성체 제브라피시의 복강 내 주사 기법으로 신체 손상 및 관련 폐사율을 최소화합니다.

제브라피시(Danio rerio)는 인간에 대한 높은 유전자 및 장기 상동성, 외부 수정, 유전자 조작의 용이성, 조기 성숙에 대한 신체 투명성을 포함하기 때문에 인간의 질병을 연구하기 위한 실험 모델로 주목받고 있습니다¹. 제브라피시 배아와 유충을 위해 약물을 직접 물에 전달하는 간단한 과정과 달리, 성체 제브라피시에게 약물을 투여하는 것은 더 복잡하고 도전적인 노력을 제시한다².

성체 물고기에서 화합물은 물에 직접 투여하는 것과 같은 수동적 약물 전달 기술 또는 gavaging과 같은 경구 약물 전달 방법을 통해 전달될 수 있습니다². 다른 접근법으로는 어류에 화합물을 코팅한 후 물고기에게 먹이를 주는 방법³, 후안와 주사 또는 복강내 주사를 포함하여 미리 결정된 농도로 수불용성 약물을 직접 투여하는 방법이 있다 ^4,5. 복강내 투여는 뚜렷한 약동학적 이점으로 인해 질병 모델의 생체 내 연구에서 선호됩니다⁶. 이 방법은 복막강 내에서 높은 약물 농도와 연장된 반감기를 제공하여 약물 전달을 위한 효과적인 경로를 제공합니다 ^7,8. 이 접근법은 최적의 약물 흡수 및 분포를 보장하기 위해 연구 환경에서 일반적으로 사용됩니다 ⁹. 주사 기반 방법은 단일 분만에 효과적인 것으로 입증되었지만, 장기간 반복적인 주사는 종종 신체 손상과 만성 감염을 유발합니다².

현재 성체 zerbafish ^4,10에서 IP 주입에는 두 가지 방법이 있습니다. 그러나 두 방법 모두 독소루비신과 같은 독성 화합물을 전달할 때 한계가 있어 체형에 심각한 손상을 입히고 물고기를 폐사하게 합니다. 부작용으로 인해 데이터 해석이 크게 복잡해질 수 있습니다. 이러한 문제들은 광범위한 교육¹⁰을 통해 해결될 수 있지만, 부작용을 최소화하는 새로운 IP 주입 방법에 대한 필요성이 분명히 존재한다.

여기서 우리의 목표는 독소루비신을 성인 제브라피쉬에 효과적으로 전달하는 데 최적화된 새로운 IP 주입 방법을 개발하여 신체 손상 및 관련 사망률을 최소화한 신뢰할 수 있는 독소루비신 유발 심근병증(DIC) 모델의 생성을 촉진하는 것입니다.

수행된 모든 절차는 Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals'(National Academies Press, 2011)에 설명된 표준을 준수했습니다. 연구에 참여한 모든 제브라피쉬는 WIK(Wild Indian Karyotype) 균주에 속합니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 독소루비신 원액의 준비 및 보관

1. 상업적인 출처에서 독소루비신 주식을 얻으십시오.
   참고: 독소루비신은 빛에 민감하므로 빛에 노출되지 않도록 분말 형태로 구입하여 불투명한 용기에 보관하십시오. 화학 후드 내에서 Dox 분말 준비를 위한 모든 단계를 수행합니다.
2. Dox 분말을 증류수에 완전히 용해시키고 최종 농도가 5mg/mL인 원액을 준비합니다.
3. 스톡을 1.5mL 튜브로 나누어 분취합니다.
4. 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 빛에 노출되지 않도록 보호합니다.
5. 분취액 Dox 용액을 단기 보관(<1개월)의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -20°C에서 보관하십시오¹⁰.

2. 체중에 따라 물고기 그룹화

1. 후속 주입을 위해 BW 차이가 10% 미만인 물고기를 함께 그룹화합니다.
   참고: 이 단계에서 노력을 줄이기 위해 BW 분산이 10% 미만인 물고기는 동일한 크기로 분류됩니다.
2. 주입하기 전에 물고기가 24시간 동안 금식하도록 하십시오.
3. 0.16mg/mL 트리카인이 함유된 배아 물을 사용하여 1분 동안 물고기를 마취합니다.
4. 트리케인으로 물고기를 물에서 꺼내고 깨끗한 여과지로 물고기 몸의 양쪽을 두드려 과도한 물을 제거합니다.
5. 각 물고기의 BW를 측정하고 기록한 다음 물고기를 신선한 시스템 물로 채워진 회수 탱크로 즉시 되돌려 놓습니다.
   참고: Dox 주입은 생후 3개월이 된 물고기에게 수행되었습니다. 이 연구에서 연구원들은 3개월에서 10개월 된 물고기를 활용했습니다. 성숙한 WIK 균주 제브라피쉬의 BW는 0.2g에서 0.5g까지 다양할 수 있습니다. 5분 이상 지속된 장시간 마취 후 독스(Dox) 주사를 놓으면 물고기 폐사율이 높았습니다.

3. 주입을 위한 바늘 및 스테이션의 준비

1. 목표 용량인 20μg/g을 달성하기 위해 평균 체중을 기준으로 각 물고기에 필요한 Dox 원액 5mg/mL의 주입량을 결정합니다.
2. 다음 공식을 사용하여 사출 부피를 계산하십시오.
   
3. 주입을 위해 1단계에서 계산한 Dox 용액을 희석하기 위해 1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)을 추가하여 총 부피가 5μL에 도달합니다.
   알림: BW를 기준으로 각 물고기 그룹에 대해 벌크 용액을 사용하고 실험 과정에서 주입할 용액이 부족하지 않도록 각 그룹에 3마리의 물고기를 추가로 포함합니다.
4. 튜브를 부드럽게 두드린 다음 최고 속도로 잠시 미세 원심분리기를 사용하여 실온에서 10초 동안 용액을 수집합니다.
5. 준비된 용액을 얼음 위에 놓고 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오.
6. 해부 현미경 아래에 스폰지로 깨끗한 100mm 페트리 접시를 놓고 초점을 조정합니다.
   알림: 스펀지에는 4cm 길이의 홈이 있습니다. 스펀지의 탄성 수축은 물고기를 지지하고 물고기 몸을 제자리에 유지합니다. 스폰지는 재사용할 수 있습니다.
7. 10μL 마이크로 주사기에 34G 베벨 니들을 장착합니다.
8. 1x HBSS 버퍼로 바늘을 세척하여 기포를 제거하고 주사기에서 잠재적인 막힘을 제거합니다.
9. 주입을 위해 4단계에서 준비한 용액 5μL를 측정합니다.

4. IP Dox 주입 절차

1. 다 자란 물고기를 0.16mg/mL의 트리케인이 든 물에 1분 동안 넣어 의식을 잃게 합니다.
2. 복부가 위를 향하도록 하여 내장된 스폰지의 홈에 물고기를 놓습니다(그림 1A).
3. 가슴 지느러미의 중간점에서 시작하여 심강의 뒤쪽을 향해 0°에 가까운 각도로 바늘을 삽입합니다(그림 1B).
   알림: 시술 중 심장에 닿지 않도록 하십시오.
4. 바늘을 꼬리 쪽으로 향하게 하고 은색 피부 아래로 이동합니다.
   알림: 바늘을 은색 피부에 가깝게 배치하고 긁히거나 뚫리지 않도록 주의하십시오.
5. 전체 수술 동안 복강 내의 바늘 끝을 모니터링합니다(그림 1C).
   알림: 간, 장, 수영하는 방광 및 기타 장기를 손상시키지 마십시오. 바늘이 배설물 구멍 근처의 장 끝에 도달하는지 확인하십시오.
6. 5μL Dox 용액을 점차적으로 균일하게 분배한 다음 누출을 방지하기 위해 원래 경로를 따라 바늘을 천천히 빼냅니다(그림 1D).
7. Dox 용액의 붉은 색을 관찰하여 Dox의 존재 여부를 복강을 모니터링합니다(그림 1E).
8. 주입된 물고기를 신선한 시스템 물로 채워진 깨끗한 교차 탱크로 신속하게 옮겨 물고기가 회복할 수 있도록 합니다.
   참고: 주사 사이에 1x HBSS 완충액으로 바늘을 한 번 씻어냅니다.

5. 주입 후 물고기 관리

1. 주입 후 순환을 통해 물고기를 시스템으로 되돌려 놓습니다.
2. 주입된 모든 물고기를 회복을 용이하게 하기 위해 추가로 24시간 동안 단식시킵니다.
3. 첫 주에는 물고기를 주의 깊게 관찰하십시오. 다른 물고기가 감염되지 않도록 가능한 한 빨리 죽은 물고기를 제거하십시오.
   참고: 초기 24시간 이내의 물고기 사망은 주사 또는 장기간의 마취로 인한 신체적 부상 때문일 수 있습니다. 물고기 수를 기록하여 생존 곡선을 생성합니다.
4. 주입 후 56일째에 Dox-주입된 물고기를 표현형으로 표현하기 위해 심장 초음파를 수행합니다¹¹.
   참고: HBSS 용액이 주입된 해당 대조군에 대한 조건 및 절차의 균일성을 확인하십시오.

이전에는 성인 제브라피시에서 독소루비신을 투여하기 위해 두 가지 복강내(IP) 방법이 사용되었습니다 4,10. Kinkel et al.4에 의해 설명된 Classic IP 주입 방법으로도 알려진 방법 I에서 바늘은 복부가 위쪽을 향하도록 하여 골반 지느러미 사이의 정중선에 대해 45° 각도로 삽입되었습니다. 방법 II 또는 Ma et al.10에 의해 설명된 대체 IP 주입 방법에서, 바늘은 물고기의 등쪽을 통해 삽입되었습니다(그림 2A(i,ii)). 반면, 방법 III에는 두 가지 주요 변경 사항이 있습니다. 먼저 복부가 위를 향하고 바늘이 가슴 지느러미의 중간 지점에서 복부 쪽으로 향하도록 주사 위치를 변경합니다. 침투 부위는 이 영역의 자연 구멍에 의해 안내됩니다. 둘째, 바늘의 각도가 줄어들어 0°에 가까워야 합니다(그림 2A(iii), 그림 1).

세 가지 복강 내 주사 방법의 비교
세 가지 IP 주입 방법을 비교하기 위해 이전에 제브라피쉬에 대한 경험이 없는 연구원 I로부터 얻은 데이터를 제시합니다. 방법 I 및 II를 IP 주입에 사용했을 때 IP 주입 후 초기 2주 동안 유의한 어류 폐사율이 나타났습니다. 방법 I에서는 주사 후 3일 후에 사망이 관찰된 반면, 방법 II에서는 주사 후 2일 후에 사망이 관찰되었습니다. 주입된 물고기의 70%는 특히 주사 부위 주변에서 눈에 띄는 신체 손상을 보였으며, IP 주입 후 1-2개월 후에 신체 크기가 급격히 줄어들고 몸 모양이 구부러진 것으로 나타났습니다(그림 2A (iv,v)). 사망률과 관찰된 손상은 독소루비신 12의 독성에 기인할 수 있으며, 독소루비신12는 주사 과정에서 주사 바늘의 입구 끝에서 누출되어 주사 경로를 따라 내부 장기를 손상시킬 수 있다고 추론했습니다. 방법 I에서는 주사 바늘의 끝이 장에 닿을 수 있고(그림 2A(i)), 방법 II에서는 부레를 만질 수 있습니다(그림 2A(ii)). 방법 III을 사용하여 바늘 끝이 내부 장기에 닿는 것을 방지할 수 있다고 가정했습니다(그림 2A(iii)). 실제로, 주입 후 1개월에 물고기의 80%가 생존하여 생존율이 크게 개선된 것으로 나타났습니다(그림 2B). 이는 방법 I과 II의 생존율이 각각 53.33%와 33.33%였던 것에 비해 눈에 띄는 개선을 의미합니다. 중요한 것은 살아남은 물고기의 80%가 방법 I과 II에 의해 생성된 것과는 대조적으로 정상적인 몸 모양을 보였다는 것입니다(그림 2A(vi)). DIC 모델의 성공적인 생성을 검증하기 위해 박출률 비율(EF%)을 측정하여 심장 기능을 평가했습니다. 실제로, 방법 III을 사용한 그룹에서 주입 후 56일에 EF%의 상당한 감소가 관찰되었습니다(그림 2C).

다른 연구자들에 의한 방법 III의 재현성
방법 III이 다른 연구자들에 의해 쉽게 숙달될 수 있다는 것을 증명하기 위해, 이전에 제브라피시를 사용해 본 적이 없는 3명의 연구원을 연구에 모집했습니다. 방법 III을 처음 몇 번 시도한 결과, 모든 연구자는 주입 후 56일 동안 85.71%, 95% 및 83.33%의 생존율을 달성할 수 있었고 EF가 현저히 감소했습니다(그림 3A, B). 주목할 점은 3명의 연구자가 각각 3회, 3회, 2회 실험을 반복하여 지속적으로 성공적인 결과를 얻었다는 점이다. 이러한 데이터는 방법 III의 반복성을 확인시켜 물고기를 대상으로 한 사전 연구 경험이 없는 연구원들이 신뢰할 수 있는 DIC 모델을 생성할 수 있도록 했습니다.

방법 III을 사용한 초기 시도 중 하나에서, 연구원 II는 방법 III의 편차를 테스트했습니다: 바늘이 피부를 통해 관통하는 동안 0° 대신 45° 각도가 사용되었습니다(그림 2A(iii), 점선 화살표). 주입 후 2개월 동안 생존한 물고기는 15%에 불과했으며(그림 3A), 살아남은 물고기의 80%는 상당한 신체 손상을 보였다. 데이터는 침투 각도가 방법 III의 성공에 중요한 단계임을 나타냅니다.

방법 III을 통해 만성 DIC 모델을 설정할 수 있습니다.
현저하게 감소된 신체 손상은 동일한 물고기에서 여러 IP 주입을 가능하게 할 수 있다고 가정되었으며, 이는 마우스13,14의 만성 DIC 모델을 모방했습니다. 따라서 방법 III을 사용하여 주당 5μg/g Dox로 연속 4주 동안 일련의 주사를 수행했습니다(그림 4A). 이 실험에서 주입된 물고기의 100%가 생존했으며 그 중 80%는 신체 손상의 징후를 보이지 않았습니다. 중요한 것은 56dpi에서 방출률이 현저히 감소한 것으로 나타났으며, 이는 성체 제브라피시에서 만성 DIC 모델이 성공적으로 생성되었음을 나타냅니다(그림 4B).

그림 1: 새로운 IP 주입 방법을 위한 바늘 삽입 위치 및 각도. (A) 바늘 삽입 위치. 물고기는 거꾸로 되어 있어 복부 쪽이 노출되어 있습니다. 머리는 오른쪽에 있습니다. 가슴 지느러미 사이에 자연스러운 구멍이 있어 피부가 더 쉽게 침투할 수 있습니다. (B) 바늘 삽입 각도. 물고기 표면에서 0도에 가깝습니다. (C) 피부 아래의 바늘 자국. 바늘 끝은 복강 내부에서 한 번 지속적으로 모니터링됩니다. 진입점이 그림 1A 와 다르게 나타나는 이유는 침투 과정 중 스킨 변형 때문입니다. (D) Dox 이후의 물고기가 풀려납니다. 복강은 Dox를 방출한 후 붉게 변합니다. (E) IP 주입 후의 물고기. 바늘을 빼낸 후 누출의 징후가 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 성체 제브라피쉬의 세 가지 IP 주입 방법 비교. (A) 세 가지 IP 주입 방법의 개략도. (나-III) 기존 IP 주입(방법 I), 대체 IP 주입(방법 II) 및 새로운 방법(방법 III)의 개략도가 표시됩니다. 화살표는 세 가지 주입 방법에 대한 바늘의 침투 부위와 각도를 나타냅니다. 점선 화살표, 바늘 관통 실패 각도. 눈금 막대: 5mm. (iv-vi) DIC 모델에서 감소된 본체 크기 및 곡선 본체 모양. 56dpi의 DIC 물고기를 대표하는 물고기를 보여줍니다. (B) 세 가지 IP 주입 방법 간의 생존 곡선 비교. 살아남은 물고기의 수는 매주 기록되었다. (실험은 총 n = 15로 시작되었습니다). (C) Dox 스트레스 후 56dpi에서 물고기의 심장 기능 평가. 1x HBSS 대조군에서 n = 6마리의 물고기, Dox를 주입한 각 3개 배치에서 총 n = 15마리의 물고기로 실험을 시작했습니다. 값은 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 방법 III을 사용하면 제브라피시 DIC 모델을 3명의 다른 연구자가 일관되게 설정할 수 있습니다. (A) 세 명의 다른 연구원이 방법 III을 사용한 DIC 물고기의 생존 곡선. 세 명의 연구자 모두에서 높은 생존율이 나타났습니다. 활어의 수는 매주 기록됩니다. 실패한 방법 III을 사용했을 때 연구자 II의 생존율이 낮았습니다( 그림 2A의 점선 화살표로 표시된 것처럼 45° 바늘 침투 각도). (B) 세 명의 다른 연구원이 Method III를 사용한 DIC 물고기의 심장 기능 평가. 연구원 II는 총 45°의 바늘 관통 각도를 위해 Dox 주입을 위해 3개의 배치(9, 12, 14)의 물고기를 사용했습니다. 0° 바늘 침투 각도의 경우 n = 6명의 물고기를 공유 대조군으로 1x HBSS에 사용했습니다. 실험은 3명의 연구자(II, III, IV)에 의해 각각 Dox가 주입된 8개의 배치 각각에 RII(9, 12, 14), RIII(8, 6, 6) 및 RIV(12, 18)가 있는 총 n=85마리의 물고기로 시작되었습니다. 값은 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 방법 III을 사용하면 성체 제브라피시에서 Dox를 여러 번 주입할 수 있어 설치류의 만성 DIC 모델을 요약할 수 있습니다. (A) 다중 주입 모델의 개략도. 5 μg/g Dox (5 μL)를 4주 연속으로 주입하였다. (B) 만성 DIC 모델은 56dpi에서 감소된 EF%를 나타냅니다. 값은 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

없음.