방법 논문

고용량 흡착 추출 프로브 및 GC-MS를 사용한 물과 물고기에서 Geosmin 및 2-Methylisoborneol의 추출 및 검출

DOI:

10.3791/67280

⸱

2025년 7월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aquaculture Research Institute, University of Maine, 2Markes International Ltd, 3Markes International GmbH, 4USDA-ARS-National Cold Water Marine Aquaculture Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 물과 지질이 풍부한 어류 조직에서 지오스민 및 2-메틸이소보르네올을 추출하기 위한 완전 자동화된 워크플로우를 제공합니다. 이 방법을 사용하면 이러한 분자가 냄새 임계값에 도달하기 전에 조기에 감지할 수 있습니다. 양식 환경의 대표적인 데이터가 제공됩니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지오스민(Geosmin)과 2-메틸이소보르네올(2-methylisoborneol)은 미생물 기원의 휘발성 유기 화합물로, 순환하는 양식 시스템에서 자주 발생하며 극히 낮은 농도에서도 그 안에 있는 물고기에게 불쾌한 냄새와 풍미를 부여합니다. 어류에서 이러한 화합물에 대한 기존 분석 방법은 충분한 샘플 처리량을 달성하는 데 어려움을 겪고 있으며 자동화되지 않는 경우가 많아 광범위한 실습 준비가 필요합니다. 당사는 고용량 흡착 추출 단계를 지닌 금속 프로브를 사용하여 물과 물고기 조직에서 각각 지오스민 및 2-메틸이소보르네올을 분석하는 방법을 개발했습니다. 물과 물고기 조직 모두에서 강력하고 정량적인 검출이 이루어졌으며, 최소 검출 한계는 물에서 지오스민의 경우 1.2ng/L, 2-메틸이소보르네올의 경우 1.1ng/L, 물고기 조직에서 각각 18.1ng/kg 및 13.6ng/kg입니다. 이러한 농도는 인간의 감지 임계값보다 훨씬 낮았습니다. 따라서 우리는 이러한 방법이 인간이 인식할 수 있게 되기 전에 지오스민과 2-메틸이소보르네올을 검출할 수 있다는 결론을 내렸습니다. 교반봉 흡착 추출과 같은 다른 고용량 흡착 추출 기법과 달리, 이 기법은 완전 자동화가 가능하여 처리량을 획기적으로 개선하고 수동 처리 오류를 방지할 수 있으며, 프로브의 내구성 있는 설계로 인해 고체상 미세추출법(SPME) 광섬유에서 흔히 볼 수 있는 파손을 방지할 수 있습니다. 이 방법은 모든 수질 설정에서 냄새 물질을 모니터링하는 데 적합할 뿐만 아니라 고체 및 반고체 매트릭스에서 이취 화합물을 검출하는 데 적합합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지오스민(GSM)과 2-메틸이소보르네올(MIB)은 미생물 대사의 부산물로 물과 토양에서 자연적으로 발생합니다 1,2. 일반적으로 환경이나 인체 건강에 해롭지는 않지만, 불쾌한 '흙 냄새'와 '탁한'냄새와 풍미를 물에 부여하며, 이는 GSM 및 MIB의 경우 각각 10 및 20 ng / L의 낮은 농도에서도 감지 할 수 있습니다 3,4. 따라서 이러한 냄새 물질의 존재는 인지된 수질을 감소시키고 대부분의 상황에서 매우 바람직하지 않습니다. 내륙 수로에서 냄새 물질은 방문객에 대한 매력을 떨어뜨리고 환경 당국에 불만을 유발할 수 있으며5, 식수에서 냄새 물질은 소비자가 용납할 수 없는 불쾌한 냄새와 맛을 전달합니다6. 실제로, 많은 국가들이 음용수 내 냄새 농도에 대한 규제 제한을 부과하고 있으며, 중국은 10ng/L를 최대 GSM 농도 허용치로 규정하고 있습니다7.

재순환 양식 시스템(RAS)은 어류 생산 수단으로 양식 산업에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 이러한 시스템은 육지에서 작동하고 지속적으로 물을 재사용하므로 환경에 미치는 영향을 줄이지만 어류 사육을 위한 최적의 조건을 유지하려면 RAS 물을 광범위하게 여과해야 합니다. 이동층 바이오필터는 물고기 배설물과 먹지 않은 사료에 풍부한 영양분으로 인해 미생물에 의해 군집화됩니다8. 이러한 미생물은 질소 폐기물과 과도한 영양소를 제거하는 데 유익합니다. 그러나 일부 종은 GSM, MIB 및 기타 냄새 물질을 생산할 수 있습니다4. 그런 다음 이러한 냄새 물질은 물 속으로 스며들어 생선의 살에 흡수되어 소비자가 불쾌감을 느끼는 불쾌한 냄새와 풍미 특성을 부여할 수 있습니다. 어육의 냄새 역치값은 종에 따라 다르지만, RAS에서 흔히 볼 수 있는 대서양 연어의 경우 GSM의 경우 44 - 500 ng/kg, MIB4의 경우 >900 ng/kg입니다. 따라서 RAS 운영자는 시스템의 GSM 및 MIB 농도를 정기적으로 모니터링하여 문제가 있는 수준4에 도달하지 않도록 해야 합니다. 영향을 받은 생선은 필레의 품질을 회복하기 위해 수확 전에 맛이 좋지 않은 화합물을 제거할 수 있습니다. 그러나 이것은 시설에서 물의 재순환을 중지하고 대신 10-14일 동안 시스템을 통해 새로운 물을 흐르게 해야 하는 비용이 많이 드는 프로세스입니다9. GSM 및 MIB가 광범위한 산업 분야에서 지속적이고 경제적으로 비용이 많이 드는 문제를 제기한다는 점을 감안할 때 검출을 위한 분석 방법을 재평가하고 개선하는 것이 합리적입니다. 이상적으로, RAS 작업자는 RAS 물을 모두 모니터링하여 문제가 발생하기 전에 증가하는 GSM 및 MIB 농도를 식별하고, GSM 및 MIB 수준이 제품 품질에 영향을 미쳤는지 여부와 그 정도를 결정하기 위해 어류 조직을 모니터링할 수 있어야 합니다.

GSM 및 MIB를 검출하는 대부분의 방법은 분리 및 검출을 위해 질량 분광계(MS) 또는 화염 이온화 검출기(FID)와 함께 가스 크로마토그래피(GC)를 사용하지만, 물 매트릭스에서 취취 물질을 처음 추출하는 방법은 매우 다양하며 많은 방법이 발표되어 있습니다10. 그처럼 다양한 방법들이 시험되어 왔고 실제로 여전히 일상적으로 사용되고 있다는 것은 각 방법마다 상당한 단점이 있다는 사실을 말해 준다. 이러한 단점으로는 액체-액체 추출(LLE)과 같이 큰 시료 크기와 많은 양의 용매가 필요하거나, 헤드스페이스 기반 방법에서와 같이 낮은 감도 및 수분 간섭이 필요하거나, 퍼지 및 트랩(P 및 T)과 같은 캐리오버 및 시스템 오염과 관련된 광범위한 문제가 있습니다.

흡착 추출은 다양한 추출 기법을 포함하며, 고체 흡착 단계를 사용하여 시료 위의 헤드 스페이스 또는 직접 침지10을 통해 시료 자체에서 냄새 물질을 추출할 수 있습니다. 이러한 기술은 다른 기술보다 더 적은 양의 시료와 호환되고 용매가 필요하지 않으며 일반적으로 물 간섭의 영향을 심하게 받지 않습니다. 그러나 가장 일반적인 흡착 추출 형태인 고체상 미량 추출법(SPME)은 분석물 용량이 낮은 소량의 흡착상만 사용하므로 추출 효율성이 제한됩니다. 또한, 관련된 부서지기 쉬운 섬유가 손상되거나 파손될 수 있으며11 작업 흐름이 중단될 수 있습니다. 교반봉 흡착 추출(SBSE)은 더 큰 상 부피와 더 내구성 있는 설계로 이러한 어려움을 극복하지만 쉽게 자동화할 수 없어 교반봉을 시료로, 시료에서 열 탈착 튜브로 수동으로 이동해야 합니다12. 높은 처리량이 중요한 일상적인 수질 검사의 맥락에서 이러한 자동화 부족은 중요한 장벽입니다.

이 방법의 목표는 시료 처리량 및 전체 흡착 추출 용량과 관련하여 앞서 언급한 방법을 개선하는 것입니다. 따라서 우리는 GSM 및 MIB의 정량적 고처리량 분석을 위해 SBSE의 높은 분석물 용량과 견고성을 SPME의 상 선택 및 자동화와 결합하여 고용량 흡착 추출(HCSE) 프로브를 사용하는 기술을 개발했습니다. 약간의 수정을 통해 이 기술은 물 샘플과 균질화된 물고기 조직 샘플 모두에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 프로토콜을 전체적으로 설명하고 재현 가능하고 선형적이며 매우 민감하다는 것을 보여주는 검증 데이터를 제시합니다. 여기서는 양식 샘플이 시연 목적으로 사용되지만, 이 프로토콜은 물, 토양 및 다양한 식품을 포함한 광범위한 샘플 유형에서 냄새 물질을 모니터링하는 데 적합합니다. 완전 자동화 덕분에, 이 프로토콜은 샘플 수가 많을 것으로 예상되는 경우에 특히 유용합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

물고기 샘플은 사람이 먹기 위해 이미 도살된 동물에서 채취한 것입니다. 따라서 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.

1. 교정 및 내부 표준물질 준비

  1. 교정 표준물질 준비
    1. 100mL 용량 플라스크에 10μL의 지오스민 및 2-메틸이소보르네올 용액(100μg/mL)을 추가하고 LC-MS 등급 메탄올로 부피를 채워 원액 C1을 준비합니다. 생성된 용액에는 각 분석물이 10μg/L(ppb)로 포함됩니다.
    2. 표 1에 표시된 부피의 C1 원액을 100mL 용량 플라스크에 첨가하고 탈이온수로 부피를 채워 검량 표준물질을 준비합니다.
    3. 매일 새로운 교정 표준물질을 만드십시오, 이는 매우 부패하기 쉬우므로 이러한 표준물질을 만드십시오.
      참고: 이러한 원액을 매일 신선하게 준비하는 것이 중요합니다.
  2. 내부 표준물질 준비
    1. LC-MS 등급 메탄올로 부피를 채운 1L 부피 플라스크에 10mg의 2-이소프로필-3-메톡시피라진(IPMP)(>98% 순수) 10mg을 첨가하여 10mg/L 스톡을 만들어 원액(I1)을 준비합니다.
    2. 100μL의 용액 I1을 100mL 용량 플라스크에 피펫팅하고 탈이온수를 부피까지 채워 용액 I2(10μg/L)를 제공합니다. 모든 시료 바이알에 50μL를 주입하여 최종 농도 100ng/L에 도달합니다.

2. 수질 분석

  1. 시료 전처리
    1. 시료 트레이에 분석 중인 각 물 시료에 대해 20mL 바이알 1개를 놓습니다.
    2. 보정된 저울을 사용하여 무게를 측정하고 각 20mL 크림프 상단 샘플 바이알에 2.5g의 NaCl을 넣습니다.
      알림: 소금을 추가하면 MIB와 지오스민이 물에서 헤드스페이스로 전달되는 것이 향상됩니다.
    3. 피펫 또는 병 뚜껑 디스펜서를 사용하여 각 20mL 크림프 상단 샘플 바이알에 샘플 물 5mL를 추가합니다.
    4. 내부 표준물질 용액 I2를 각 샘플, 보정 표준물질 및 블랭크를 포함한 모든 QA/QC 샘플에 50μL를 피펫팅합니다.
    5. 바이알 위에 캡을 놓고 바이알 압착 도구로 밀봉하여 분석물 손실을 최소화합니다.
    6. 한 번에 1-2개의 샘플만 처리하고 완료되면 각 바이알을 신속하게 밀봉하여 휘발성 분석물의 분석물 손실을 최소화합니다.
  2. 분석물 추출(물)
    1. 샘플 트레이를 오토샘플러 트레이 홀더에 놓습니다.
    2. Instrument Method를 준비하려면 Instrument 프로그램을 열고 Method Editor를 클릭합니다.
      1. Method Editor에 다음 파라미터를 입력하여 새 Method를 생성합니다(다른 파라미터는 기본값으로 유지).
      2. 'Pre-sampling'에서 Vial Agitation Time 을 10분으로 설정하여 분석물이 물에서 헤드스페이스로 분할될 수 있도록 합니다.
      3. '샘플링'에서 배양 온도를 65°C로, 배양 시간을 30분으로, 교반기 속도를 400rpm으로 설정합니다.
      4. 'wash HiSorb 프로브'가 활성화되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 잔류 샘플 매트릭스가 시스템을 오염시킬 수 있습니다.
      5. '프로브 탈착'에서 탈착 시간을 15분으로 설정하고 D흡착 온도를 270°C로 설정합니다.
      6. 트랩 설정에서 트랩 저온을 25°C로 설정하고 '분할 흐름'을 8mL/분으로 설정합니다.
    3. 각 프로그램에서 시작 버튼을 눌러 GC-MS 방법과 함께 자동 시료 주입기 방법을 실행합니다.

3. 물고기 조직 분석

  1. 시료 전처리
    1. 분석 중인 각 물고기 샘플에 대해 20mL 바이알 1개를 샘플 트레이에 놓습니다.
    2. 시판되는 식품 가공업체를 사용하여 물고기 조직을 균질화합니다.
    3. 보정된 저울을 사용하여 균질화된 물고기 조직 1.00g을 각 바이알에 넣습니다.
    4. 각 바이알에 포화 NaCl 용액 5mL를 피펫팅합니다.
    5. 내부 표준물질 용액 I2를 100 μL를 각 시료, 교정 시료 및 모든 QA/QC 시료에 피펫팅합니다.
    6. 바이알 위에 캡을 놓고 바이알 압착 도구로 밀봉합니다.
    7. 반휘발성 및 휘발성 화합물의 손실을 줄이기 위해 한 번에 1-2개의 샘플만 준비하십시오.
  2. 분석물 추출(물고기)
    1. 샘플 트레이를 오토샘플러 트레이 홀더에 놓습니다.
    2. 다음과 같이 Instrument Method를 준비합니다(다른 파라미터는 기본값으로 유지).
      알림: 사전 샘플링 바이알 교반 시간 및 배양 온도는 섹션 2.2.2와 다릅니다.
      1. 'Pre-sampling'에서 바이알 교반 시간을 20 분으로 설정합니다.
      2. '샘플링'에서 배양 온도를 80°C로, 배양 시간을 30분으로, 교반기 속도를 400rpm으로 설정합니다.
      3. '세척 HiSorb 프로브'가 활성화되어 있는지 확인하십시오.amp그렇지 않으면 잔류 샘플 매트릭스가 시스템을 오염시킬 수 있습니다.
      4. '프로브 탈착'에서 탈착 시간을 15분으로 설정하고 탈착 온도를 270°C로 설정합니다.
      5. 트랩 설정에서 트랩 저온 을 25°C로 설정하고 분할 흐름을 8mL/분으로 설정합니다.
        참고: 물에 비해 지질이 풍부한 어류 조직에 대한 MIB 및 GSM의 친화도가 더 높기 때문에 여기에서 더 길고 더 뜨거운 사전 샘플링 단계가 필요합니다.
    3. 각 프로그램에서 시작 버튼을 눌러 GC-MS 방법과 함께 자동 시료 주입기 방법을 실행합니다.

4. GC-MS를 이용한 분리 및 검출

  1. 물 및 어류 조직 분석법에 대해 동일한 GC-MS 파라미터를 사용합니다.
  2. GC에 5MS, 30m x 0.25mm x 0.25μm 컬럼이 장착되어 있고 초순수 헬륨 운반 가스가 공급되는지 확인합니다. 캐리어 유속을 2mL/분으로 설정합니다.
  3. 다음과 같이 GC 오븐 프로그램을 준비합니다: 초기 온도 60°C, 3분 유지, 10°C/분에서 100°C, 20°C/분에서 190°C, 30°C/분에서 280°C, 최종 유지 시간 2분. 총 실행 시간은 16.5분으로 설정됩니다.
  4. GC와 MS 사이의 전달 라인을 280°C로, 이온 소스와 4배 사이의 전달 라인을 각각 250°C와 200°C로 설정합니다.
  5. 스캔 모드에서 MS 감지를 위해 m/z 50-350의 스캔 범위를 사용하십시오.
  6. 선택된 이온 모니터링(SIM) 작업의 경우 MIB의 경우 m/z 95 및 107, IPMP의 경우 m/z 137 및 152, GSM의 경우 m/z 112 및 55의 이온을 각각 정량화 및 확인 사용합니다.
    참고: 많은 크로마토그래피 소프트웨어 패키지에는 자동 피크 선택 기능이 있지만 피크 선택에 오류가 있는지 수동으로 검토하는 것이 좋습니다.

결과

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분석법 최적화

이 방법이 최적화되었는지 확인하기 위해 캐리오버 평가, 프로브 탈착 시간 최적화, 내부 표준물질 평가, 프로브 위상 평가, 선형성 및 반복성 평가, 방법 검출 한계 계산 등 다양한 실험이 수행되었습니다.

이월 평가

우리는 250°C의 프로브 탈착 온도로 실험을 시작했습니다. 교정 표준은 표 1과 같이 준비되었습니다. 캐리오버(carryover)를 평가하기 위해 20ng/L에서 GSM 및 MIB 표준물질을 분석한 다음 컬럼에 아무것도 주입하지 않고 GC-MS 매개변수를 실행하고(컬럼 블랭크), 주입기에서 아무것도 전달하지 않고 포커싱 트랩을 탈착(트랩 블랭크), 프로브를 삽입하지 않고 주입기를 가열(주입기 블랭크), 및 사전 샘플링 없이 프로브의 탈착(프로브 블랭크). 컬럼 블랭크, 트랩 블랭크 및 주입기 블랭크에서는 1% 미만의 캐리오버가 관찰되었지만, 프로브 블랭크에서는 GSM 및 MIB에 대해 각각 9.35% 및 3.77%의 캐리오버가 관찰되었습니다(표 2). 따라서 사용된 조건에서 PDMS 프로브에서 GSM의 상당한 이월이 있다고 판단했습니다.

탈착 시간 최적화

PDMS 프로브에서 캐리오버를 확인한 후 프로브 탈착 온도를 조정하여 이 문제를 해결하고자 했습니다. 프로브 탈착 온도가 높을수록 프로브의 분석물 탈착 속도가 증가하여 15분의 프로브 탈착 시간이 끝날 때까지 탈착이 더 완료될 것으로 예상됩니다. 그러나 더 높은 온도는 분석물 분해를 촉진하여 감도에 부정적인 영향을 미칠 수도 있습니다. 더 높은 온도는 또한 흡착성 재료를 손상시킬 수 있으므로 280°C 이상의 온도는 피해야 합니다. GSM의 캐리오버는 250°C 프로브 탈착 온도에서 유의했지만, 270°C를 대신 사용했을 때 5% 허용 임계값 이하로 크게 감소했습니다(그림 1). 이러한 개선은 감도 손실 없이 이루어졌으며, 초기 분석을 위해 생성된 피크 면적은 270°C에서 더 낮은 프로브 탈착 온도보다 더 작지 않았습니다(그림 1). 이는 분석물 분해의 증가가 무시할 수 있음을 나타냅니다.

내부 표준 사용

화합물 2-isopropyl-3-methoxypyrozine은 GSM 및 MIB13을 검출하는 동안 내부 표준으로 널리 사용되었습니다. 계산된 GSM 및 MIB 농도를 내부 표준물질 보정이 있거나 없는 경우 모두 알려진 스파이크 농도와 비교했습니다. 내부 표준물질 보정이 없는 회수율은 알려진 스파이크 농도의 60%에서 계산된 농도로 인해 불량했습니다(그림 2). 반면, 내부 표준 보정을 적용한 경우 100% 영역에서 회수율이 매우 양호했습니다. 따라서 향후 모든 분석에서 내부 표준물질 보정을 적용했습니다.

위상 선택

SPME 분석에서 감도를 개선하기 위해 PDMS에 CWR(carbon wide range) 및/또는 DVB(divinyl benzene)를 추가하는 경우가 많지만 이로 인해 비용이 증가합니다. 우리는 프로브의 증가된 위상 부피가 SPME 파이버에 비해 감도를 향상시킬 가능성이 있다는 점을 고려하여 PDMS 전용 프로브를 삼상(DVB/CWR/PDMS) 프로브와 비교하고자 했습니다. PDMS 및 3상 프로브에 대한 복구 데이터(그림 3)는 두 프로브 유형 간에 대체로 유사한 성능을 보여주며, PDMS 프로브의 경우 복구율이 100%에 약간 가깝습니다. 따라서 성능이 약간 우수하고 비용이 절감된 점을 감안하여 향후 모든 분석을 PDMS 프로브로 수행했습니다. 프로브는 샘플 매트릭스와의 직접적인 접촉을 통하지 않고 헤드스페이스에서 분석물을 수집하기 때문에 상 물질에 대한 GSM/MIB 분할의 역학은 물과 물고기 샘플 간에 차이가 없어야 합니다.

메서드 유효성 검사

1에서 100ng/L까지의 물 내 6가지 농도의 분석물을 포함하는 일련의 보정 시리즈를 분석했습니다(그림 4). GSM의 경우 0.9999, MIB의 경우 0.9999의 r2 로 우수한 선형성이 달성되었습니다. 회귀의 표준 오차는 GSM과 MIB에 대해 각각 0.43과 0.37이었다. 이는 이 방법이 평가된 범위에 대한 정량 분석에 적합하다는 것을 나타냅니다. 수중에서 40ng/L에서 GSM 및 MIB를 포함하는 실험실 표준물질의 8회 반복에서 반복성을 결정했습니다. RSD 값은 GSM의 경우 6.3%, MIB의 경우 4.8%로 결과의 놀라운 재현성을 보여주었습니다. 이러한 반복실험은 서로 다른 날에 세 개의 개별 배치로 분석되어 분석의 정확성을 더욱 입증했습니다. 따라서 GC-MS 분석을 통한 HCSE는 정량적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다.

최소 검출 한계(MDL)

MDL은 미국 EPA 프로토콜14 에 따라 스파이크 물(n=10) 또는 스파이크 물고기 샘플(n=11)을 사용하여 계산되었습니다. 물에서 GSM 및 MIB의 추출 및 검출 방법은 GSM의 경우 1.2ng/L, MIB의 경우 1.1ng/L의 검출 한계를 생성했습니다. 이러한 MDL은 각각 약 10 및 20 ng/L의 인간 냄새 임계값보다 훨씬 낮았습니다. 따라서 제안된 방법은 이러한 냄새 분자가 인간의 감각 임계값에 도달하기 전에 축적되는 것을 자신 있고 정량적으로 감지할 수 있습니다. 물고기에서 GSM 및 MIB의 추출 및 검출에 대한 검출 한계는 GSM의 경우 18.1ng/kg, MIB의 경우 13.6ng/kg입니다.

양식업의 물 샘플 분석

우리는 7개의 순환 양식 시스템에서 채취한 물 샘플을 분석했으며, 각각에 대해 5개의 복제(시스템 3) 또는 3개의 복제(다른 모든 시스템)를 평가했습니다. 분석된 재순환 양식 시스템 중 하나를 제외한 모든 시스템에서 MDL보다 높은 농도의 지오스민과 MIB가 함유되어 있으며(그림 5), 이는 수질에 잠재적인 문제가 있음을 나타냅니다. 그러나 모든 사례에서 MIB가 인간 냄새 임계값인 20ng/L보다 훨씬 낮았으며, GSM 냄새 임계값인 10ng/L(시스템 1, GSM 농도 = 12.69ng/L)을 초과한 시스템은 하나뿐이었습니다. 시스템 3에서 GSM과 MIB를 검출하기는 했지만, MIB의 농도가 계산된 MDL보다 낮으므로 농도를 자신 있게 정량화할 수 없습니다. 이 방법은 실제 물 샘플을 사용했음에도 불구하고 각 시스템의 복제 샘플 간에 계산된 농도의 변동이 거의 없었음에도 불구하고 모든 시스템에서 인상적인 정밀도를 보여주었습니다(그림 5).

물고기 조직 분석

지질이 풍부한 물고기 조직은 이 방법 동안 GSM 및 MIB의 추출을 방해하는 강력한 매트릭스 효과를 부여합니다. 이러한 이유로 물 추출 방법에 비해 더 높은 배양 온도(80°C)와 더 긴 배양 시간(20분)을 포함하여 추출 효율을 높이기 위해 방법에 미묘한 변화가 있습니다. 배경 농도 GSM 및 MIB를 결정하기 위해 이전에 물고기 조직을 분석했습니다. 그런 다음 동일한 샘플에 알려진 양의 GSM 및 MIB를 스파이크하고 3회로 분석하여 회수율과 정밀도를 확인했습니다(그림 6).

figure-results-1
그림 1: 캐리오버에 대한 프로브 탈착 온도의 영향. (A) 20ng/L에서 GSM 및 MIB를 포함하는 실험실 표준물질을 평균 피크 면적과 함께 3개의 프로브 탈착 온도 중 하나에서 분석했습니다. 이후 각 프로브를 초기 온도에서 두 번 더 탈착하여 (B) (GSM) 및 (C) (MIB)의 결과로 캐리오버를 평가했습니다. 캐리오버(carryover)는 초기 피크 면적의 퍼센트로 피크 면적으로 표현됩니다. 오차 막대는 3번의 반복실험에 걸친 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 내부 표준 사용. 15 또는 40 ng/L에서 분석 표준에 대한 보정된 데이터 복구 데이터와 보정되지 않은 데이터 복구 데이터를 비교하며, PDMS 프로브에 의한 추출만 가능합니다. 샘플 농도는 IPMP를 내부 표준물질로 사용하여 보정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

figure-results-3
그림 3: 분석물 회수율. PDMS 전용 또는 삼상(PDMS, DVB, CWR) 프로브에 의한 추출을 통해 15ng/L에서 GSM(왼쪽) 및 MIB(오른쪽)의 분석 표준에 대한 복구 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 분석적 검량 곡선. GSM에 대한 검량선의 선형 회귀(실선, r2 /0.9999; S=0.37) 및 MIB(파선, r2 /0.9999; S=0.37)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5 : 양식 용수 적용. 7개의 양식 시스템(각 시스템에 대해 n ≥ 3)에서 채취한 물 샘플의 (A) GSM 및 (B) MIB 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

figure-results-6
그림 6:  물고기 조직 적용. GSM과 MIB(F1 및 F2)로 급증한 두 물고기 샘플의 GSM 및 MIB 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

솔루션 이름주식 C1 볼륨이 추가됨총 부피결과 농도
재고 C110ul100ml10ug/ml
칼 110 ul100 밀리리터1 ng/L
칼 220 ul100 밀리리터2ng/L
칼 550 ul100 밀리리터5 ng/L
칼 10100 ul100 밀리리터10 ng/L
칼 20200 ul100 밀리리터20 ng/L
칼 50500 ul100 밀리리터50 ng/L
칼 1001000 ul100 밀리리터100 ng/L
칼 2002000 ul100ml200 ng/L

표 1: 교정 표준. 지오스민 및 2-MIB 표준은 모두 메탄올에 CRM47525 지오스민 및 2-메틸이소보르네올 용액(100μg/mL)으로 제조된 것을 메탄올에 담근 원액 C1(10μg/ml)로 희석했습니다.

분석이월(%)
증권 시세 표시기MIB (MIB)
GC 실행0.040.08
트랩 탈착0.090
입구 탈착00
프로브 재탈착9.353.77

표 2: 프로브 캐리오버 평가. 20ng/L에서 GSM 및 MIB를 포함하는 실험실 표준물질의 추출, 탈착 및 GC-MS 분석 후 이월, 30ng/L에서 내부 표준 IPMP를 사용합니다. 분석에 대한 설명은 2.2.1에 나와 있습니다.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GSM 및 MIB는 광범위한 수질 모니터링 환경에서 발생하는 이취 화합물이며 테스트 용량에 대한 수요가 높습니다. 또한 GSM 및 MIB는 미량 수준에서 인간이 인식할 수 있습니다. 따라서 이상적인 분석 시스템은 높은 감도와 높은 처리량을 결합하여 많은 양의 고품질 데이터를 생성해야 합니다. 이전 섹션에서 HCSE 프로브를 사용한 추출이 필요한 것 이상의 감도를 제공한다는 것을 입증했습니다.

HCSE 프로브의 견고한 설계는 SPME 워크플로우를 방해할 수 있는 문제인 파손을 방지합니다. 분석법 최적화 이후에는 P 및 T 분석법의 일반적인 문제인 시스템 오염 또는 캐리오버(carryover)와 관련된 어려움을 겪지 않았습니다. 그러나 이 방법의 높은 처리량에 가장 큰 기여를 한 것은 의심할 여지 없이 사용된 자동 시료 주입기 플랫폼에서 비롯되었습니다. 이 시스템을 사용하면 시료를 시료 트레이에만 공급하기 위해 수동 개입이 필요하면서 24시간 내내 분석이 계속되었습니다. 이는 수동 작동이 필요한 SBSE와 같은 다른 고용량 흡착 추출 방법과 대조됩니다. SPME는 일반적으로 완전 자동화되어 있지만, 일반적으로 이전 샘플이 GC 컬럼에 주입된 후에만 다음 샘플의 배양을 시작할 수 있다는 점에서 처리량이 제한됩니다. 따라서 GC cycle time이 짧다고 가정하면 GC는 다음 샘플이 추출을 완료하는 동안 유휴 상태로 유지될 수 있습니다. 당사의 방법을 사용하면 여러 샘플이 사전 샘플링 및 추출을 동시에 수행할 수 있어 GC 가동 중단 시간을 최소화할 수 있습니다. 따라서 시스템당 시간당 1.8개의 샘플을 처리할 수 있었습니다.

GSM 및 MIB에 대해 각각 1.2 및 1.1ng/L의 MDL을 입증하여 지금까지 필요한 감도를 능가했습니다. P 및 T, LLE, SBSE 및 SPME와 같은 다른 기술은 특정 상황에서 더 낮은 MDL에 도달할 수 있지만11, 이러한 감도 증가는 실용적 가치가 제한적이며 위에서 설명한 HCSE 프로브의 이점을 잃는 것을 정당화하지 않습니다. 또한 이러한 기술 중 일부는 많은 양의 시료를 필요로 하며 이에 따라 폐기물 생성 및 운송 비용이 증가합니다. LLE의 경우 시료 부피는 일반적으로 200 - 500 mL 15,16,17 범위인 반면 SPME, SBSE 및 P 및 T의 경우 일반적인 값은 10 - 100 mL 18,19,20,21,22입니다. GSM 및 MIB에 대해 각각 6.34% 및 4.82%의 RSD 값으로 우수한 재현성이 관찰되었습니다. 이러한 값은 다른 분석법11에서 발견되는 값과 대체로 유사하며, 특히 발표된 SPME 분석법23,24에서 RSD를 능가합니다. 다시 말하지만, 당사의 낮은 RSD 값은 5mL의 시료 부피로 달성되었으며, 이는 발표된 대다수의 추출 기술보다 낮습니다. 따라서 당사는 HCSE 프로브가 모든 주요 대안의 장점을 하나의 간단하고 완전 자동화되며 지속 가능한 단일 분석법으로 결합하는 광범위한 이점과 함께 충분한 감도 및 재현성을 제공한다고 확신합니다.

지오스민(Geosmin)과 2-메틸이소보르네올(2-methylisoborneol)은 친유성 화합물로, 분석을 위해 지질이 풍부한 조직에서 이러한 화합물을 추출하려는 과학자들에게 어려운 과제입니다. 따라서 우리는 더 길고 더 뜨거운 사전 샘플링 절차를 사용하여 사전 샘플링 조건을 조정하여 샘플 매트릭스에서 헤드스페이스로 더 많은 분석물을 유도했습니다. 이러한 조정을 수행한 후 이 방법이 어류 조직의 GSM 및 MIB를 분석하는 데 효과적이라는 것을 확인했습니다. 지질 함량이 매우 높은 샘플의 경우 사용되는 샘플의 질량을 예를 들어 0.50g으로 줄여야 할 수도 있습니다. 이는 지질이 물 위에 완전한 밀봉을 형성하여 분석물이 헤드 스페이스에 도달하는 것을 방지하는 것을 방지하기 위한 것입니다.

이 방법은 평형 원리를 사용하여 샘플의 헤드스페이스에서 분석물을 추출합니다. 우리는 여기에서 양식에서 얻은 물과 물고기 샘플을 사용하지만, 이 방법은 20mL 샘플링 바이알 내에서 균질화 및 수용될 수 있는 모든 고체 또는 액체 매트릭스에서 냄새 물질을 추출하는 데 적용할 수 있다고 믿습니다. 응용 프로그램의 예로는 환경 용수 및 토양 모니터링, 음용수 테스트, 과일 및 채소와 같은 식품 또는 농장에서 재배하지 않는 수생 생물 테스트가 있습니다. 농업에서 GSM과 MIB는 종종 습한 토양에서 발견되며 그곳에서 자라는 작물에 이취를 줄 수 있습니다2 따라서 품질 관리의 한 형태로 냄새 수준을 모니터링하거나 악취 불만의 원인을 진단하기 위해 당사의 방법을 통해 토양과 작물 모두를 테스트 할 수 있습니다. 강과 호수와 같은 많은 환경수는 조류 대발생으로 인해 계절에 따라 냄새 농도가 급증하며,25 이 방법은 이러한 급증의 정도를 모니터링할 수 있는 처리량이 많고 매우 민감한 수단을 제공합니다. 이 방법은 예를 들어, 미생물에 의한 냄새 물질 생산 속도를 측정하거나(26 ) 물과 동물 조직(27)에서 냄새 물질 농도 사이의 관계를 조사하는 것과 같은 학술 연구에도 적합합니다. 다른 연구 그룹에서는 HCSE 공정을 사용하여 알코올 음료(28), 양고기(29), 올리브 오일(30), 인간 세포 배양 배지(31 ) 및 피스타치오(32)와 같은 다양한 샘플 유형에서 추출했습니다. 이러한 연구는 다른 분석물을 대상으로 하거나 비표적 프로파일링 연구이므로 GSM 및 MIB 분석에 최적화되지 않았지만 HCSE 프로브 추출을 위한 다양한 샘플 유형 준비에 대한 일반적인 통찰력을 제공하므로 여기에 제시됩니다.

설명된 수처리 방법은 최소한의 수정으로 모든 수성 또는 수성 샘플에 적용할 수 있지만, 다른 고체 또는 반고체 샘플에 적용하려면 샘플 준비(섹션 3.1) 및 분석물 추출(섹션 3.2)에 대한 매트릭스별 변경이 필요할 수 있습니다. 여기에서 모든 샘플링 시나리오를 다룰 수는 없지만 다음과 같은 고려 사항을 제공합니다. (1) 고체 샘플은 대표성을 보장하고 분석물의 배출을 위한 최대 표면적을 제공하기 위해 격자, 분쇄 또는 혼합을 통해 미세한 분말로 균질화되어야 합니다. (2) 지질 함량이 낮은 고체 샘플은 물이나 소금을 첨가할 필요가 없을 수 있습니다 - 즉, 바이알과 캡에 1.00g의 무게를 측정하기에 충분할 수 있습니다. 이를 통해 샘플 매트릭스에서 주입된 수분으로의 중간 전달 없이 샘플에서 헤드스페이스로 분석물을 보다 직접적으로 전달할 수 있습니다. 그러나 이것은 교반의 효능을 감소시킵니다. 분석가는 표본 매트릭스에 대한 최적의 표본 전처리 기법을 결정하기 위해 실험을 수행해야 합니다. (3) 다른 매트릭스는 GSM 및 MIB에 대해 다른 친화도를 갖습니다. 따라서 적시에 분석물 평형에 도달하기 위해서는 다양한 배양 온도가 필요합니다. 그러나 일부 매트릭스는 고온에서 화학 반응에 의해 간섭이 생성되도록 열에 의해 화학적으로 변경될 수 있습니다. 다시 말하지만, 특정 샘플 유형에 대한 최적의 배양 온도를 결정하기 위해서는 실험이 필요합니다(참고: 수분 함량이 높은 샘플은 끓는 물의 증기압으로 인해 바이알이 부서지는 것을 방지하기 위해 90°C 이상에서 배양해서는 안 됩니다).

우리는 물과 물고기 조직에서 지오스민과 2-메틸이소보르네올을 검출하는 방법을 개발했습니다. 실험실 표준에 대한 테스트를 통해 이 방법이 정량적이고 재현 가능하다는 것을 확인할 수 있으며, 실제 샘플(재순환 양식 시스템의 물, 이러한 시스템에서 파생된 어류 조직)에 적용하면 복잡하고 더러운 샘플의 맥락에서도 성능이 입증됩니다. 당사의 방법을 양식용 샘플에 적용했지만, 물 및 고체 또는 반고체 물질을 포함한 광범위한 샘플 유형에서 GSM 및 MIB 모니터링에 적합하다고 제안합니다.

공개 사항

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이 출판물의 저자는 Markes International Ltd 또는 Markes International GmbH에서 시스템 교육, 시스템 프로토콜, 실험 설계 및 집필을 지원했습니다. 우리 연구에서 편견 또는 인지된 편견을 피하기 위해 모든 실험실 연구 및 데이터 분석은 미국 농무부-농업 연구 서비스(USDA-ARS)와 메인 대학의 양식 연구소의 직접적인 감독 하에 메인 대학교에서 수행되었습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

사용된 장비를 구입하기 위한 자금을 지원하고 이 모든 연구를 완료하기 위한 지속적인 자금을 지원해 주신 미국 농무부 농업 연구 서비스(USDA-ARS)에 감사드립니다. 또한 이 연구를 진행하는 동안 도움을 주신 Heather Hamlin 박사, Amalia Harrington 박사, Deborah Bouchard 박사, Sarah Turner 박사, Gareth Dobson, Cameron Coulombe 및 Abriah James 박사에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5-10uL 피펫니치펫 에어A21405581
1000uL 피펫 팁VWR76322-154
100-1000uL 피펫에펜도르프285612
100mL 유리 플라스크VWR76008-704
10-100uL 피펫니치펫 에어A20814031
10-100uL 피펫 팁메가24502-18
10xL 피펫 팁VWR76322-132
20mL 유리 비커VWR10754-698
2-이소프로필-3-메톡시피라진TCII0577내부 표준
40ml 호박색 type-1(붕규산) 유리 바이알환경 샘플링 회사0040-0400-QC물 샘플링 바이알
5mL 피펫 팁VistaLab 기술4058-5102
저울VWRVWR-124B2
Centri 360MarkesU-CENTRI-1691자동 시료 주입기
Chromeleon 버전 7.3Thermo ScientificGC-MS 소프트웨어
포커싱 트랩MarkesU-T12ME-2S
가스 크로마토그래프, Trace 1310Thermo Scientific14800403
GC 컬럼Thermo Scientific26098-1420TG-5MS
지오스민 및 2-메틸이소보르네올 용액SIGMA-ALDRICH 또는 MilliporeSigmaCRM47525
헤드스페이스 바이알, 20 mLMarkesC-VCC20
HiSorb 핸들MarkesC-HH-6
HiSorb 인젝터 캡MarkesC-HSPCCS
HiSorb 인젝터 라이너MarkesU-LINER-HISORB
HiSorb 프로브, PDMS, 짧은 버전MarkesH1-XXABC
HiSorb 바이알 캡MarkesC-HSPCCS
실험실 금속 스쿱
질량 분석기, ISQ 7000Thermo ScientificISQ7K-NOVPI
메탄올VWR 화학 물질BDH1135-4LP
메탄올, Optima LC-MS 등급Fisher-scientificA456-4
O-링 크기 201MarkesU-COV201HiSorb 인젝터 캡 및 HiSorb 보관용
Ovation 자동 피펫터(100-5000uL)VistaLab 기술213626
보라색 니트릴-Xtra 파우더 프리 시험 장갑Kimtech50602-54
염화나트륨( 소금)VWR 화학BDH9286-2.5K
스위칭 어댑터(자동 피펫터)CUI INCSMI10-5
바이알 압착 도구MarkesU-HSVCR
바이알 디캡퍼MarkesU-HSVDC
계량 보트Grainger8AG69

참고문헌

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