형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

Summary

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

Abstract

직접 관찰은 과학적 발견과 이해를 위한 근본적인 방법입니다. 타임랩스 단일 분자 형광 영상은 개별 단백질이 움직이고 주변과 상호작용하는 과정을 관찰할 수 있게 하여, 보통 집단 측정에서는 숨겨져 보이는 상태들을 볼 수 있게 합니다. 단일 단백질 추적은 특히 막 단백질 연구에 적합하며, 2차원적 특성 덕분에 단일 형광체 감도로 빠르고 광범위한 영상 촬영이 가능합니다. 세포막 또는 말초막 단백질(예: 원형질막이나 다양한 세포 유형의 세포내 소기관 막)이 발견되는 막을 모방하는 인공 지질 이중층을 사용하면 근자연 환경에서 특정 상호작용을 측정할 수 있습니다. 또한 한 번에 한 성분씩 점진적으로 복잡성을 추가할 수 있게 하면서, 형광과 라만 산란으로 인한 배경 간섭을 억제할 수 있습니다. 온도 조절을 추가하면 단일 입자 상호작용의 열역학적 특성도 확인할 수 있습니다. 본 연구에서는 Aquaporin-4를 이용한 지질 이층에서 샘플 준비, 데이터 수집, 단일 분자 형광 추적 및 막 단백질 궤적 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 연구는 기초 사례로서 다양한 단백질과 이중층 조성에 적용할 수 있습니다.

Introduction

자연 생물학적 조건에서 막 단백질은 다른 막 단백질, 세포 내 및 세포외 액체 내 단백질, 다양한 종류의 지질과 콜레스테롤, 기질 또는 리간드, 용액 상호작용, 세포외 및 세포 내 매트릭스 간 상호작용 등 광범위한 상호작용 네트워크에 둘러싸여 있습니다. 특정하고 집단적인 상호작용을 더 잘 이해하기 위한 고전적인 생물물리학적 접근법은 단일 구성 요소에서 시작해 점차 하나씩 추가 요소를 도입하여 복잡성이 원래의 환경을 반영할 때까지 진행하는 '분할 정복(Divide and Conquer)' 생물물리학 접근법입니다. 이러한 상호작용을 연구하는 현대적 분자 규모의 방법은 타임랩스 단일 분자 형광 영상을 이용한 직접 관찰을 통해 개별 단백질이 이동하고 환경과 상호작용하는 과정을 추적하는 것입니다. 이 논문에서는 석영 커버슬립에서 지질 이중층을 형성하고, 단일 단백질 이미징에 적합한 방식으로 대형 막 단백질을 이 미리 만들어진 이중층에 삽입하는 등 이 접근법의 기본 단계를 설명합니다. 이후 지지 이중층 내 단일 단백질을 추적하는 '워크호스' 프로토콜이 이어질 예정입니다.

이 글에서는 친수성 석영 덮개 슬립에서 파열되는 작은 단알멜라 소포(SUV)를 이용해 고체 지지 지질 이중층을 만드는 방법을 설명합니다. 석영 표면은 산성 세척 또는 자외선(UV) 오존 세척으로 처리됩니다. SUV를 만드는 데 사용되는 지질은 가능하면 관심 있는 생물학적 막의 주요 화학 조성과 일치해야 합니다(예: 아쿠아포린-4(AQP4)는 성상교세포 원형질막에 존재하며, 주요 성분은 POPC(46.4%), POPE(8.5%), PS(5.6%), 콜레스테롤(30%), PI(2.5%), SM(5.6^{%)입니다1,2}). 고체 기판과의 상호작용을 방지하기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 첨가제가 지질에 접목하여 이중층을 표면에서 들어 올립니다 ^3,4. 각 첨가물의 양은 단백질 확산이 방해되지 않도록 신중하게 조절되어야 하며, 동시에 막을 기판 표면에서 들어 올릴 수 있을 만큼 충분한 지지력을 제공해야 합니다. PEGylated 지질과 같은 첨가제는 일반적으로 두 단계로 나뉩니다: '브러시 단계'와 '버섯 단계'입니다. 브러시 단계는 PEG가 높은 농도일 때 발생하며, 이로 인해 고분자가 입체 장애를 줄이기 위해 직립하게 됩니다. 버섯상은 고분자들이 충분히 분리되어 무작위 코일로 존재할 때 낮은 농도에서 발생합니다. 일반적으로 브러시 단계는 확산을 방해하지만, 버섯 단계는 거의 지지를 제공하지 않습니다. 브러시 단계와 버섯 단계 사이의 농도는 최적이며, 확산에 미치는 영향이 최소화된 지지력을 제공합니다 ^3,4.

일부 막 단백질은 P450과 사이토크롬 P450 환원효소⁵와 같이 고체 지지 지질막에 자발적으로 삽입되지만, 다른 단백질은 세제를 사용해 삽입해야 하는 섬세한 과정이 있습니다. 이 세제들과 단일 단백질 추적에 방해가 될 수 있는 미포함 단백질을 제거하기 위해서는 신중한 세척이 필요하며, 이 과정은 자세히 설명될 것입니다. 이 글의 주요 초점은 타임랩스 형광 영상을 이용한 단일 분자 추적(SMT)용 샘플 준비입니다. 이 방법은 고배율과 수치 조리개(NA)를 가진 대물렌즈가 필요하며, 보통 100배 및 1.45 NA 오일 침지 대물렌즈 ^6,7. 또한 빠르고 고감도의 카메라(EMCCD, CMOS, 또는 ICCD 카메라)와 레이저 여기가 필요합니다. 레이저 여기는 긴 단백질 궤적을 측정할 수 있을 만큼 충분히 넓은 시야각을 커버해야 하며, 이는 보통 전반사를 이용해 약 50 μm x 100 μm의 에반시트 필드를 만들거나, 빔 셰이핑 옵틱스(가우시안에서 탑햇까지)로 약 80 μm x 80 μm⁸ 크기의 에피 조명을 사용하거나, TIRF와 유사한 시야를 가진 고경사 적층 광학 시트(HILO)를 사용해 달성됩니다. 전반사 형광(TIRF) 현미경은 배경 신호를 줄이는 장점이 있습니다. 아래에는 간단하고 비교적 저렴한 TIRF 현미경 설계가 제시되어 있습니다. 온도 조절을 추가함으로써 엔탈피, 엔트로피, 깁스 자유 에너지⁹와 같은 여러 열역학적 특성을 측정할 수 있습니다. 또한 이 기술은 대부분의 막 단백질이 형광 태그를 부착하도록 하는 정도의 형광 표지가 필요하다.

이 글에서 주목하는 막관통 단백질은 AQP4입니다. AQP4는 성상교세포의 끝발과 중추신경계 혈관의 다른 부위에서 분극된 수관^입니다. 초당 최대 30억 개의 물 분자를 운반할 수 있으며, 수분 항상성, 세포 이동, 뇌 부종, 학습, 시냅스 가소성을 통한 기억 형성에 관여합니다¹¹. AQP4 기능의 조절 이상은 뇌부종, 신경 척수염, 간질 등 다양한 신경학적 질환과 연관되어 있습니다^{12, 13, 14, 15}. AQP4는 아이소폼에 따라 32-37 kD 단백질이며, 8개의 소수성 막 도메인이 결합 루프로 연결된 사양체 4차 구조, 세포 내 N-말단 도메인, 그리고 큰 세포 내 C-말단 도메인¹⁶을 가지고 있습니다. AQP4의 주요 동형형은 M1과 M23이며; 차이는 메티오닌 1 잔기와 메티오닌 23 잔기에서 시작되는 점에서 발생합니다. 연구에 따르면 M1 아이소폼은 팔미토일화 상태에 따라 스스로와 쌍 또는 삼합체를 형성할 수 있습니다^. M23 아이소폼은 직교 입자 배열(OAPs)이라 불리는 큰 단백질 집합체로 조립됩니다. 공동 발현 시 M1 아이소폼은 OAP의 외부 17,18,19 주변에 말초 단백질 코팅을 형성하여 OAP의 성장을 제한합니다. OAP 집집의 역학은 뇌의 수투과성과 항상성 조절에 중요한 요인일 수 있습니다. 이 글에서는 막 내 개별 AQP4를 추적하고 단일 단백질-단백질 상호작용을 관찰하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

Protocol

1. 작은 단층 소포의 준비

1. 냉동실에서 지질 스톡 용액을 꺼내 실온에 두세요.
2. 깨끗한 10mL 플라스크를 오븐에서 꺼내 실온까지 식히세요.
3. 차가운 둥근바닥 플라스크에 분광 등급 클로로포름 900 μL와 분광 등급 메탄올 100 μL를 넣은 후, 혼합물에 적절한 양의 각 지질을 첨가합니다. 플라스크를 돌려 지질이 잘 섞이도록 하세요.
   참고: 다른 저자들은 클로로포름과 메탄올의 비율이 다르지만, 균일한 지질 케이크를 형성하는 데 가장 좋은 비율은 9:1임을 발견했습니다.
   보 충 파일 1에는 지질 양을 정확히 계산하는 스프레드시트가 제공됩니다. 기질 표면에서 지질 이중층 형성을 확인하기 위해 지질을 준비할 때는 형광 표지된 지질을 사용하세요.
4. 그림 1에 보이는 것처럼 둥근 바닥 플라스크 위에 진공 증류 커넥터를 놓고, 질소 라인(건조 장치)에 연결합니다.
   참고: 정제된 N₂(g)를 사용하고, 건조 장치에 연결하기 전에 0.22 μm 필터를 통과시키세요.
5. N₂(g)를 켜고 압력을 조절해 손등에 거의 닿지 않을 정도로 흐름을 조절하세요.
   참고: 손등을 적시면 증발을 감지하는 데 도움이 됩니다.
6. N₂(g) 유량으로 2.5-3시간 건조시키며, 질소가 계속 흐르는지 주기적으로 점검합니다. 샘플은 아마도 처음 30분 이내에 건조해 보일 것입니다; 남은 용매를 제거하기 위해 추가로 2-2.5시간 동안 질소를 계속 흐르세요.
   참고: 샘플은 하룻밤 건조도 가능합니다.
7. 둥근 바닥 플라스크에 총 지질 5.0 μmol당 완충액 1mL를 추가합니다.
   참고: 본 연구에서 사용된 완충제는 100 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 140 mM NaCl로 구성되었으며; 이 완충제는 샘플 준비 전반에 걸쳐 사용됩니다.
8. 플라스크 위에 유리 마개를 올려놓고 파라핀 필름으로 감싸세요.
9. 플라스크를 링 스탠드 위의 클램프에 넣고, 플라스크 바닥을 60°C로 설정된 소닉케이터 욕조에 담가둡니다. 플라스크를 1시간 동안 부드럽게 돌려 15분마다 부드럽게 돌려 다층 지포좀을 만들어 플라스크에 지질이 붙지 않은 불투명한 용액으로 나타납니다.
10. 1시간 인큐베이션 후 소닉케이터(~35 kHz)를 켜고 진폭을 최고 설정으로 설정하세요. 그런 다음 플라스크를 욕조 안에서 움직이며 용액이 플라스크 안에서 부딪히고 분사되도록 가장 큰 교란이 일어나는 위치를 찾습니다. 소닉 30분간 소닉 처리를 해보세요. 불투명함에서 투명함과 약간 오팔센트 색으로 변하는 느낌을 찾고 있습니다.
11. 플라스크에서 지질 용액을 제거하여 마이크로 원심분리관에 넣은 후, 100,000 × g 에서 4 °C에서 1시간 동안 원심분리합니다. 미세원심분리관에서 상청액을 제거하세요.
    참고: 튜브 바닥에 작은 펠릿이 형성될 수 있습니다. 알갱이가 크면 버리고 같은 과정을 반복하세요.
12. 원심분리 후 SUV를 사용하고, 일주일간 4°C에서 보관하거나, 트레할로스와 함께 -80°C에서 보관하세요.
    참고: 권장 트레할로스 양은 지질 용액 1mL당 1mg입니다. 최적의 결과를 위해 새 SUV는 매주 제작하여 냉장고에 보관할 수 있습니다.
    참고: 이것은 SUV 준비 방법 중 하나일 뿐입니다. SUV 외에도 소형, 중형, 대형 유니라멜라 소포클이 전기형성을 통해 압출 또는 거대 유니라멜라 리포좀을 통해 생성될 수 ^{있습니다.}

2. 단백질 표지

참고: NHS 에스터와 말레이마이드 등 다양한 접합체를 이용한 형광 프로브로 단백질을 표지하는 것은 잘 문서화되고 잘 알려져 있습니다. 하지만 단일 단백질 추적에서는 표지 정도(DOL)가 특히 중요합니다. 이 연구에서는 각 AQP4 테트라머에서 막관통 단백질의 표지 비율과 형광체의 분포를 결정하는 것이 필수적이었습니다.

1. 0.22 μm 필터를 통과한 pH 8.3의 0.1 M 인산 완충액이 담긴 비커에 투석관을 넣습니다. 그 후 버퍼에 하룻밤 동안 뒤집힌 상태로 두어 막이 컨디셔닝할 시간을 줍니다.
2. 다음 날에는 투석관 안의 완충제를 단백질 용액으로 교체하세요.
   참고: 단백질 용액의 부피는 20-250 μL 이내여야 합니다. 용액 내에 용해된 단백질이 ~1-5mg이어야 합니다.
3. 단백질을 투석관에 넣으면 0.1 M 인산 완충액에 거꾸로 하룻밤 동안 두세요.
4. 투석 후에는 단백질을 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
5. 2.1단계를 반복하여 새로운 투석관을 준비하세요.
6. NHS 염료를 몇 알갱이(3-4)를 작은 무게 용지에 바르고, 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮긴 후 100 μL DSMO에 녹입니다. 이후 DMSO에서 1mL 10배 희석 두 차례를 수행하며, 최종 희석을 통해 UV-가시 분광법을 이용해 각 샘플의 농도를 결정합니다. 평균 DOL을 2-3으로 만들려면 부드럽게 흔들면서 단백질 용액에 반응성 염료를 몰 3배 초과 첨가하세요.
   참고: 표준 UV-vis 분광기로도 충분하지만, 샘플 크기가 적은 부피 분광기가 유리합니다.
7. 반응성 염료를 단백질이 같은 양의 마이크로 원심분리관에 넣습니다. 반응성 염료와 단백질이 함께 첨가되면, 최소 8시간 동안 너테이팅하세요.
8. 이닝 후에는 표지된 단백질을 2.5단계에서 준비한 투석관으로 옮겨 신선한 인산염 완충제가 담긴 비커에 넣습니다. 버퍼 안에 교반봉을 넣고 6시간 동안 부드럽게 돌리고, 그 후 버퍼 교체와 6시간 더 투석을 하세요.
9. 두 번의 완충 교환 후, 표지된 단백질이 담긴 투석관을 최종 작동 완충제가 담긴 깨끗한 비커에 넣습니다.
   참고: 본 연구에서 사용된 최종 작동 완충제는 pH 7.4에서 100 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 140 mM NaCl로 구성되었습니다.
10. 투석 후에는 UV-vis 분광기를 사용해 DOL을 측정하세요.
    참고: DOL 측정 시 표준 방법을 따르는 것이 중요합니다. 아래는 계산을 위한 방정식입니다.
    (1)
    여기서 염료 피크에서 측정된 흡수도는 280nm 에서 측정된 값이고, 단백질 피크는 입니다. 단백질의 소멸계수는 (단백질의 분자량에서 계산됨)이며 , 와 는 염료 제조업체에서 제공합니다.

3. 25mm 직경 석영 커버슬립 준비

참고: 아래는 두 가지 다른 방법이 있습니다:

1. 애시드 워시
   참고: 피라냐 및 베이스 에칭을 포함한 여러 산세척 방법이 발표되어 있습니다. 아래 절차는 부식 없이 매우 깨끗하고 친수성 표면을 제공하여, 형광 영상을 이용한 단일 분자 연구에 적합하다는 것을 발견했습니다.
   1. 산성 세척 방법은 용액을 가열할 때 후드와 개인 보호 장비(고글, 실험복, 장갑)가 필요합니다. 유출 사고를 대비해 후드에 탄산수소나트륨 분사 병을 준비해 두어야 합니다.
   2. 커버슬립을 비커에 넣고 나노순수, 30% 과산화수소, 농축질산을 부피 대비 같은 비율(1:1:1 용액)으로 채웁니다.
   3. 이 용액에 커버슬립을 30분간 가열해 용액이 거품이 생기기 시작할 때까지 가열하세요.
   4. 용액을 확인하고 10분마다 부드럽게 휘저으며 커버슬립이 서로 달라붙지 않도록 섞으세요. 용액을 휘저을 때 미끄러져 나갔다가 분리되는 것을 관찰하세요. 분리되면 점차 속도를 줄여 분리를 유지하고, 거품이 생기는 용액이 슬립을 감싸도록 하세요.
      참고: 반응 과정에서 열이 발생하므로 용액을 너무 세게 가열해서는 안 됩니다. 핫플레이트를 부드럽게 끓는 상태로 조절하세요, 보통 가장 낮은 설정으로요. 이 설정에서는 용액이 ~70 °C로 유지됩니다. 신선한 과산화수소도 권장됩니다.
   5. 30분이 지나거나 용액이 거품이 멈추면, 1:1:1 용액을 실온까지 식힌 후, 정제된 물로 부드럽게 휘저으며 커버슬립을 깨끗이 씻어냅니다.
2. 자외선 오존
   1. 석영 커버슬립을 n-헥산으로 닦은 다음, 그 다음 메탄올로 렌즈 티슈를 사용해 닦으세요.
   2. 커버슬립을 UV 오존 클리너에 넣고, 처리할 표면을 램프를 향하게 하세요.
   3. 산소를 5psi로 5분간 챔버에 흘려보내세요; 그다음 산소 흐름을 차단하세요.
   4. 다음으로, UV 조명을 15분간 켜고, 커버슬립을 최소 10분 정도 두어 오존이 빠져나가도록 하세요.
   5. 어느 세척 방법이든 사용한 후에는 깨끗한 커버슬립을 즉시 사용하세요. 이전에 세척한 슬립을 사용할 경우, 표면을 재생하기 위해 이 과정을 반복하세요.
      참고: 자외선 오존화는 공기 중 오존을 제거하기 위해 꾸준한 순환이 필요합니다. 시스템은 공기 처리 스노클 아래나 훈풍 후드에 설치해야 합니다.

4. 이중층 형성 및 AQP4의 이중층 막 내 통합

참고: 본 연구에서 사용된 완충제는 pH 7.4에서 100 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 140 mM NaCl로 구성되었습니다.

1. 새로 청소한 커버슬립을 1/4인치 SM1 렌즈 튜브를 사용해 25mm 샘플 홀더에 넣으세요. 그 다음 직경 8mm의 이중 층 파라필름 가스켓을 절단하여 샘플 홀더 중앙에 위치시킵니다( 그림 3 참조).
2. 8mm 개스킷 중앙에 50 μL 방울을 떨어뜨리고 밀봉한 후 37°C에서 1시간 배양합니다.
   참고: 이로 인해 리포좀이 친수성 석영 표면과 융합하여 파열되어 연속적인 이중층을 형성합니다.
   개스킷 면적에 첨가되는 리포좀의 양은 다양할 수 있으며, 더 큰 개스킷은 연속적인 이중층을 형성하기 위해 더 많은 리포좀이 필요할 수 있습니다. 하지만 4.2단계에서 명시된 양은 거의 항상 연속 이중층 형성을 촉진합니다.
3. 배양 후에는 피펫으로 샘플을 헹구어 용액을 제거합니다. 그 후 50μL의 신선한 버퍼를 이중층에 첨가합니다. 그 후 이 과정을 총 10번 반복합니다.
   참고: 피펫 팁이 지질 이중층에 닿지 않고, 이중층을 수분 상태로 유지하기 위해 일부 용액이 남아 있어야 합니다. 팁을 물방울 위쪽으로 가져가면 접촉하는 것을 볼 수 있습니다. 액상 표면과의 접촉을 최소화하면 이중층을 손상시키지 않고 제거할 수 있습니다. 결국 방울은 뒤집혀 가스켓 쪽으로 이동하며; 이 순간이 용액 제거를 멈추기에 가장 좋은 순간입니다. 이 지점에서 반사된 빛이 변할 것이며, 정지하라는 신호가 될 수 있습니다. 용액을 너무 많이 제거할까 걱정된다면, 세척 중 피펫 설정을 낮춰서 지질 이중층 위에 적당한 완충층을 남기세요.
   이러한 조건에서 지질 이중층 형성의 완전성은 광표백 후 형광 회복(FRAP)을 통해 사전에 평가할 수 있습니다. 이를 위해서는 지질 혼합물에 ^6,7,24,25로 형광 표지된 성분이 있어야 합니다.
4. 최종 세척이 끝난 후 다시 완충제를 제거하고 임계 미셀러 농도 이하의 세제 속 50 μL 알리코트를 첨가합니다. 37°C에서 단백질 섭취를 위해 최소 1시간을 두세요.
   참고: 세제는 이중층을 부드럽게 만들고 단백질이 막에 흡수되도록 돕습니다. 이 프로토콜에서 사용된 세제는 50 μM n-도데실-베타-D-티오말토사이드(DOTM)로, 비이온성 세제였으며, 단백질 농도는 2 nM이었습니다.
5. 한 시간 후에는 버퍼로 샘플을 헹구어 혼합되지 않은 단백질과 세제를 제거합니다.
6. 샘플에 상태 폴리스티렌 비즈(바이오비즈) 5mg을 추가하고, 최소 1시간 동안 방치한 후 제거하세요. 샘플은 이후 영상 촬영을 위해 준비됩니다(아래 참조).

5. 안티페이드 첨가제

1. 5mg의 트롤록스와 80mg의 D-포도당을 10mL의 완충제에 녹입니다(위 참조). 고형물이 남지 않을 때까지 흔들고 소용돌이로 돌립니다. 어두운 곳에서 하룻밤 동안 튜테이팅한 후, 0.22 μm 필터로 용액을 걸라줍니다. 매주 신선한 준비를 하세요.
2. 6.5mg의 포도당 산화효소(1650 U)와 8 μL 카탈라아제(버퍼 내 29,200 U/mL)를 92 μL 버퍼에 용해합니다. 용액을 부드럽게 섞은 후 원심분리기로 상원액을 새 튜브로 옮기세요. 4°C에서 보관하고 빛으로부터 보호하세요.
   참고: 이 용액은 냉장고에 몇 달간 보관할 수 있습니다; 하지만 흐림이 생기면 버리고 새 용액을 준비하세요.
3. 5.1 단계의 99 μL 용액과 5.2단계의 1 μL 용액을 새로운 튜브에 섞습니다. 샘플을 마지막으로 헹군 후에는 샘플 위에 안티페이드 용액(이미징 용액이라고 함)을 추가합니다.
   참고: 안티페이드 용액은 막관통 단백질의 기능을 변화시킬 수 있습니다; 시스템과의 호환성을 확인하는 것이 중요합니다.

6. 현미경 설치 및 설정

참고: 이 단일 분자 연구에는 맞춤형 TIRF 현미경이 사용되었습니다. 이 절에서는 신뢰할 수 있는 기기인 신속 타임랩스 이미징에 적합한 기본 형광 현미경의 주요 구성 요소와 주요 정렬 기법을 설명합니다(그림 4).

1. 633nm He:Ne 레이저를 사용해 샘플을 여기시키세요. 레이저는 밴드패스 필터와 1/4 웨이브판을 통과하여 레이저 선을 정교하게 하고, 선편광 빛에서 원형 편광 빛으로 여기를 변환합니다.
   참고: 원편광은 프로브의 방향 영향을 줄입니다.
2. 빔은 300mm 렌즈와 633nm 레이저 라인 필터를 통과하고, 633nm 롱패스 다이크로익 미러에 반사되며, 100배, 1.45 N/A 오일 현미경 대물렌즈 뒷면에 초점을 맞춥니다. 빔을 정렬하여 대물렌즈 중심을 부드럽게 통과하고 대물렌즈를 나올 때 곧게 유지되도록 하세요.
   참고: 이 시점에서 현미경은 에피형광(epi) 방식으로 설정되어 있습니다. 바닥이 투명한 큐벳에 소량의 분유를 첨가할 수 있습니다. 큐벳은 현미경 대물렌즈 위에 올려놓고 그 사이에 침수유를 한 방울 떨어뜨립니다. 이렇게 하면 빔이 대물렌즈를 곧장 통과하고 있음을 관찰할 수 있습니다.
3. 형광 표지된 단백질의 방출은 대물, 이색성 미러, 롱패스 필터, 300mm 렌즈를 통과한 후 EMCCD 카메라에 이미징됩니다. 카메라에서 이미지를 확대하고 초위치 정지(superlocalization) 정확도를 높이기 위해 더 긴 초점 거리의 튜브 렌즈를 사용하세요. 이는 느리게 움직이는 막관통 단백질과 응집체에 유익합니다. 카메라 픽셀을 나노미터 단위로 보정하는 것을 잊지 마세요.
   참고: 다만, 대물렌즈 제조사가 지정한 튜브 렌즈를 사용하면 1배 배율이 가능하며, 이는 형광을 더 적은 픽셀에 집중시켜 신호 대 잡음비를 높입니다. 일반적인 초점 거리로는 200mm, 180mm, 165mm, 164.5mm 렌즈가 있습니다. 1951년형 미 공군 배율 표적 사용을 권장합니다. 이 셋업에서 300mm 렌즈를 사용해 총 배율 170배에서 74nm의 픽셀 보정을 측정했습니다.
4. 대물렌즈 칼라와 펠티에 히터/칠러²⁶이 장착된 샘플 홀더를 사용하여 샘플 온도를 조절합니다.
   참고: 안정적인 온도를 유지하는 것은 현미경의 열 안정성을 보장하고 정확한 온도 의존 측정 및 기기 초점을 가능하게 하는 데 매우 중요합니다.
5. 압전 액추에이터는 시료를 XYZ 방향으로 이동시킵니다. 시료가 초점이 맞춰지면, 최종 회전 거울에 부착된 스테이지를 사용해 빔을 현미경 대물렌즈의 가장자리( 그림 4 참조)로 조정하여 임계 각도에 도달합니다. 이로 인해 에바네시트 여기장이 생성됩니다. 현미경은 현재 TIRF로 설정되어 있습니다.
   참고: 레이저의 역반사가 점이 아닌 선이고, 시료의 배경이 세기가 줄어들고 길어질 때 현미경이 TIRF에 있음을 알 수 있습니다.

7. 데이터 수집

참고: 빠른 데이터 수집을 위해 카메라가 설치되어야 합니다.

1. 수직 픽셀 이동 속도를 약 600 ns로 설정하고 수직 클럭 전압(보통 +4)을 오버클럭합니다. 그 다음, 수평 픽셀 읽기를 최대 설정(이 예시에서 16비트에서 30 MHz)으로 설정합니다. 프리앰프 게인을 2로 조정하고 전자 증폭을 위해 앰프 출력을 설정하세요. 마지막으로 전자 배강 이득을 최고 수준으로 설정하세요.
2. 노출을 25ms로 설정하세요. 25ms 노출 시에는 프레임 속도를 약간 더 길게 설정하세요(여기서 사용된 카메라는 25.802ms).
3. 레이저 출력을 배경보다 명확하게 높게 조절하세요.
   참고: 레이저 출력 조절은 어려울 수 있습니다. 너무 높으면 탐사선이 너무 빨리 표백된다; 너무 낮으면 신호 대 잡음비가 추적이 어려워집니다. 가장 약한 신호를 가진 입자의 경우, 신호가 배경보다 3-5배 더 높도록 출력을 설정하는 것을 권장합니다. 2절에서는 분자 밝기가 분포를 보이는 이유를 설명합니다.
4. 샘플당 최소 1,000개의 트랙을 제공할 수 있을 만큼 충분한 데이터를 수집하세요.

8. 추적 분석

참고: 우리 연구실에서는 단일 입자 추적 분석이 일반적으로 Crocker와 Grier의 연구를 바탕으로 MATLAB의 맞춤형 스크립트를 사용하고, 저자 ^3,26,27이 수정하여 수행됩니다. 아래는 연구 커뮤니티를 위해 무료로 제공되는 소프트웨어인 ImageJ를 사용한 설명입니다. 두 방법 모두 동일한 결과를 냅니다.

1. 데이터 세트를 일정한 크기로 크롭한 후 ImageJ로 배경 보정을 합니다.
   참고: 수집된 데이터가 세트별로 동일하면 자르기가 필요 없습니다. 이는 보통 관심 영역이 데이터 수집 사이에 카메라 센서에서 이동했을 때만 수행됩니다. ImageJ의 기능은 플러그인으로 크게 확장될 수 있습니다. 한 가지 방법은 FIJI를 설치하고 사용하는 것인데, FIJI는 표준 플러그인 세트와 함께 ImageJ가 번들로 제공됩니다. 이 플러그인들 중 하나가 TrackMate로, 여기 프로토콜^28,29에 사용될 예정입니다.
   ImageJ 위키 사이트에서는 다양한 플러그인에 대한 공략과 예제를 제공합니다. 또한 동영상 튜토리얼도 포함되어 있습니다.
2. FIJI 내에서 분석할 영화 또는 스택된 *.tif 파일을 드래그 앤 드롭하세요( 보조 파일 2 참조).
3. 픽셀 보정 세부 정보를 입력하세요. 분석 탭에서 '스케일 설정 '을 선택하고 기기의 픽셀-거리 보정을 적용하세요.
4. 원본에서 변경된 부분을 추적하기 위해 복사본을 저장하세요.
5. 선택한 창에서 배경을 빼고 원본 데이터의 저장된 복사본에 적용하세요. 프로세스 탭에서 배경 빼기를 선택하세요.
   참고: 이 내용은 데이터를 기반으로 최적화됩니다. 좋은 출발점은 이미징하는 입자보다 더 큰 '롤링 볼'을 사용하는 것입니다.
6. 플러그인 탭에서 Tracking | 트랙메이트. 이 과정에서 TrackMate 대화 창이 열리며, 사용자가 추적 과정을 안내합니다.
   참고: 트래킹이 완료되면 ImageJ 외부에서 추가 분석을 위해 트랙을 내보낼 수 있습니다.

9. 데이터 처리

참고: 여기서 논의한 것은 대표 데이터를 처리하는 방법과 스텝 크기 분포 계산 및 평균 확산 상수를 얻는 방법입니다.

1. 이미지 스택을 FIJI로 드래그 앤 드롭하세요; 그 다음 보정(74 nm/픽셀)을 적용합니다.
2. 5픽셀 너비의 롤링 볼 뺄셈을 사용해 배경을 빼는 것입니다. 필드를 네 개의 별도 11 μm x 11 μm 구역으로 자르고 별도로 분석합니다.
   참고: 이는 막 단백질을 추적할 때 여기장으로 인한 임계값 분산을 최소화하기 위한 것입니다.
3. TrackMate 플러그인을 시작하세요. 보정이 픽셀에 적용되었는지(보충 파일 3 참조) 그리고 시간이 원하는 범위를 커버하는지 확인하세요.
   1. TrackMate에서 입자의 검출 방법으로 가우시안의 라플라시안(LoG)을 선택하며, 프리프로세스 중앙값 필터를 사용해 직경 약 350nm로 추정됩니다. 미 리보기 버튼을 클릭하여 검출된 입자가 합리적인지 확인하세요.
      참고: 일부 입자는 분명히 배경에 있을 수 있습니다; 걱정하지 마세요 - 다음 단계에서 제거될 것입니다.
   2. 카운팅 설정에 만족하면 나머지 스택을 처리한 후 임계값을 설정합니다. 자동 임계값을 사용하거나 선택 박스를 드래그해서 임계값을 조정하세요.
   3. 검출된 입자를 시각화하는 방법을 선택한 후, 이 데이터셋에 대해 추적 방법을 선택하세요: Advanced Kalman Tracker, 탐색 반경은 350 nm, 최대 프레임 간격은 2프레임입니다.
      참고: 페널티, 트랙 분할, 트랙 합류 기능도 추가할 수 있습니다. 이 데이터셋은 추적만 수행되었습니다.
   4. 트랙을 어떻게 필터링하고 시각화할지 결정하세요.
      참고: 이 데이터셋에서는 검출된 점만 표시됩니다( 보충 파일 4 참조).
   5. 개별 트랙을 처리한 후, 트래킹 데이터를 XML 파일로 내보내 스프레드시트 편집 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다(보조 파일 5 참조).

Results

프로토콜 2절에서 설명한 대로, 라이신은 형광 염료 분자(NHS-염료)에 결합된 NHS 에스터를 사용하여 표지하였습니다. 단백질과 결합한 후 UV-Vis 분광기로 DOL을 측정합니다. 이 실험에서 AQP4 테트라머의 DOL은 4.12였습니다. 다음으로, 아래에 제시된 포아송 분포를 사용하여 각 AQP4 테트라머가 적어도 하나의 염료 분자를 가질 확률을 산출합니다.

(2)

P는 각 AQP4가 표지될 확률이고, 방정식 2를 사용하면 각 AQP4 테트라머에 형광 표지가 부착될 확률은 98%입니다. 사면체별 라벨 분포는 그림 2 에 나타나 있으며, 시료에서 관찰된 밝기 분포를 반영합니다.

이 예시 데이터에서 달성된 신호 대 잡음비는 단일 형광체의 경우 배경보다 8-9배 높았고, 가장 밝은 입자에서는 15-20배 이상이었습니다. 이 분산은 여기 빔의 위치와 프로토콜 2단계에서 설명된 DOL에서 발생합니다.

생성된 XML 파일 내에서 관심 있는 열은 J, K, L, M이며, 각각 입자 번호 ID, 입자가 검출된 프레임, 입자의 X 위치, Y 위치에 해당합니다( 보충 파일 6 참조). 파일의 두 번째 시트에서는 스텝 크기 분포와 평균 확산 계수가 계산되며, 스텝 크기는 입자가 프레임 간 이동하는 거리이고, 평균 확산은 식 3으로 주어집니다:

(3)

여기서 D_ave는 평균 확산 계수이고, Δt는 프레임 속도입니다. 이 방정식은 브라운 운동을 가정하는데, 이는 일반적으로 작은 변위에 유효하며, 개별 트랙 ^3,30,31 샘플에서 평균 제곱 변위 대 시간 태그를 분석하여 확인할 수 있습니다.

스텝 크기의 히스토그램은 확산하는 입자 분포를 보여주며, 이는 크기가 다른 OAPs에 기인할 수 있습니다(그림 5).

그림 1: 지질 건조 장치. 이 장치는 진공 증류 커넥터가 있는 10mL 둥근 바닥 플라스크로 구성되어 있습니다. 질소는 0.2 μm 주사기 필터를 통해 저압으로 유입되며, 이 필터는 노란색 합성 캡에 바늘이 연결되어 진공 증류 커넥터에 연결됩니다. 압력은 절단된 바늘이 달린 주사기에 연결된 타이곤 튜브를 통해 방출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 방정식 2를 사용한 각 AQP4 단위의 형광 표지의 예상 분포. 가장 유력한 형광체 수는 4개이며, 전체 AQP4의 98%는 형광 표지를 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 샘플 홀더 조립체. 조립체는 1인치 SM1 렌즈 튜브로 만들어졌으며, 수나사산을 제거하고 현미경 대물렌즈에 간섭을 방지하기 위해 경사선을 처리했습니다. 쿼츠 커버슬립과 파라필름 가스켓이 포함되어 있습니다. 전체 조립체는 SM1 고정 링으로 고정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 현미경. 오른쪽에는 현미경의 단순화된 도표가 있습니다; 초록색 선은 레이저에서 나오는 여기 빛을 나타냅니다. 오른쪽에서 레이저 빛이 1/4 파장판을 통과한 후 300mm 렌즈에 의해 초점이 맞춰집니다. 빛은 롱패스 이크로익 미러를 통해 대물렌즈에 반사되고, 뒤쪽 조리개에 초점이 맞춰집니다. 이동 거울을 사용해 여기 빔을 이동시키면, 빔이 대물렌즈 개구부 가장자리에 위치하여 시료 내에 에바네시트 필드를 생성합니다. 초점이 맞지 않는 빛은 대물렌즈에 의해 수집되며 빨간 선으로 표현됩니다. 방출된 빛은 다이크로익 필터를 거쳐 롱패스 필터를 거쳐 300mm 렌즈로 카메라에 초점을 맞추어 1.7배 광학 배율(대물렌즈와 튜브 렌즈 합산 170배 배율)을 제공합니다. 왼쪽에는 현미경의 이미지가 있습니다. 레이저를 올바르게 위치시키기 위해 추가 회전 거울이 사용된다는 점에 유의하세요. 동시에 검출 팔은 형광 표지된 막관통 단백질에서 광자를 최대한 수집하도록 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 스텝 크기 히스토그램. 빨간 원이 있는 파란 선은 모든 스텝 크기를 나타내는 히스토그램입니다. 검은 선은 여러 확산 계수에 적합한 것입니다. 스텝 크기 확률 분포는 다음과 같이 주어집니다: 여기서 f_i 는 각 확산 입자 유형의 분수 모집단으로, 각 입자가 브라운 운동을 겪는다고 가정할 때입니다. 히스토그램과 적합도는 느리게 움직이는 입자와 더 빠른 입자가 다양하게 분포되어 있음을 보여주며, 이는 여러 OAP 크기의 분포에 기인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 몰% 조성, 총 지질 양, 그리고 SUV 준비를 위한 선택적 형광/FRAP 성분을 산출하는 스프레드시트 계산기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: 궤적 추적에 사용되는 원시 단일 분자 형광 현미경 타임랩스 이미지 스택 (TrackMate 튜토리얼 소스 파일). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 3: 처리 전 강도와 배경을 보여주는 원시 단일 분자 형광 데이터의 애니메이션 미리보기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 4: 필터링된 입자 경로(임계값 이후)의 애니메이션으로, 시간에 따른 대표적인 AQP4 궤적을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 5: TrackMate 출력을 사용한 AQP4 분자의 전장 입자 추적을 보여주는 애니메이션 오버레이. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 6: 확산 분석에 사용된 추출된 궤적 좌표와 계산된 스텝 크기 분포를 보여주는 스프레드시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

이 글에서는 개별 막 단백질이 고체 지지 지질 이중층 막을 통과하며 서로 상호작용하는 과정을 직접 관찰하는 단일 입자 추적 방법을 소개합니다. AQP4는^{32, 33, 34} 등 다양한 아이소폼에 의해 조절되는 동적 자기 조립체를 형성할 수 있다는 점에서 대표적인 예로 선택되었습니다. 위에서 신뢰할 수 있는 샘플 준비 방법과 밀리초 단위로 단막 단백질을 추적하는 주요 매개변수를 개략적으로 제시합니다. 단계에는 (1) SUV 준비, (2) 적절한 형광 표지 수준 결정, (3) 고체 지지 이중층 내 막관통 단백질 샘플 생성, (5) 안티페이드 제제 준비, (6) 단순 단일 분자 현미경 제작, (7) 단일 분자 추적 데이터 수집, (8) ImageJ를 이용한 추적 데이터 분석 등이 포함됩니다.

설명된 단계별 방법은 개념적으로 직관적입니다; 하지만 각 중요한 단계마다 고유한 함정과 한계가 있습니다. 이 중 샘플 준비가 가장 어렵습니다(1-5단계). 따라서 몇 가지 세부 사항을 염두에 두어야 합니다. 첫 번째는 고체 지지 지질 이중층을 만드는 방법입니다. 주요 방법은 세 가지가 있습니다: (1) 랭뮤어-블로젯(LB), (2) SUV 융합 및 파열, (3) 스핀 코팅^{35, 36, 37, 38, 39}. 각 방법마다 장단점이 있습니다. 예를 들어, 랭뮤어-블로젯 방법은 이중층의 특성과 화학적 조성을 더 잘 제어하며, 두 리플렛 간의 비대칭 조성을 포함해 조절할 수 있게 하며, 다층의 형성을 통제된 방식으로 가능하게 합니다. 하지만 LB-트로프를 사용하는 것은 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 걸리며³⁵개를 확보하는 데 비용이 많이 듭니다. 스핀 코팅은 지질 이중층을 만드는 비교적 간단한 기술입니다; 하지만 다층층을 생성하는 경향이 있으며, 종종 비현실적으로 많은 양의 재료가^{필요합니다.} 소포 융합과 파열은 소량의 재료만으로 필요한 간단한 과정입니다. 하지만 친수성 표면을 만드는 것이 매우 중요하며, 일부 지질 조성은 소포 융합을 통해 이중층을 형성하는 경우가 더 쉽다(예: 우리 연구실에서는 순음전하를 가진 소포가 이가양이온과 연장된 인큐베이션 시간을 추가하면 소포 융합을 통해 이중층을 형성하는 것을 발견했다)⁴⁰. 친수성 표면을 형성하는 것(3단계) 외에도, 소포 융합을 통해 고체 지지 이중층을 형성할 때 중요한 고려사항은 막 단백질을 포함하기 전후로 새로 형성된 이중층을 세척하는 것입니다. 삽입 전 세척은 과도한 SUV와 더 큰 다층층 소포(MLV)를 제거하며, 막 삽입 후 마지막 세척은 포함되지 않은 단백질을 제거합니다. 세척이 부족하면 추적 연구 중에 배경 신호가 발생할 수 있습니다.

우리는 C12E9, Tween-20, TritonX-100 등 고체 지지 지질 이중층에 막 관통 단백질 삽입에 적합한지 판단하기 위해 다양한 세제를 선별했습니다. 저희가 선호하는 세제는 DOTM으로, 제거가 쉽고 막에 가장 부드럽기 때문입니다(막의 무결성을 손상시킬 가능성이 적습니다). 단백질 섭취량이 매우 중요합니다. 너무 많으면 단일 선로를 관찰하는 것이 불가능해집니다. 이 절차를 다른 막관통 단백질에 적용할 때는 시행착오를 거쳐 양을 조절해야 합니다. 하지만 이 절차에서 제시된 수치는 훌륭한 출발점입니다. 세제 양은 임계 미셀러 농도 이하로 유지해야 하며; 그렇지 않으면 이중층이 용해되어 석영 기판에서 제거됩니다.

지지하는 지질 이중층에 막 단백질을 삽입하는 방식은 각 실험 조건에 맞게 최적화되어야 합니다. 하지만 이를 달성하는 몇 가지 일반적인 방법이 있는데, 예를 들어 프로테올리포좀 사용과 막 단백질을 미리 형성된 이중층⁴¹에 직접 통합하는 방법이 있습니다. 프로테올리포솜은 SUV와 같은 지방체에 단백질이 박혀 있는 형태입니다. 이 프로테올리포좀은 미리 형성된 고체 지지 지질 이중층과 융합하거나, 이중층 형성⁴² 단계에서 SUV와 동시에 통합될 수 있습니다. 융합이 파열을 일으켜 단백질이 막 안으로 방출됩니다. 구현은 간단하지만, 막 단백질의 무작위 방향성을 초래합니다. 이로 인해 고체 지지층과 강한 상호작용이 일어나 단백질의 방향에 따라 다른 확산 특성을 가질 수 있습니다^. 이 프로토콜은 직접 통합을 이용하는 방법을 설명하며, 단백질 2,5,43,44 한쪽에 큰 친수성 도메인을 가진 AQP4 및 기타 막 단백질에 대한 방향 선호를 제공합니다.

직접 관찰은 과학적 발견에 사용되는 강력한 도구입니다. 동적 단일 분자 영상은 특히 막-단백질 생물물리학에서 중요하며, 개별 단백질의 움직임과 상호작용을 관찰하여 가설을 검증하거나 단백질의 행동을 더 잘 설명하는 새로운 가설을 생성하는 데 사용됩니다. 여기서 설명한 프로토콜과 방법은 2차원 고체 지지 지질 이중층에 이상적이지만, 다중 구성 요소², 생체 세포^{34, 45, 46, 47}, 3차원⁴⁸으로 확장할 수 있습니다. 단일 분자 추적은 2색 단일 분자 추적⁴⁹, 단일 분자 FRET^{50, 51}, 그리고 확률적 광학 재구성 현미경(STORM)과 점 축적 영상 나노스케일 지형(PAINT)과 같은 동적 초해상도 영상 등 다양한 실험의 문을 열어줍니다. 온도 조절 기능을 포함하도록 기기를 확장함으로써, 막 단백질의 열역학적 특성도 탐구할 수 있습니다 26,43,52.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 웨이브플레이트	토를랩	WPQ05M-633	레이저와 꼭 맞춰
100X 오일 대물렌즈	올림포스	12-563-659	1.45 N/A 아포크로매틱
16:0-18:1 PC	아반티 극지 지질	850457	POPC 인지질
체육 PEG2000 18:0	아반티 극지 지질	880210	암모늄 소금
300mm 렌즈	토를랩	AC254-300-A-ML
633 nm He:Ne 레이저	멜레 그리오	05-LHP-927	다른 소스나 다른 파장으로 변경할 수 있습니다
633nm 밴드패스 필터	크로마 테크	633/10X	사용되는 레이저와의 일치
655nm 롱패스 필터	크로마 테크	ET655LP	염료/레이저 파장에 맞게 바꾸세요
안도르 솔리스 1세	안도르	안도르 솔리스 1세	이미지 캡처용 소프트웨어
ATTO 655	ATTO-TEC	서기 655년	NHS-에스터 변형, 즉 단일 분자 작업에 적합한 변형된 모든 염료를 사용할 수 있습니다. ATTO가 권장되지만 Cy5/7도 사용할 수 있습니다
바이오비즈 SM-2 수지	바이오래드	1523922
염화칼슘	밀리포어 시그마	C4901
카탈라제	시그마-올드리치	C3155-50MG	소 간, 수성 소액, 그리고 GE에서 유래; 30000 단위/mg
클로로포름	피셔 사이언티픽	C547-1	HPLC 또는 분광 등급
콜레스테롤	시그마-올드리치	C8667-500MG
커버슬립	ESCO 옵틱스	R525000	25mm 쿼츠
이색성 빔스플리터	셈록	FF545/650-Di01-25x36	염료/레이저 파장에 맞게 바꾸세요
EMCCD 카메라	안도르	아이손 울트라 888
팔콘 튜브 15mL	그레이너 바이오-원	188261	셀레스타 세포 배양관
포도당 산화효소	시그마-올드리치	G2133-50KU	Aspergillus niger, VII 타입 및 ge에서 유래; 100,000 단위/g 고체 (산소 첨가 제외)
히트건	하버 프레이트	56434	파라필름 가열에 사용되며, 일반적으로 어떤 히트건이든 사용할 수 있습니다
젠장	피셔 바이오리에이전트	BP310-500
저자가형광 침수 오일	토를랩	모일-30
메토날	피셔 사이언티픽	A452-1	HPLC 또는 분광 등급
마이크로 원심분리관	VMR	525-1126	1.5 mL
마이크로 피페터	에펜도르프		다양한; 1000 & 마이크로; L, 100 및 마이크로; L 및 10 및 마이크로; L은 제안된다
& Oslash; 1.5인치 렌즈 튜브	토를랩	SM1.5L10	외부 나사산은 샘플 준비를 위해 잘라낸다
광학 표	뉴포트	RPR 릴라이언스	타벨의 크기는 사용 가능한 공간에 따라 달라집니다
광학 조직	토를랩	MC-50E	다양한 부품 청소
파라필름	밀리포어 시그마	P7669	과정 중에 가스 자체에 형광이 발생하지 않도록 확인하세요
압전 액추에이터	뉴포트	PZA12
공압 진동 차단기	뉴포트	I-2000 시리즈	광학 테이블의 불균형을 안정화하는 데 사용되었으며,
냉장 욕조	피셔 사이언티픽	아이소템프 3016
셔터 컨트롤러	토를랩	SC10	영상 소프트웨어와 연동됨
염화나트륨	밀리포어 시그마	S988
스테리톱 필터	밀리포어 시그마	S2GPT05RE
스위치박스 드라이버 및 컨트롤러	뉴포트	PZC200	스테이지 컨트롤러
주사기 필터	J.T. 베이커	SF01-98	PES 25mm 0.2 & 마이크로; M
TEC 요소	토를랩	TEC3-2.5	펠타이어 히트펌프를 샘플 홀더 및 대물렌즈 칼라에 연결하는 데 사용됩니다
온도 조절기	미어스테터 엔지니어링	TEC-1091
온도 감지기	토를랩	TH100PT
서미스터	토를랩	TH10K
튜브-O-투암기	G 생명과학	786-611	4K MWCO
UV 오존 클리너	노바스칸	PSDP_UV	프로 시리즈 - 디지털
줌 옵틱스	토를랩	SM1NR1