제시된 프로토콜은 디지털 잎 생리학 및 면적별 잎 질량 재구성 방법을 사용하여 고기후 및 고생태학을 재구성하기 위해 화석 잎의 연속적인 잎 생리학적 특성의 디지털 측정 및 분석을 보여줍니다.
기후와 환경은 식물 잎의 크기, 모양 및 이빨 (생리학)에 큰 영향을 미칩니다. 이러한 관계, 특히 목질의 비외엽식물성 속씨식물에서 이러한 관계는 지구 역사의 마지막 ~1억 2천만 년 동안 고대 육상 생태계를 재구성하는 데 적용된 고기후 및 고생태학을 위한 잎 기반 프록시를 개발하는 데 사용되었습니다. 또한 이러한 관계가 살아있는 식물에서 문서화되었다는 점을 감안할 때 식물 진화의 측면과 식물이 기후 및 환경 변화에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 중요합니다. 현생 식물과 화석 식물에 대한 이러한 유형의 분석을 수행하려면 재현 가능한 방법론을 사용하여 잎의 생리학을 정확하게 측정해야 합니다. 이 프로토콜은 현생 및 화석 잎에서 다양한 잎 생리학적 변수를 측정하고 분석하기 위한 컴퓨터 기반 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 잎의 생리학적 특성, 특히 고기후를 재구성하기 위한 디지털 잎 생리학적 프록시에 사용되는 잎 톱니, 잎 면적, 잎 박리 및 선형성과 관련된 변수를 측정할 수 있으며, 고생태학적 프록시인 면적당 잎 질량을 재구성하는 데 사용되는 잎자루 너비 및 잎 면적을 측정할 수 있습니다. 이 디지털 잎 형질 측정 방법은 화석 및 살아있는 식물에 적용할 수 있기 때문에 고기후 및 고생태학 재구성과 관련된 응용 분야에만 국한되지 않습니다. 또한 잎 형태학의 기능, 잎 발달, 잎 특성의 계통 발생 관계 및 식물 진화를 이해하는 데 도움이 될 수 있는 잎 특성을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다.
잎은 식물과 주변 환경 사이의 에너지(예: 빛, 열)와 물질(예: 이산화탄소, 수증기)의 교환을 촉진하는 기본 생산 단위입니다 1,2. 이러한 기능을 수행하기 위해 나뭇잎은 잔잔하고 바람이 많이 부는 공기 속에서 중력에 대항하여 자신의 무게를 기계적으로 지탱해야 한다 3,4. 이러한 본질적인 연결 고리로 인해 잎의 크기, 모양 및 이빨 정도의 여러 측면(생리학)은 잎의 기능과 생체 역학의 세부 사항을 반영하고 환경과 생태에 대한 통찰력을 제공합니다. 선행 연구는 현대 세계 전반에 걸쳐 잎의 생리학, 기후 및 생태학 사이의 관계를 정량화하여 화석 잎 집합체에 적용할 수 있는 프록시를 확립했다 5,6. 이러한 프록시는 고기후 및 고생태학을 재구성할 수 있는 중요한 기회를 제공하고 역사를 통틀어 지구의 다양한 시스템 간의 복잡한 상호 작용에 대한 더 큰 이해에 기여합니다. 이 글에서는 두 가지 프록시를 사용하는 데 필요한 방법을 자세히 설명합니다: 1) 고생태학을 밝히기 위한 면적당 잎 질량 재구성 방법과 2) 고기후를 재구성하기 위한 디지털 잎 생리학.
면적당 잎 건조 질량(MA)은 신식물학과 고식물학 모두에서 자주 측정되는 식물 특성입니다. MA의 주요 가치는, 특히 화석 복원에 있어서, 그것이 잎 경제학 스펙트럼의 일부이며, 잎의 광합성 속도, 잎의 수명, 질량에 의한 잎 영양분 함량을 포함하는 상관관계가 잘 상관된 잎 형질의 조정된 축이라는 것이다7. 화석에서MA 를 재구성할 수 있는 능력은 다른 방법으로는 접근할 수 없는 대사 및 화학 과정을 들여다볼 수 있는 창을 제공하며, 궁극적으로 식물 생태 전략 및 생태계 기능에 대한 유용한 정보를 밝힐 수 있습니다.
Royer et al.5은 잎 잎의 면적과 잎자루의 너비를 기반으로 나무가 우거진 비외떡잎(쌍떡잎식물) 속씨식물 화석 잎의MA를 추정하는 방법을 개발했습니다. 이론적으로 잎자루는 캔틸레버 역할을 하여 최적의 위치 3,4에서 잎의 무게를 유지합니다. 따라서 빔 강도의 가장 중요한 구성 요소를 구성하는 잎자루의 단면적은 잎의 질량과 강한 상관 관계가 있어야 합니다. 잎자루의 모양을 원통형 튜브로 단순화함으로써, 잎자루의 단면적은 잎자루 너비의 제곱으로 표현될 수 있으며, 이를 통해 2차원 화석으로부터 잎 질량을 추정할 수 있다(자세한 내용은 Royer et al.5 참조). 잎 면적을 직접 측정할 수 있습니다. 함께, 잎자루 너비의 제곱을 잎 면적으로 나눈 값(즉, 잎자루 미터법; 표 1) 화석MA에 대한 좋은 대용물을 제공하고 고식물학자들이 현대 형질 기반 생태학에 발을 들여놓을 수 있도록 합니다. MA 재구성 방법은 또한 활엽수 및 잎자루 겉씨식물 5,8, 초본 속씨식물8 및 양치류9로 확장되었으며, 이는 목본 쌍떡잎 속씨식물 및 서로 다른 관계에서 관찰된 관계와 다른 관계를 생성했습니다. 확장된 목디 쌍떡잎식물 데이터셋과 사이트수준에서 MA의 분산과 평균을 재구성하기 위한 새로운 회귀 방정식을 통해 화석 식물군의 목본 쌍떡잎식물 속씨식물 중에서 잎 경제 전략의 다양성과 가장 널리 퍼져 있는 전략을 추론할 수 있다10.
생리학적 잎 형질과 기후 사이의 관계는100년 이상 동안 알려져 왔습니다 11,12. 특히, 목본쌍떡잎식물 속씨식물(woody duot angiosperm leaves)의 생리학적 구조는 온도 및 습도와 밀접한 상관관계가 있다13. 이 관계는 육상 고기후에 대한 수많은 단변량 14,15,16,17 및 다변량 6,18,19,20,21,22 잎 생리학적 프록시의 기초를 형성했습니다. 단변량 및 다변량 잎 생리학적 고기후 방법은 모두 지구 역사의 마지막 ~ 1 억 2 천만 년 (백악기에서 현대까지)에 걸쳐 모든 대륙의 속씨 식물이 지배하는 화석 식물군에 널리 적용되었습니다 23.
잎 생리학적 고기후 프록시에서 사용되는 두 가지 기본 관찰은 1) 잎 크기와 평균 연간 강수량(MAP) 간의 관계와 2) 잎 이빨(즉, 잎 가장자리의 외부 돌출부)과 평균 연간 온도(MAT) 간의 관계입니다. 구체적으로, 한 지역에서 모든 목본 쌍떡잎식물 종의 평균 잎 크기는 MAP와 양의 상관관계가 있으며, 이빨의 크기와 수 외에도 톱니가 있는 지역에서 목본 쌍떡잎 속씨식물 종의 비율은 MAT 6,12,13,14,15,16,24와 음의 상관관계가 있습니다.
이러한 잎의 생리학-기후 관계 사이의 기능적 연결은 이론과 관찰 1,2,25에 의해 강력하게 뒷받침됩니다. 예를 들어, 더 큰 잎은 더 큰 광합성 표면적을 제공하지만, 더 두꺼운 경계층 1,26,27로 인해 더 큰 지지력이 필요하고, 증산을 통해 더 많은 물을 잃고, 더 많은 현열을 유지합니다. 따라서 더 큰 잎은 더 습하고 더운 환경에서 더 흔한데, 그 이유는 증가된 증산을 통한 수분 손실이 잎을 효과적으로 냉각시키고 문제가 적기 때문입니다. 대조적으로, 더 건조하고 더운 기후에서 더 작은 잎은 수분 손실을 줄이고 대신 현열 손실을 증가시킴으로써 과열을 방지합니다28,29. 어떤 요인 또는 요인의 조합이 기능적 연결을 설명하는 데 가장 강력하게 기여하는지에 대한 세부 사항은 다른 잎 형질에 대해 수수께끼로 남아 있습니다. 예를 들어, 잎 냉각, 효율적인 새싹 패킹, 얇은 잎의 지원 및 공급 향상, hydathodes를 통한 내장화, 조기 시즌 생산성 향상을 포함하여 잎 이빨-MAT 관계를 설명하기 위해 몇 가지 제안 된 가설이 있습니다 30,31,32,33.
대부분의 잎 생리학적 고기후 프록시는 연속 변수의 정량적 측정보다는 잎 형질의 범주적 분할에 의존하여 몇 가지 잠재적인 단점을 초래합니다. 범주형 접근법은 기후와 밀접한 상관관계가 있는 연속적인 측정에 의해 포착된 보다 자세한 정보(예: 이빨 수, 잎 선형성)의 통합을 제외하며, 이는 고기후 추정치 6,20,34의 정확도를 감소시킬 수 있습니다. 또한, 일부 잎 형질 점수 매기기 방법에서는 범주적으로 점수가 매겨지는 형질이 모호하여 재현성 문제를 일으킬 수 있으며, 일부 형질은 기후에 대한 기능적 연관성을 뒷받침하는 경험적 증거가 제한적입니다 6,15,16,35,36.
이러한 단점을 해결하기 위해 Huff 등[20]은 DiLP(digital leaf physiognomy)로 알려진 방법으로 연속적인 잎 특성을 디지털 방식으로 측정할 것을 제안했습니다. 이전 방법에 비해 DiLP의 주요 장점은 1) 사용자 간에 신뢰할 수 있게 측정할 수 있고, 2) 본질적으로 연속적이며, 3) 기후와 기능적으로 연결되고, 4) 성장기 사이에 표현형 가소성을 표시하는 특성에 의존한다는 것입니다 6,37. 이로 인해 이전의 잎 생리학적 고기후 방법보다 MAT와 MAP에 대한 더 정확한 추정치가 나왔다6. 게다가, 이 방법은 손상되고 불완전한 잎을 설명하기 위한 단계를 제공함으로써 화석 기록의 불완전한 특성을 수용한다. DiLP 방법은 광범위한 지질학적 시간 6,38,39,40,41,42에 걸쳐 여러 대륙의 다양한 화석 식물군에 성공적으로 적용되었습니다.
다음 프로토콜은 이전 작업 5,6,20,34에서 설명한 프로토콜의 확장입니다. DiLP 및 MA 재구성 방법을 사용하여 목본 쌍떡잎식물 속씨식물 화석 잎으로부터 고기후 및 고생태학을 재구성하는 데 필요한 절차를 설명합니다(이 프로토콜의 사용을 통해 측정 및 계산된 변수에 대한 설명은 표 1 참조). 또한 이 프로토콜은 DiLP또는 MA 분석에 포함되지 않지만 구현하기 쉽고 잎 생리학의 유용한 특성화를 제공하는 잎 특성을 기록하고 계산하는 단계를 제공합니다(표 1). 프로토콜은 다음과 같은 형식을 따릅니다: 1) 화석 잎 이미징; 2) 잎 디지털 준비, 5가지 가능한 준비 시나리오로 구성됨; 3) 동일한 5가지 가능한 준비 시나리오로 구성된 리프 디지털 측정; 4) R 패키지 dilp10을 사용한 DiLP및 MA 분석.
MA 재구성을 위한 프로토콜은 둘 다 서로 나란히 준비하고 측정하기 편리하기 때문에 DiLP 프로토콜 내에 내장되어 있습니다. 사용자가MA 분석 에만 관심이 있는 경우 잎 가장자리의 톱니가 있는지 여부에 관계없이 DiLP 준비 시나리오 2에 설명된 준비 단계와 잎자루 너비, 잎자루 면적 및 잎 면적 측정만 설명하는 측정 단계를 따라야 합니다. 그런 다음사용자는 MA 재구성 을 수행하는 dilp R 패키지에서 적절한 기능을 실행할 수 있습니다.
이 논문은 목질, 쌍떡잎식물, 속씨식물 화석 잎에서 잎 생리학의 연속적인 특성을 측정하고, 이후 고기후 및 고생태학을 재구성하기 위해 현대 보정 데이터에서 개발된 프록시에 적용하는 방법을 제시합니다. 이를 위해서는 프록시 보정 데이터 세트 5,6,10에 표시된 것과 방법론적 단계를 일치시키는 데 주의를 기울여야 합니다. 이러한 고려는 화석 잎 수집 중에 이 프로토콜을 적용하기 전에 시작되며, 특히 표본 크기와 관련하여 시작됩니다. 가능한 한 좁은 범위의 층서학에 걸쳐 화석 잎 집합체를 모아 적절한 수의 측정 가능한 표본과 형태형을 얻는 것이 시간 평균화를 최소화하는 것이 권장됩니다. 고기후 재구성을 최소 350개의 식별 가능한 표본과 최소 15-20개의 목본 쌍떡잎식물 속씨식물 형태형이 있는 장소로 제한하는 것도 권장됩니다 19,51,52. 또한, 분석을 위해 잎을 선택할 때 형태형당 가능한 한 많은 잎을 측정하고 최소한 형태형 내에서 잎 생리학의 가변성을 나타내는 표본을 선택하는 것이 좋습니다.
준비 및 측정 섹션을 구현하는 동안 보정 데이터 세트와 일관성을 유지하기 위해 추가 주의를 기울여야 합니다. 준비 단계에서 수행된 단계는 주관성이 가장 크고 사용자 간에 다양한 결과를 얻을 가능성이 있습니다. 그러나 프로토콜을 의도적으로 따르고 추가 고려 사항 표(표 2, 표 3) 및 규칙 문서(보충 파일 3)를 자주 참조하는 경우 이 방법은 잎 생리학에 대한 객관적이고 재현 가능한 측정을 제공합니다. 이 방법을 처음 사용하는 사용자의 경우 경험이 더 많은 사람과 함께 잎이 올바르게 준비되었는지 확인하는 것이 좋습니다. MA 재건 을 위해 잎자루 너비를 측정할 때 특별한 주의가 필요합니다. 이러한 값은 제곱되기 때문에 측정의 부정확성이 과장됩니다. 불완전한 보존 및 손상은 잎자루의 치수를 변경할 수 있으므로 주의해서 피해야 합니다.
이러한 방법에는 주목할 가치가 있는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 가장 중요한 것은, dilp R 패키지에 포함된 대리 재구성은 목질의 쌍떡잎식물 속씨식물만을 위한 것이며, 따라서 고대 군집의 두드러진 구성 요소였던 다른 식물 그룹을 제외할 수 있다는 것입니다. 그러나, 종 수준 MA에 대한 추가적인 잎자루 기반 프록시가 잎자루 및 활엽 겉씨식물 5,8, 초본 속씨식물8 및 양치류9에 대해 발표되었으며, 사용자가 원하는 경우 별도로 통합할 수 있습니다. 목본식물식물 이외의 군집에서 저명한 식물군을 제외하는 것은 전체 군집 내에서 경제 전략에 대한 불완전한 관점을 제공하기 때문에 사이트 수준의 MA 평균과 분산의 재구성에 가장 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 계통발생학적 역사는 잎이빨(leaf teeth 23)의 발생에 영향을 미치며, 새로운 분류학적 구성을 가진 화석 군집을 분석하는 것이 결과 추정치에 불확실성을 부여할 수 있는 가능성을 제시하지만, 이러한 잠재적 영향의 실현은 아직 테스트되고 입증되지 않았다.
화석 잎은 또한 가장자리 상태를 넘어서는 잎 생리학의 정량적 측정을 통합하기 위해 적절하게 보존되어야 합니다. DiLP의 경우, 전체 잎 또는 절반 잎이 보존되거나 재구성될 수 있는 경우에만 여백 상태를 넘어서는 정보를 제공할 수 있기 때문에 전체 여백이 있는 잎의 경우 특히 그렇습니다. 유사하게, 잎은 (1) 잎 잎에 삽입 될 때의 잎자루가 모두 보존되거나 특정 경우에 잎의 기부와 중간 정맥의 기저 가장 부분이 보존되는 경우 (3.6 단계의 참고 참조) 및 (2) 잎의 크기를 추정 할 수있는 경우에만 MA 재구성에 통합 될 수 있습니다. 전체 잎 측정 또는 반 잎 재구성을 통해. 이는 일부 형태형이 사이트수준 MA 분석 에서 완전히 제외될 수 있음을 의미합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 시간이 제한되는데, 고기후 재구성을 위한 단변량 대안은 생산하는 데 상대적으로 적은 시간이 걸리기 때문입니다.
이러한 한계에도 불구하고 DiLP및 MA 재구성 방법의 사용은 여전히 다른 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. MA 재구성은 화석 기록에서 잎의 경제적 전략을 재구성하는 유일한 방법 중 하나이며, 2차원 잎자루 너비 및 잎 면적 측정을 사용하면 일반적인 인상/압축 잎 화석을 사용하여 재구성을 수행할 수 있습니다. DiLP의 경우, 기후와 기능적으로 연결된 여러 연속 측정을 통합하면 측정의 재현성과 결과 기후 재구성의 정확성이 향상됩니다 6,13. 이 프로토콜은 잎 조각을 사용하여 잎의 이빨 정도를 측정할 수 있도록 함으로써 화석 기록의 불완전한 특성을 수용하도록 설계되었습니다. 잎 면적의 연속 측정은 잎 크기에 대한 더 많은 정보를 제공하지만, DiLP MAP 추정치는 표본 크기16,53을 늘리기 위해 잎 크기 클래스를 사용하거나 잎 면적 42,54,55의 정맥 스케일링 추정치를 통합하여 보완할 수 있습니다 . 대부분의 관련 방법과 마찬가지로 이 프로토콜의 시간 효율성은 특히 준비 단계에서 사용자가 더 많은 경험과 자신감을 갖게 됨에 따라 향상됩니다. 현재까지 >150 현대 6,10,56 및 적어도 22 개의 화석 집합체에 대해이 프로토콜에 따라 사이트 수준의 DiLP 측정이 이루어졌다는 사실은 그 실현 가능성 6,38,39,40,41,42를 증명합니다. 마지막으로, 잎 생리학에 대한 포괄적인 측정은 여기에서 논의된 것 이상의 응용을 가지며, 식물 생태학, 생리학, 진화 및 발달의 다른 측면을 설명하는 데 유용할 수 있으며, 현대 연구(56)와 고생물학연구(paleo studies)40 모두에 적용될 수 있다.
요약하면, 이 기사에 자세히 설명된 방법의 구현을 통해 사용자는 강력하고 재현 가능한 방법을 사용하여 고기후 및 고생태학을 재구성할 수 있습니다. 이러한 방법은 환경 변동에 대한 기후 및 생태계 반응의 과거 사례를 보여주고 지구 자연 시스템의 복잡한 상호 작용에 대한 더 깊은 통찰력을 제공할 수 있는 중요한 기회를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
AJL은 DiLP를 위한 효과적인 교육 자료를 만들기 위한 동기와 제안에 대해 University of Washington의 2020-2022 학부생 Team Leaf에게 감사드립니다. AGF, AB, DJP 및 DLR은 현대 및 화석 잎을 측정하고 이 프로토콜을 수정하고 업데이트하는 데 귀중한 의견을 제공한 Wesleyan University와 Baylor University의 많은 학부생에게 감사를 표합니다. 저자들은 PBot Quantitative Traits Working Group과 PBOT 팀이 이 프로토콜을 공식화하여 더 광범위한 커뮤니티에서 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 작업을 장려한 것에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation, DLR에 EAR-0742363 보조금, DJP에 EAR-132552 보조금)과 베일러 대학교(Baylor University, DJP에 젊은 연구자 개발 프로그램)의 지원을 받았다. 이 프로토콜의 명확성과 포괄성을 개선하는 데 도움이 된 피드백을 주신 두 명의 익명의 검토자와 Review Editor에게 감사드립니다.
Copy stand or tripod | For fossil photography | ||
Digital camera | For fossil photography, high resolution camera preferred | ||
Image editing software | For digital preperation. Examples include Adobe Photoshop and GIMP, the latter of which is free (https://www.gimp.org/) | ||
ImageJ software | IJ1.46pr | For making digital measurments, free software (https://imagej.net/ij/index.html) | |
Microsoft Excel | Microsoft | Or similar software for data entry | |
R software | The R foundation | For running provided R script (https://www.r-project.org/). R studio offers a user friendly R enviornment (https://posit.co/download/rstudio-desktop/). Both are free. | |
dilp R Package | Can be installed following instructions here: https://github.com/mjbutrim/dilp |