 생물 안전 작업대를 끕니다.
2. 성장 배지의 제조
   1. 50mL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 100% 소 태아 혈청(FBS) 50mL를 추가합니다. 항생제-항진균액 5mL(100×)를 추가합니다.
   2. 멸균된 500mL 여과 병(0.22μm 필터)에 모든 시약을 통과시킵니다.
3. 냉동 보존된 세포의 해동
   1. 층류 후드에서 성장 배지 20mL를 T75 플라스크에 추가합니다. 플라스크에 셀 이름, 날짜 및 구절 번호를 표시한 라벨을 붙입니다. 이 연구에서는 부착성 C6 신경교종 세포를 사용했습니다.
   2. 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 세포를 소용돌이치게 하지 마십시오. 세포를 해동하고 즉시 사용하십시오.
   3. 1mL 피펫 팁을 사용하여 해동된 세포를 T75 플라스크로 옮깁니다. 이송 과정에서 기포가 생기지 않도록 주의하고 플라스크 목에 중간 잔류물이 남지 않도록 하십시오. 이는 오염 가능성을 증가시킬 수 있습니다.
4. 매체 변경
   1. 잔류 트립신 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 제거하기 위해 해동 다음 날에 배지를 변경합니다(1.6단계). 그런 다음 세포 밀도 수준에 따라 일주일에 최소 두 번 이상 배지를 교체하십시오. 배지는 트립신을 제거하기 위해 통과 후 하루 후에 교체해야 합니다.
   2. 매체를 변경하려면 흡인 장치를 켜고 흡인 유리 피펫을 부착하고 모든 매체를 흡인하십시오.
   3. 성장 배지 20mL를 추가합니다(단계 1.2).
5. 세포 통과
   1. 실험 과정에서 필요한 품목을 후드에 넣으십시오.
   2. 흡인 유리 피펫을 사용하고 모든 매체를 흡인하여 유리 피펫이 플라스크의 비셀 쪽에 있는지 확인합니다. 이 단계에서는 T75 플라스크를 수직으로 배치합니다.
   3. ~10mL의 실온(RT) 인산염 완충 식염수(PBS, Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 무료) 또는 Hanks의 균형 염 용액(HBSS, Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 무료)을 비세포 측에 추가합니다. 셀 면이 아래를 향하도록 T75 플라스크를 수평으로 배치하여 PBS로 셀을 잠시 세척합니다.
   4. 즉시 플라스크를 수직으로 놓고 PBS/HBSS를 흡입합니다. 이 세척과 흡입을 3회 반복합니다.
   5. 세포 측(T75 플라스크 수평, 세포 측이 아래를 향함)에 트립신(재조합 또는 동물 유래) 2mL를 추가합니다. 표준 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에서 4분 동안 배양합니다. 5mL 피펫을 사용하여 2분 후에 한 번 삼중 처리합니다.
   6. 총 배양 4분 후 용액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 원추형 튜브에 성장 용액 8mL를 추가합니다(트립신 처리 세포 2mL + 배지 8mL = 총 10mL).
   7. 필터가 있는 다른 빈 15mL 코니컬 튜브를 사용하고 25mL 피펫을 통해 세포를 옮겨 개별 세포를 얻습니다.
   8. 용액(셀 + 배지 + Tryp-LE)의 1/10(1mL)을 20mL의 배지가 있는 T75 플라스크에 옮깁니다. 또는 셀 수를 센다(1.7단계). 다음 날 배지를 교체하여 트립신이 아닌 배지 용액을 사용하십시오.
6. 배지 및 세포 동결
   1. 100°C 냉장고에서 4% FBS를 해동합니다. 수조나 열은 FBS의 단백질을 손상시킬 수 있으므로 사용하지 마십시오.
   2. 50mL의 동결 배지를 준비하려면 DMEM 45mL, FBS 5mL 및 DMSO 5mL를 혼합합니다. 간헐적인 해동 및 단백질 손상을 방지하기 위해 1-2mL 용기에 분주합니다. -20 ° 또는 -80 ° C 냉동실에 보관하십시오.
   3. 나머지 9mL의 용액(단계 1.5)에 대해 1mL의 배지를 추가하여 총 10mL에 도달합니다. 300 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
   4. 상층액을 제거하고 1mL의 동결 배지에 재현탁합니다(위 참조). -80°C 냉동실의 냉동 용기에 세포를 넣습니다. 1일 또는 2일 후 장기 보관을 위해 세포를 액체 N₂ 로 옮깁니다.
7. 세포 수 세기
   1. 나머지 9mL(단계 1.5)에 대해 1mL의 배지를 추가하여 총 10mL에 도달합니다. 300 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
   2. 상층액을 제거하고 HBSS 4mL에 재현탁합니다. HBSS 80μL + 0.4% Trypan Blue 10μL에 10μL의 세포를 재현탁시킵니다(희석 계수 = 10).
   3. 용액 17μL를 취하고 혈구계에서 4개의 4 x 4 정사각형을 계산합니다. 4개의 4 x 4 정사각형에 대한 평균 개수에 10⁴x 희석 계수를 곱하여 세포/mL를 얻습니다.

2. 수술

참고: 두 명의 연구원이 수술을 수행하는 것이 좋으며, 한 사람은 세포 준비, 치과용 시멘트 혼합 및 일반적으로 절차를 지원하는 책임을 맡고 다른 사람은 무균 상태를 유지하는 데 중점을 둡니다. 수술 절차를 돕기 위해 두 번째 매니퓰레이터가 있으면 오염 발생 가능성이 상당히 줄어듭니다. 최선의 수술 방법을 따르면 수술 후 합병증의 가능성을 줄일 수 있습니다. 그림 1A 는 두개골 창의 구성 요소에 대한 개요를 제공합니다.

1. 일반 준비
   1. 시작하기 전에 절차가 지역 동물 복지 기관 지침에 의해 승인되었는지 확인하십시오.
      참고: 이 연구는 5개월 된 암컷 NSG 마우스(NOD. Cg-Prkdcscid IL2RGTM1Wjl/SzJ) (n = 5)입니다.
   2. 수술 전에 모든 수술 기구를 고압멸균하고 필요한 모든 용품을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 마취 및 수술 기록을 인쇄합니다.
   3. 도착 시 동물들이 수술 후 추가적인 고통을 줄이기 위해 최소 1주일 동안 축산실에 적응하도록 합니다.
   4. 수술 당일에는 모든 장치(현미경, 발열 패드, 멸균기, 드릴, 진공 청소기 등)를 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오. 마취기에 이소플루란이 충분한지 확인하고 필요한 경우 리필합니다. 신규 사용자의 경우 두개골 창 절차는 동물당 최대 2시간이 소요될 수 있습니다. 따라서 충분한 이소플루란을 섭취하는 것이 중요합니다.
   5. 유리창과 헤드 바를 알코올에 넣고 식염수가 담긴 용기를 준비합니다. 이렇게 하면 무균 상태의 큰 위반 없이 원활한 작업 흐름이 보장되고 각 동물의 마취 시간을 가능한 한 짧게 유지할 수 있습니다.
   6. 작업 스테이션의 멸균 표면에서 모든 수술 재료를 엽니다. 예를 들어, 멸균 거즈 포장의 내부를 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. 팁 전용 기법을 사용합니다. 수술 기구를 사용하지 않을 때는 멸균 거즈 포장 내부와 같은 멸균 표면에 팁을 놓으십시오.
   7. 여러 번 수술을 할 때는 수술 사이에 모든 수술 기구를 멸균기에 넣어 소독하십시오. 5마리 이상의 동물에게 수술을 할 때는 새로운 오토클레이브 기구 세트를 사용하십시오. 조직 외상을 방지하기 위해 드릴 팁이 무뎌지면 새 드릴로 교체하십시오.
2. 마취 및 수술 준비
   참고: 마취 설정은 수술과 영상에서 동일합니다.
   1. 마취실에서 이소플루란(유도의 경우 3%-5%)을 사용하여 마우스를 마취합니다. 페달 철수 반사(양쪽 뒷발의 발 패드 꼬집기)를 테스트하여 적절한 마취 깊이를 확보한 후 동물을 준비 작업 스테이션으로 옮깁니다. 코뿔 위에 마취를 유지합니다(1%-2%). 여기에 각막 손상을 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오. 수술 중 발 반사를 확인하여 반사 손실이 정기적으로 조절됩니다.
   2. 동물의 식별이 필요한 경우 귀 펀치 도구 또는 가위를 사용하여 귀를 표시하거나 마커를 사용하여 꼬리를 표시하십시오.
   3. 귀와 눈 사이의 두개골을 덮고 있는 털을 제모 크림으로 제거합니다. 피부 자극을 피하기 위해 제조업체에서 지정한 기간(30-60초) 동안 크림을 그대로 두십시오. 크림이 모근에 닿도록 모발이 자라는 방향에 바르십시오. 제모 크림이 눈에 들어가지 않도록 하십시오. 식염수로 해당 부위를 청소하여 크림과 머리카락 잔여물을 제거합니다. 또는 클리퍼를 사용하십시오.
   4. 수술 전후 통증, 감염 또는 부종을 방지하려면 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 오피오이드, 항염증제 및 항생제를 투여하십시오. 수술 전에 카프로펜(5-20mg/kg, 피하[SQ]), 부프레노르핀-서방형(1mg/kg SQ), 세파졸린(20mg/kg SQ) 및 덱사메타손(0.2mg/kg SQ)을 투여하십시오. 탈수를 방지하기 위해 약 0.3mL의 0.9% 식염수 SQ를 투여합니다.
   5. 그런 다음 포비돈 요오드와 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 두개골 중앙에서 주변부로 원을 그리며 세 번 문질러 해당 부위를 문지릅니다.
3. 개두술 절차
   1. 동물을 수술 테이블로 옮기고 수술 중 등온 조건을 보장하기 위해 가열 패드(~37°C)의 복부 누운 자세에 놓습니다. 설치류의 저체온증은 생존율을 현저히 떨어뜨리고 수술 후 회복 단계를 연장합니다.
   2. 이어 바와 앞니 바를 배치하여 정위 프레임에 머리를 놓습니다. 이어 바의 경우 접합 아치를 찾아 아치 뒤에 바를 삽입합니다. 주로 사용하는 손으로 반대쪽 막대를 고정하는 것으로 시작하고(예: 오른손잡이인 경우 오른손으로 왼쪽 막대를 고정) 반대쪽을 고정합니다. 필요한 경우 나사를 돌려 귀와 앞니의 위치를 조정합니다.
   3. 필요한 경우 눈 연고를 다시 바르고 알루미늄 호일을 사용하여 눈을 덮습니다. 이렇게 하면 나중에 시아노아크릴레이트 접착제를 경화하는 데 사용되는 밝은 현미경 빛과 UV 광선으로 인한 손상을 방지할 수 있습니다(2.5단계).
   4. 절개 전에 발가락 꼬집기 반사가 있는지 다시 확인하십시오. 필요한 경우 그에 따라 마취를 조정하십시오. 센서를 뒷발에 위치시켜 동물을 마취 모니터링 장치에 연결합니다. 심박수와 혈중 산소 농도를 측정하면 사망률을 줄이고 수술 후 회복을 개선하는 데 도움이 됩니다. 또한 흉부의 움직임을 육안으로 검사하여 호흡수를 얻습니다.
   5. 저체온증과 오염을 피하기 위해 동물의 몸을 드레이프로 덮으십시오. 수술을 시작하기 전에 마지막 포비돈-요오드 면봉을 한 번 수행합니다.
   6. 장갑을 끼고 깨끗한 실험복을 입으십시오.
      참고: 시술의 침습성으로 인해 멸균 장갑을 사용하는 것이 좋으며, 수술 후 감염 및 염증의 위험을 낮추어 2P-IVM의 이환율 및 이미지 품질 손실을 초래합니다(섹션 5).
   7. 두개골의 피부를 들어 올리고 오른쪽 눈과 귀 사이에 가위를 잡고 절개 자국을 따라 두개골의 왼쪽을 향해 절단하여 절개합니다. 생성된 둥근 피부 플랩을 제거합니다.
      참고: 뇌의 관심 영역과 창 크기에 따라 절개 부위와 직경이 다를 수 있습니다. 절개 크기는 장착 공간을 수용하기 위해 헤드 직경보다 커야 합니다(2.5단계). 필요한 경우 절개 부위 주변의 피부를 부드럽게 절개하여 더 많은 공간을 만들 수 있습니다.
   8. 메스 칼날이나 미세 가레트로 두개골 표면을 부드럽게 긁어 골막을 제거합니다. 두개골 봉합사 주변의 골막을 제거할 때는 해당 부위가 약하고 출혈이 더 발생하기 쉽기 때문에 주의하십시오. 식염수와 진공 청소기를 사용하여 수술 부위를 이물질로부터 깨끗하게 유지하십시오. 시아노아크릴레이트 접착제와 치과용 시멘트가 더 잘 부착되도록 골막을 긁습니다(2.5단계).
   9. 세포 주입을 수행할 뇌 영역을 식별합니다. 이를 위해 쥐 뇌의 정위 좌표 아틀라스를 사용하십시오. 뇌 좌표에 따라 창과 같은 직경의 생검 펀치, 수술용 펜 또는 고압멸균 연필을 사용하여 두개골 창의 위치를 표시합니다.
   10. 드릴을 주로 사용하는 손에 들고 다른 도구(주사기, 집게)를 자주 사용하지 않는 손에 잡습니다. 같은 지점에서 장기간 드릴링을 피하십시오. 드릴은 과열을 방지하기 위해 버스트에서 사용해야 합니다. 휴식 시간 동안 칼바리움에 식염수를 발라 수술 시야를 깨끗하게 유지하고 과열을 방지하십시오. 드릴 팁의 감각 피드백을 사용하여 두개골에 완전히 구멍이 뚫렸을 때를 감지합니다.
   11. 진공 청소기와 함께 차가운 식염수를 사용하여 두개골 표면을 청소하십시오. 칼바리움을 연 후에는 면사 잔여물이 뇌창을 밀봉할 때 이물 반응을 일으킬 수 있으므로 거즈나 면봉 어플리케이터를 사용하지 마십시오.
   12. 드릴링하는 동안 궤적과 직경이 유리 커버슬립의 크기와 같은지 확인하십시오. 유리 커버슬립을 두개골 위에 놓고 유리 커버슬립이 두개골 창 안쪽에 정확히 맞는지 확인하여 이 작업을 수행합니다.
   13. 두개골 피판을 부드럽게 눌러 누를 수 있게 되면 겸자를 사용하여 수술 부위에서 조각을 조심스럽게 제거합니다(그림 1B, 왼쪽). 아직 두개골을 누를 수 없는 경우 두개골의 나머지 부분과 연결된 두개골 창 영역을 계속 뚫고 다시 평가합니다.
   14. 경미한 출혈이 발생하면 지혈 스펀지를 가벼운 압력과 함께 사용하거나 얼음처럼 차가운 식염수를 사용하여 출혈을 줄이십시오.
4. 세포 이식
   1. (1.7단계)에 설명된 대로 이식할 세포를 준비하고 계산합니다. 셀 수가 200,000 cells/μL인지 확인합니다.
      참고: RT에서 응고되는 막 매트릭스에 세포를 매달고 있는 것이 좋습니다. 이것은 뇌 실질에 이식된 세포의 성공률을 향상시킬 것입니다.
   2. 얼음이 담긴 용기에 담긴 세포를 수술실로 옮깁니다. 기밀 마이크로리터 주사기를 사용하십시오. 흡인 전에 온도 차이를 피하기 위해 주사기를 얼음 위에 두십시오.
   3. 1μL를 흡입한 후 주사기를 정위 프레임 내부에 놓습니다.
      알림: X, Y 및 Z축의 위치를 표시하는 자동화된 정위 좌표 장치를 사용하여 시간을 절약할 수 있습니다. 람다를 기반으로 위치를 수동으로 계산할 수도 있습니다. 1.5μL 이상 주입하는 것은 권장하지 않습니다. 이렇게 하면 주입된 부위가 과도하게 채워져 이식 실패, 뇌 실질 외부 성장 또는 전이가 발생하지 않습니다.
   4. 대략 내측에서 외측(M-L): -1.2 - -1.6 mm, 등쪽에서 복부(D-V): -2.6 - -3.5 mm 좌표에 해당하는 뇌의 V2MM 영역(시각 피질 2, 내측 부분)에 이식을 수행합니다.
      1. 이광자 이미징(4.6단계)의 경우 나중에 두개골 창을 통해 종양 덩어리를 시각화할 수 있도록 뇌 표재 영역에 세포를 이식합니다. 0.5μL(100,000개 세포)를 전방(A-P)에 주입: 0.8mm 깊이. 뇌에 들어갈 때 바늘을 천천히 단계적으로 움직이고 주사 후 30초 동안 기다립니다(그림 1B, 중간 열).
      2. 바늘을 집어넣고 뇌 조직을 빠져나갈 때도 같은 방법을 사용합니다. 뇌척수액은 중추 및 말초 신경계의 전이를 촉진할 수 있으므로 심실 가까이에 주사하는 것은 피하십시오.
5. 두개골 창 폐쇄
   1. 헤드 바와 유리 커버슬립을 알코올에서 식염수로 옮깁니다. 진공 팁이나 겸자를 사용하여 이러한 구성 요소를 수술 부위로 이동합니다.
   2. 유리 커버슬립을 두개골 창 안쪽에 놓고 두개골과 유리 커버슬립 사이에 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 놓습니다. UV 활성 시아노아크릴레이트 접착제는 경화 시간을 줄이고 우발적인 변위를 방지합니다. 유리 커버슬립에 접착제가 엎질러지면 면봉 어플리케이터로 제거하거나 완전히 경화되기 전에 메스의 뭉툭한 면으로 부드럽게 긁어냅니다.
      주의 : 자외선은 눈과 피부에 해롭습니다. 접착제를 경화하는 동안 눈과 피부의 접촉을 피하십시오.
   3. 두개골 창에 유리 커버슬립을 고정한 후 헤드 바를 적용합니다. 2액형 치과용 시멘트를 혼합하고 헤드 바를 배치한 다음 시멘트를 주변 부위에 도포하여 두개골과 헤드 바 사이의 접촉을 확인합니다. 주사기, 메스 또는 드릴 팁의 끝으로 불필요한 시멘트를 조심스럽게 청소하십시오.
      알림: 치과용 시멘트는 매우 빨리 응고되므로 적시에 적용하는 것이 좋습니다.
   4. 두개골 창을 밀봉한 후 치과용 시멘트와 피부 사이의 두개골 영역이 여전히 노출되어 있는지 확인합니다. 이 경우 수술용 접착제를 바르고 피부를 닫아 두개골을 덮습니다. 또는 흡수성 봉합사 재료로 단일 봉합사를 수행합니다.

3. 수술 후 회복 및 종양 성장

1. 복구
   1. 동물이 완전한 의식을 회복할 때까지 회복 케이지의 가열된 패드에서 동물을 모니터링하십시오. 부상 위험을 줄이기 위해 수술 후 동물을 따로 수용하십시오.
   2. 전해질이나 설탕이 함유된 시중에서 판매되는 물 젤과 같은 회복 식단을 시행하십시오. 또는 간편한 영양을 보장하고 탈수 및 저혈당을 방지하기 위해 축축한 표준 실험실 차우를 제공하십시오.
2. 모니터링
   1. 회복 후 매일 동물을 모니터링하여 통증, 고통 또는 감염의 징후가 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 진통제, 항염증제 또는 항생제를 투여하십시오. 동물이 연구 종점에 도달하면 인도적으로 안락사시킵니다. 최종 영상 촬영 후 이산화탄소 질식에 의한 쥐 안락사와 자궁경부 탈구에 의한 안락사.
      참고: 조기 안락사 기준의 예에는 상당한 체중 감소(>20%), 신경 장애, 호흡 곤란, 수술 중 과도한 출혈 또는 뚜렷한 정형화된 행동이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다. 두개골 창을 검사하고 필요한 경우 식염수나 알코올로 청소하십시오.
   2. 종양 성장을 추적하고 이미징 시점을 계획하려면 전신 생물 발광 이미징(BLI)을 수행합니다. 이를 위해 150mg/kg D-루시페린을 복강내로 주사하고 5-15분 후에 동물을 이미지화합니다.

4. 나노 입자 합성

1. 입자 준비
   1. 5M NaOH 50mL, 탈이온수(DI 물) 20mL 및 에피클로로히드린 20mL를 포함하는 용액에 11.17mL의 페루목시톨(총 6mmol Fe)을 추가합니다. 이 단계에서 위상 분리를 관찰합니다. 혼합물을 상온에서 24시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
   2. 24시간이 지나면 용액이 균일해집니다. 3일 동안 투석 튜브(12,000-14,000Da 컷오프)를 사용하여 과도한 에피클로로히드린을 물에 대고 제거합니다.
   3. 투석 후 튜브에 남아 있는 용액을 유리병(총 부피 ~110mL)에 옮깁니다. 수산화암모니아 30mL를 넣고 혼합물을 37°C에서 18-20시간 동안 저어줍니다.
   4. 저어준 후 3일 동안 물에 대한 투석을 반복합니다. 투석 튜브에 남아 있는 용액을 총 부피 ~110mL의 새 유리병에 옮깁니다.
2. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합
   1. FITC 접합을 위해 27.5mL의 아민 기능성 입자를 꺼냅니다. 10kDa 초원심분리 필터를 사용하여 입자를 농축하고 pH 9(Na₂CO₃ / NaHCO₃) 완충액으로 25 ° C에서 5752 x g 에서 10 분 동안 세척합니다.
   2. 용액 4mL를 필터에 넣고 25°C에서 5752 x g 으로 10분 동안 튜브를 초원심분리합니다. 여과액을 버리고 동일한 프로토콜로 두 번째 세척을 위해 필터를 완충액으로 다시 채우십시오.
   3. 여과액을 버리고 피펫을 사용하여 필터에 용액을 수집합니다. 각 입자의 직경이 5nm라고 가정하고 Ferumoxytol의 질량 농도로 입자의 몰 농도를 추정합니다.
   4. FITC를 10mg/mL의 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 녹입니다. DMSO 용해 FITC를 농축된 아민 작용 입자에 천천히 첨가합니다. FITC: 입자의 몰비는 20:1입니다. 그 후, 어둠 속에서 4 ° C에서 8 시간 동안 용액을 배양하십시오.
   5. 과량의 NH₃ 를 첨가하여 반응을 소멸시킨다. H₂O (NH₃ 의 최종 농도. _H2O는 50mM), 그 후 용액을 어둠 속에서 4°C에서 2시간 동안 유지시킨다. Na₂CO₃ / NaHCO₃ (pH 9) 버퍼를 사용하여 25 ° C에서 5752 x g 에서 10 분 동안 10kDa 필터를 통해 과도한 FITC를 씻어냅니다. 용액의 최종 pH는 HCl 수용액을 사용하여 7.4로 조정됩니다.

5. 2P-IVM (2P-IVM)

참고: 2P-IVM 세션의 경우 두개골 창의 위치를 수평 및 수직으로 조정할 수 있는 맞춤형 스테이지(그림 2 및 보충 코딩 파일 1)가 있는 Prairie Ultima IV 현미경이 사용되었습니다. 후처리 및 이미지 분석에는 피지 소프트웨어가 사용되었습니다. 이렇게 하면 레이저 빔이 유리에 90° 각도로 부딪히도록 조정하여 아티팩트를 줄이고 이미징 품질을 향상시킬 수 있습니다.

1. 이미징 세션
   1. Ti-Sapphire 레이저를 켭니다. 메인 시스템 스위치와 Prairie View 소프트웨어를 켭니다.
   2. 위에서 설명한 대로 동물을 마취합니다(2.2단계). 동물당 최대 2시간 동안 이미징 세션을 수행합니다. 마취 합병증 및 관련 이환율 또는 사망률의 위험을 줄이기 위해 이미징 시간을 최소한으로 유지하십시오.
   3. 사용자 지정 스테이지를 사용하여 이광자 현미경 아래에 마우스를 고정합니다(그림 1B, 오른쪽 열). 설치류 수술용으로 설계된 가열 패드에 동물을 엎드린 자세로 놓고 흉부가 수축되지 않도록 주의하면서 테이프로 가볍게 고정합니다. 두개골 창에 물 한 방울을 놓고 초점을 조정합니다.
   4. 심박수와 혈중 산소를 확보하여 동물의 중요한 매개변수를 모니터링합니다. 센서를 뒷발에 놓고 모니터링 장치를 이광자 이미징 챔버 외부에 둡니다.
   5. 동물이 현미경 단계에 있으면 머리 위치를 조정합니다. 쌍안경과 광시야 형광 조명을 사용하여 적색 형광 단백질(RFP) 필터를 설정하고 원하는 이미징 시야를 찾습니다(그림 1B, 오른쪽 열).
   6. 샘플 방향과 시야가 결정되면 현미경을 광시야 모드에서 광학 주사 현미경 모드(LSM)로 전환합니다.
   7. Ti-Sapphire 레이저가 920nm에서 모드 잠금되어 있고 모든 셔터가 열려 있는지 확인하십시오. GaAsP 광전자 증배관 검출기(PMT) 전압을 최대 500-600V로 가져옵니다. 595/50(RFP) 및 525/50의 대역 통과가 있는 필터 세트와 함께 두 개의 PMT를 사용합니다.
   8. Live Image를 누르고 포켈 셀을 천천히 수정하여 이미지가 보일 때까지 샘플의 레이저 출력을 높입니다.
   9. 선명한 이미지가 확보되면 소프트웨어와 전동 스테이지를 사용하여 원하는 샘플 영역 내에서 이미지 스택의 상단과 하단을 설정합니다. 단계 크기에 주의하고 Z축이 렌즈의 깊이를 조정한다는 점을 고려하십시오.
   10. 깊이가 증가하면 이미지가 어두워집니다. 포클/PMT 게인을 천천히 높여 이미지를 밝게 유지합니다. 너무 많은 힘을 사용하면 광독성 및 조직 손상이 발생할 수 있으므로 주의하십시오.
   11. 저장 경로를 설정하고 Z 시리즈를 시작합니다. 설정된 pockel/PMT 설정을 사용하여 시작 및 종료 위치로 자동 이동합니다. 스택이 완료되면 재생을 사용하여 스택의 품질을 확인합니다. 필요한 이미지 획득이 완료되면 Ti-Sapphire 레이저를 끕니다.
   12. 위에서 설명한 대로 동물을 회수 케이지로 옮깁니다(3.1단계).
   13. Prairie view를 종료하고 모든 데이터가 저장/전송되었는지 확인합니다. 컴퓨터를 종료하고 모든 하드웨어를 종료합니다.
2. FIJI를 사용한 후처리
   참고: Fiji는 생물학적 이미지 분석²¹에 중점을 둔 오픈 소스 소프트웨어입니다.
   1. 운영 체제와 관련하여 FIJI를 다운로드하십시오. 폴더 내용의 압축을 풀고 .exe 파일을 실행합니다.
   2. 이광자 이미징에서 수집된 .env 파일을 대화 상자로 드래그합니다. 채널을 다른 이미지 상자로 나눕니다. 이렇게 하면 서로 다른 채널을 가진 두 개의 다른 이미지가 생성되는데, 하나는 셀 신호를 포함하고 다른 하나는 입자 신호를 포함합니다.
   3. 이미지 중 하나를 복사하고 파일 > 새 > 내부 클립보드 를 클릭하여 다른 이미지를 만듭니다. 이미지 중 하나의 이름을 원본 으로, 다른 이미지의 이름을 복사로 바꿉니다.
   4. 복사 이미지를 사용하고 대화 상자에서 프로세스 > 대비 향상 을 클릭합니다. 정규화(Normalize )를 클릭하고 확인(OK) 을 클릭한 다음 처리(Process) > 스무딩(Smooth)을 클릭합니다. 이 이미지는 마스크에 사용되며 분석용이 아닙니다. 대화 상자에서 Image(이미지)> Adjust > Threshold(임계값 조정 )를 클릭합니다. 추출에 적합한 슬라이딩 스케일과 방법을 사용하고 Apply(적용)를 클릭합니다.
   5. [이진 처리> [이진] > [침식]을 사용하여 배경에서 단일 픽셀을 침식하고 [이진 > 확장] 처리> 클릭하여 이미지에 다시 픽셀을 추가합니다.
   6. 대화 상자에서 프로세스 > 이미지 계산기 를 클릭하고 원본 이미지를 첫 번째 이미지로 선택하고 두 번째 이미지를 복사로 선택합니다. AND 를 사용하여 두 이미지의 교차점을 만듭니다. 다른 채널 이미지에 대해 동일한 단계를 반복합니다.
   7. 혈관 영역 밖에서 신호를 분석하려면 수정되지 않은 복사된 영상을 열고 프리핸드 ROI 툴을 사용하여 신호의 혈관 영역을 삭제하십시오.
   8. Analyze(분석) > Set Measurements(측정 설정)로 이동하여 원하는 매개변수를 설정합니다. Area(영역), Integrated Density(통합 밀도) 및 Mean Grey Value(평균 그레이 값)가 선택되어 있는지 확인합니다.
   9. 이제 Analyze > Measure로 분석합니다. 측정값이 있는 창이 나타납니다. 데이터를 스프레드시트에 복사합니다.
   10. 이제 형광이 없는 이미지의 작은 영역을 선택합니다. 이것이 배경이 될 것입니다.
   11. 해당 지역에 대해 Analyze > Measure(측정 )를 클릭합니다. 스프레드시트에 데이터를 복사합니다.
   12. 결과 이미지를 파일로 저장 > 다른 이름으로 저장 > 재측정 또는 게시를 위해 파일 형식을 분석합니다.

여기에서 우리는 두개골 창 수술을 수행하고 교모세포종(n=5)의 NSG 마우스 모델에 C6 세포를 생착시켰습니다. 창 제작과 관련된 모든 구성 요소(그림 1A)를 적절하게 밀봉하면 장기 이미징을 위한 창의 내구성을 보장하고 이환율을 줄일 수 있습니다. in vivo 2P-IVM(그림 2)에 맞게 조정된 스테이지를 사용하여 주요 움직임 아티팩트 없이 최대 2시간 동안 마취 상태에서 동물을 이미징할 수 있었습니다. GBM 함유 마우스에서 나노 입자를 정맥 투여한 후 약 10분 후, 2P-IVM은 FITC 표지 나노 입자의 혈관 내 국소화와 일치하는 종양 부위 혈관의 녹색 형광 신호를 보여줍니다. 혈관 외부에서 소량의 녹색 형광 신호만 나타나며, 이는 NP의 유출이 시작됨을 나타냅니다(그림 3A). 혈관 외 공간에서 발생하는 FITC 신호의 증가가 관찰되며, 이는 진행된 유출과 일치합니다(그림 3B).

그림 1. 두개골 창 배치, 개두술, 이식 및 이미징. (A) 두개골 창의 해부학적 배치의 단면. 헤드 바는 금속이 없기 때문에 이광자 생체 내 현미경 검사 외에도 자기 공명 영상 또는 자기 입자 영상을 수행할 수 있습니다. (B) 개두술(왼쪽), 세포 이식(가운데) 및 2광자 생체 내 현미경(오른쪽)의 개요(위 줄) 및 세부 보기(아래 줄). 두개골을 열면 표재성 출혈이 발생하고(왼쪽) 빠르게 재흡수됩니다(가운데). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 무대의 CAD(Computer-Assisted Design). 바이트 바, 헤드 바 안정화, 높이 및 각도 조정용 나사를 포함하여 생체 내 2광자 생체 내 현미경 검사에 사용되는 스테이지의 CAD. 3D CAD 파일은 보충 코딩 파일 1에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. In vivo 2광자 생체 내 현미경 이미지. 나노 입자 정맥 투여 후 (A) 10분 및 (B) 24시간 후에 얻은 이미지. 교모세포가 적색 스펙트럼(왼쪽)에서 형광 신호를 방출하는 반면, 뇌 조직의 나노 입자는 녹색(오른쪽)으로 시각화됩니다. # 은 외래 NP를 나타내고 * 는 혈관을 나타냅니다. 제한된 수의 입자만 유출을 거쳤으며 NP 투여 후 10분 후에 종양 세포 근처에서 볼 수 있습니다. 교모세포종 세포 부위에 풍부한 입자가 보였는데, 이는 NP 투여 후 24시간 동안 유출이 있었음을 시사한다. 나노 입자는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 산화철 나노입자(페루목시톨)로 구성됩니다. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. 약어: 2P-IVM: 2광자 생체 내 현미경, RFP: 적색 형광 단백질, GBM: 교모세포종, FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트, NP: 나노 입자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 1: 스테이지의 3D CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.