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방법 논문

뇌 오가노이드를 사용한 미토콘드리아 질환 모델링: 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드에 초점

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/69303

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2025년 10월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

이 논문에서

요약

뇌 오가노이드는 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드(MELAS) 연구를 위한 귀중한 모델 역할을 하며 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력을 제공하고 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공합니다. 질병 유발 유전자의 다양한 수준의 이형질을 가진 세포주에서 유래한 오가노이드는 상당한 표현형 차이를 나타냅니다.

초록

미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드(MELAS)는 미토콘드리아 tRNALeu의 m.3243A>G 변이체에 의해 가장 일반적으로 발생하는 미토콘드리아 장애입니다. MELAS의 병태생리학을 조사하기 위해 m.3243A>G 변이를 보유한 MELAS 환자로부터 유래한 다중 유도만능줄기세포(iPSC) 계통에서 뇌 오가노이드를 생성했습니다. 이 계통은 동일한 핵 유전적 배경을 공유하지만 m.3243A>G 변이체와 관련된 이형질 수준이 다릅니다. 우리는 오가노이드 크기, 형태 및 신경 유도 효율에서 유의미한 차이를 관찰했으며, 이는 이형질의 정도와 상관관계가 있습니다. 오가노이드에서 해리된 뉴런을 2D 배양 시스템으로 옮겼는데, 이는 편리하고 고처리량 약물 스크리닝에 적합합니다. 오가노이드는 또한 이형질 수준에 따라 신경망 형성에 상당한 차이를 보였습니다. 우리의 결과는 환자 유래 iPSC 기반 오가노이드 모델이 MELAS 메커니즘 연구 및 약물 스크리닝에 유용한 플랫폼을 나타낸다는 것을 시사합니다. 이 비디오는 오가노이드 생성 및 표현형 평가를 위한 프로토콜을 포함하여 포괄적이고 사용자 친화적인 방법을 제시합니다.

서론

미토콘드리아 근병증, 뇌병증, 유산산증, 뇌졸중 유사 에피소드(MELAS)는 신경 기능 장애, 뇌졸중 유사 에피소드 및 다양한 전신 증상을 특징으로 하는 미토콘드리아 질환입니다. 가장 흔한 원인은 미토콘드리아 류신 tRNA 유전자인 MT-TL1의 m.3243A>G 변이체입니다. 이 변이체는 안티코돈에서 타우린 변형을 손상시켜 류신 번역 효율을 감소시키고 MELAS 2,3,4에서 미토콘드리아 기능 장애에 기여하는 것으로 여겨집니다. 특히, 고용량 타우린 투여 후 증상의 개선이 보고되었습니다 5,6. 그러나 무반응자의 존재는 아직 확인되지 않은 추가적인 병태생리학적 메커니즘이 m.3243A>G 변이를 보유한 개인의 질병에 기여할 수 있음을 시사합니다.

유전적 변이에 의한 질병 메커니즘을 밝히기 위해서는 원인 변이를 제외하고는 모든 변수가 동일한 실험 모델을 사용하여 정확한 표현형 비교를 가능하게 하는 것이 이상적입니다. 게놈 편집 세포주와 수정된 변이가 있는 동물 모델은 종종 핵 유전자 장애에 대한 대조군으로 사용됩니다. 그러나 mtDNA 변이체의 복구는 고급 게놈편집 기술7을 사용하더라도 기술적으로 여전히 어렵습니다. 따라서 동일한 핵 배경을 가진 실험 모델을 확립하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 이형질 수준(즉, MT-TL1 m.3243A>G 변이체8)을 운반하는 미토콘드리아 DNA의 비율만 다른 동일한 MELAS 환자로부터 파생된 두 개의 유도만능줄기세포(iPSC) 계통을 활용하고 질병 모델로 뇌 오가노이드를 생성했습니다. 이형질 수준은 세포 계대 또는 분화 중에 변동하여 잠재적으로 표현형에 영향을 미치고 실험 결과에 배치 간 변동성을 유발할 수 있지만, 미토콘드리아 유전자 변이를 운반하는 환자 유래 세포는 질병 병인을 조사하는 데 여전히 가치가 있습니다.

본 연구에서는 MELAS 환자로부터 유래한 iPSC로부터 뇌 오가노이드를 생성하고 질병 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 병태생리학을 조사했습니다. 이형질 수준이 높고 낮은 2개의 iPSC 라인을 사용하여 신경 유도 효율의 유의미한 차이를 관찰했으며, 이는 이형질 정도와 상관관계가 있습니다. 우리의 연구 결과는 환자 유래 iPSC 기반 뇌 오가노이드가 MELAS의 기본 메커니즘을 밝히고 약물 스크리닝을 용이하게 하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공한다는 것을 시사합니다.

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프로토콜

두 개의 iPSC 계통(2-6 및 2-8)은 잘 확립된 방법8을 사용하여 동일한 MELAS 환자의 섬유아세포에서 파생되었습니다. 그들은 이형질 수준만 다릅니다. 건강한 개인으로부터 확립된 414C2 iPSC 계통을 대조군으로 사용하였다. 본 연구에 사용된 프로토콜은 기타사토 대학교 의과대학 윤리위원회(#G22-02)의 지침을 따랐습니다.

1. 세포 배양

  1. 냉동 세포 스톡 해동
    1. 제조업체의 지침에 따라 라미닌으로 코팅하여 6웰 플레이트를 준비합니다.
    2. 10μM ROCK 억제제를 함유한 피더가 없는 iPSC의 배양 배지를 37°C로 데웁니다.
    3. 액체 질소(LqN2) 탱크에서 냉동된 iPSC 바이알을 회수하고 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다.
    4. 해동된 현탁액을 예열된 배지 10mL에 옮깁니다. 실온(22°C)에서 5 분 동안 120×g에서 원심분리합니다.
    5. 상청액을 조심스럽게 제거하고 튜브를 두드려 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 신선한 배지와 시드 세포를 라미닌으로 미리 코팅된 6웰 플레이트에 추가합니다. 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
  2. 중간 변화
    1. 1-2일마다 배지(ROCK 억제제 제외)를 교체하십시오.

2. 대뇌 오가노이드의 생성

  1. 분화 시작(0일)
    1. iPSC(~70-80% 컨플루언트) 배양 플레이트에서 배지를 제거합니다. PBS로 세포를 세척합니다.
    2. 효소 용액을 첨가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 반응을 멈추기 위해 배지를 첨가하십시오. 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다. 실온(22°C)에서 5 분 동안 190×g에서 원심분리합니다.
    4. 30μM ROCK 억제제, 5μM SB431542 및 2.5μM IWP-2를 포함하는 분화 배지 1mL에 펠릿을 재현탁합니다.
      참고: 기본 매체는 1.1.2단계에서 사용된 것과 동일합니다.
    5. 세포를 세십시오. U자형, 96웰, 저부착 플레이트에 웰당 100μL에 3개 × 10개3개의 세포를 시드합니다. 37°C, 5% CO2에서 6일 동안 배양합니다.
  2. 중간 변화(6일차)
    1. 광구경 피펫을 사용하여 오가노이드(2.1.5단계에서)를 96웰 플레이트에서 10cm 접시로 옮깁니다. 50μL의 배지(1% N2, 1% 글루타민 치환물, 1% NEAA, 2.5μM IWP-2, 5μg/mL 헤파란 황산염 및 1% PS가 포함된 DMEM/F12)를 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
      참고: 오가노이드를 옮길 때 실험 전반에 걸쳐 3D 구조를 방해하지 않도록 광구경 피펫을 사용하십시오. 또한 8채널 피펫은 실험을 빠르고 정확하게 수행하는 데 도움이 됩니다.
    2. 오가노이드를 2mL 튜브에 수집합니다. 오가노이드가 흡인되지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하고 1.5mL의 DMEM/F12를 추가합니다. 3회 반복하여 오가노이드를 세척합니다.
    3. 배지를 제거하고 500μL의 신선한 배지를 오가노이드가 있는 튜브에 추가합니다. 모든 오가노이드를 10cm 접시에 옮긴 다음 각 오가노이드를 더 쉽게 집어 들 수 있도록 5mL의 배지를 추가합니다.
    4. 50μL로 조정된 마이크로피펫을 사용하여 단일 오가노이드를 집어 들고 96웰 플레이트의 웰 1개로 옮깁니다. 모든 오가노이드가 96웰 플레이트(최종 부피 100μL)로 옮겨질 때까지 반복합니다. 37°C, 5% CO2에서 3일 동안 배양합니다.
  3. 중간 변화(9일차)
    1. (선택 사항) 8채널 피펫을 사용할 때 오가노이드를 10cm 접시로 옮깁니다. 단일 채널 마이크로피펫을 사용하는 경우 2.3.1단계를 건너뛰고 2.3.2단계로 진행합니다.
    2. 오가노이드를 2mL 튜브에 수집합니다. 2.2.2단계와 같이 DMEM/F12로 3회 세척합니다.
    3. 1% N2, 비타민 A가 없는 2% B27, 100μM 2-메르캅토에탄올(ME), 2.5μg/mL 인슐린, 1% 글루타민 대체물, 0.5% NEAA 및 1% 기저막 추출물을 함유한 분화 배지(1:1 DMEM/F12 및 신경기저)에 재현탁합니다.
      참고: 일회용으로 기저막 추출물의 작은 분취량을 준비하고 필요할 때까지 -20°C에서 보관합니다. 추출물을 8°C를 초과하지 않고 4°C에서 해동한 다음 차가운 배지에 혼합하고 실온에서 약 30분 동안 배지를 데웁니다.
    4. 웰당 ~10개의 오가노이드를 6웰 플레이트로 옮깁니다. 1웰의 최종 배지 부피를 2mL로 조정합니다. 37°C, 5% CO2에서 6일 동안 정적으로 배양합니다.
  4. 중간 변화(15일차)
    1. 오가노이드를 15mL 튜브에 수집합니다. 모든 오가노이드가 안정될 때까지 튜브를 방해하지 않고 그대로 두십시오. 상청액을 제거하고 신선한 분화 배지를 추가합니다(2.3.3단계와 동일하지만 B27 + 비타민 A 포함).
      참고: 일반적으로 오가노이드는 원심분리 없이 튜브 바닥에 침전됩니다. 그러나 환자 iPSC에서 파생된 작은 오가노이드는 효율적으로 가라앉지 않을 수 있습니다. 이 경우 튜브를 실온에서 3 분 동안 120×g으로 원심분리하여 오가노이드를 수집합니다.
    2. 웰당 ~10개의 오가노이드를 6웰 플레이트로 옮깁니다. 37°C, 5% CO2에서 15일 동안 정적으로 배양합니다.
    3. 30일째까지 5-7일마다 배지를 교체하십시오.

3. 2D 배양을 위한 대뇌 오가노이드의 해리(30일)

  1. 폴리-L-오르니틴(PO)으로 플레이트 코팅
    1. 10mg의 PO를 66.7mL의 H2O에 녹여 PO 원액을 준비하고 일회용으로 작은 분취량을 만듭니다. 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
    2. PO 원액을 H2O로 1:5로 희석하고 희석된 용액으로 배양 플레이트를 코팅합니다. 37°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 라미닌 코팅
    1. PO를 제거하고 PBS로 웰을 3 x 5분 세척합니다.
    2. 라미닌(PBS에서 1:1,000)을 첨가하고 37°C에서 3시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 라미닌의 원액은 1mg/mL입니다. 작은 분취량을 준비하고 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
  3. 단일 뉴런으로의 해리
    1. 사용하기 전에 해리 용액을 4°C에서 1시간 동안 해동하십시오.
    2. 오가노이드를 15mL 튜브로 옮기고 모든 오가노이드가 침전될 때까지 튜브를 방해하지 않고 그대로 둡니다. 상청액을 제거하고 5mL의 PBS를 첨가하여 오가노이드를 헹굽니다.
    3. PBS를 제거한 후 효소 용액 1mL를 첨가하고 부드럽게 1-2회 피펫팅합니다. 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 여러 번 피펫을 사용합니다. 필요한 경우 추가로 2-3분 동안 배양합니다. 완전히 해리하기 위해 다시 피펫팅합니다.
    4. 200 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 분산액 1mL를 첨가한 다음 피펫팅합니다.
    5. 아래에 분리 용액을 층으로 올리고 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    6. 1mL의 뉴런 배지(1% B27, 0.25% 글루타민 대체물, 1% PS가 포함된 신경기저)를 추가하고 혼합합니다. 현탁액을 70μm 스트레이너를 통해 50mL 튜브에 통과시킵니다.
    7. 세포를 세십시오. PO/라미닌 코팅 플레이트에서 1 × 105 세포/cm2 에서 세포를 시드합니다. 60일째까지 4-7일마다 배지를 교체하십시오.

4. 세포 및 분자 분석을 위한 세포 및 오가노이드 수확

  1. 면역형광을 위한 오가노이드 고정(30일)
    1. 오가노이드(단계 2.4.3)를 마이크로튜브로 수확합니다.
    2. 오가노이드를 흡인하지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하고 PBS 1mL를 첨가하여 오가노이드를 헹굽니다.
    3. 오가노이드를 흡인하지 않도록 PBS를 조심스럽게 제거하고 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 실온에서 30분 동안 고정합니다.
    4. PBS로 3회 세척합니다.
    5. 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
  2. RT-qPCR을 위한 오가노이드 수집(30일)
    1. 오가노이드(단계 2.4.3)를 마이크로튜브로 옮깁니다. 4.1.2단계에 설명된 대로 PBS로 세척합니다.
    2. 용해 완충액을 첨가하고 액체 질소(LqN2)에 급속 동결합니다. 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
  3. 면역형광을 위한 세포 고정(60일)
    1. 배양 배지를 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 세척합니다.
    2. 실온에서 15분 동안 4% PFA에 고정합니다.
    3. PFA를 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 세척합니다. 이 단계를 3회 반복합니다.
    4. 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.

5. RT-qPCR

  1. 키트 제조업체의 지침에 따라 오가노이드에서 총 RNA를 추출합니다.
  2. 키트 제조업체의 지침에 따라 5.1단계에서 준비된 총 RNA 1μg에서 총 반응 부피 20μL로 cDNA를 합성합니다.
  3. 다음 프라이머를 사용하여 정량적 PCR을 수행합니다. FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. 각 반응에 대한 최종 농도를 다음과 같이 설정합니다: 1x 형광 마스터 믹스, 0.25 μM 순방향 프라이머, 0.25 μM 역방향 프라이머. 총 반응량은 15 μL이며, 5.2단계의 cDNA 0.2 μL를 포함한다. 다음 PCR 조건 사용: 95°C에서 1분 동안 초기 변성; 15초 동안 95°C, 30초 동안 60°C의 40사이클.
  4. FOXG1 발현을 내부 대조군으로 ACTB로 정규화합니다.

6. 면역형광염색

  1. 오가노이드(30일)를 10% 자당에서 4°C에서 1시간 동안 배양한 다음 30% 자당을 4°C에서 ≥3시간 동안 배양합니다.
  2. 포매 배지에 오가노이드를 마운트하고 cryostat를 사용하여 냉동절편(10μm)을 준비합니다. 사용할 때까지 슬라이드 유리에 섹션을 -20°C에서 보관하십시오.
  3. PBS 세척(2 x 5분)으로 포매 배지를 제거합니다.
  4. 0.3% PBST에서 10분 동안 투과화합니다. PBS로 세척하십시오.
  5. 1시간 동안 0.1% PBST에 10% 정상 염소 혈청을 차단합니다. 1차 항체인 항-FOXG1(1:200), 항-TUBB3(1:500-1:1,000)과 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다. PBS로 3회 세척합니다.
  6. 2차 항체(1:500) + Hoechst 33258(1:500)과 함께 1시간 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척합니다.
  7. 컨포칼 현미경으로 장착하고 관찰합니다.

7. 이형질 분석

  1. 세포 스크레이퍼를 사용하여 iPSC를 수확하고 마이크로튜브로 옮깁니다. 0.5mL의 PBS를 첨가하고 100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 7.2단계로 진행합니다.
  2. 키트 제조업체의 지침에 따라 전체 DNA를 추출합니다.
  3. 각 PCR 반응에 대한 최종 농도를 설정합니다: 1x 형광 마스터 믹스, 0.25 μM 순방향 프라이머, 0.25 μM 역방향 프라이머. 총 반응량은 15μL이며, 7.2단계의 총 DNA 50ng를 포함한다. 다음 PCR 조건 사용: 95°C에서 1분 동안 초기 변성; 15초 동안 95°C, 30초 동안 60°C의 40사이클. 프라이머 서열은 다음과 같습니다: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ 전달: GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA; FBXO15_ 역방향: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. 임계값 주기 값을 사용하여 미토콘드리아 DNA 복제 수(돌연변이 대 야생형)를 계산합니다.
  5. FBXO15 핵 유전자 복제 수로 정규화합니다.

8. 오가노이드의 크기 및 모양 평가

  1. TIFF 형식의 현미경을 사용하여 오가노이드의 이미지를 캡처합니다.
  2. 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 크기와 원형도를 측정합니다. 파일 | 파일을 열고 선택합니다. 자유형 선택을 선택하고 오가노이드를 추적합니다. 그런 다음 분석 | 측정. 결과의 면적 및 원형도 값은 8.3단계의 분석에 사용되었습니다.
  3. 통계 소프트웨어를 사용하여 대조군과 비교하여 유의미한 차이가 있는지 평가하기 위해 t-test를 수행하여 데이터를 분석합니다.

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결과

우리는 뇌 오가노이드를 생성하고 Nakamura et al.9을 기반으로 약간의 수정을 거친 비교적 간단한 프로토콜을 사용하여 2D 신경 배양을 수행했습니다(그림 1). 이전 프로토콜에서는 V자형 96웰 플레이트를 사용하였지만, 본 연구에서는 U자형 96웰 저부착 플레이트를 사용하여 세포가 각 웰의 중심에 자연적으로 응집할 수 있도록 했습니다. 건강한 대조군 iPSC 라인 414C2를 사용하여 30일째에 FOXG1 양성 뉴런을 포함하는 뇌 오가노이드(그림 2A,D,E)와 60일째에 2D 배양 신경망을 성공적으로 유도했습니다(그림 3A).

환자 유래 iPSC 계통은 MELAS

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토론

인간 배아 줄기 세포(ESC)/iPSC에서 유도된 오가노이드는 희귀 난치성 질환에 대한 유망한 질병 모델을 나타내는 반면, 뇌 오가노이드의 생성은 일반적으로 몇 달 동안 지속되는 연장된 배양 기간10 과 배양 배지를 지속적으로 교반하고 장기 3D 세포 배양을 위한 안정적인 조건을 유지하는 조작 용기와 같은 고가의 장비의 사용이 필요합니다. 본 연구에서는 표준 세포 배양 장비를 이용하여 단기간 내에 뇌 오가노이드를 확립하였다. m.3243A>G 미토콘드리아 DNA 변이를 보유한 MELAS 환자에서 유래한 iPSC를 사용하여 질병 세포 특이적 표현형을 성공적으로 확인했습니다.

우리는 Nakamura et al. 2019년에 약간의 수정을 거쳤습니다. 원래 연구에서는 V자형의 96웰 낮은 부착 플레이트를 사용하여 0일에 iPSC를 집계했습니다. 그러나 본 연구에서는 세포가 웰 중앙에...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

414C2 iPSC는 RIKEN BRC에서 얻었습니다. 자금 지원은 JSPS KAKENHI(24H00648 to M.F., 23K08971 to C.S.)와 AMED Translational Research Network Program(25yf0126001j002 to M.F.)에서 제공되었습니다. 이 작업은 독일 학술 교류 서비스(DAAD)의 F.B. 펠로우십의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10cm 세포 배양 접시코닝353003
6웰 플레이트 초저부착면(ultra low attachment surface)코닝3471
70 & mu; M 세포 체감기코닝352350
아큐타제나칼라이 테스크12679-54iPSC를 해리하는 데 사용되는 효소들
B27 보충제열섬유 과학17504001
비타민 A가 없는 B27 보충제열섬유 과학12587010
β-머캡토에탄올 (2-ME)시그마M3148기관 규정에 따라 버려.
세포 배양 6웰 다중 플레이트코닝353046
셀 세이버 팁BMBio ECOBMT-200W와이드 보어 피펫 팁
셀 스크레이퍼스미토모 베이켈리테코 주식회사MS-93100
공초점 현미경자이스LSM710
크라이오스탯라이카CM3050
컬처 마우스 라미닌 1R& D3400-010-02해리된 뉴런의 2D 배양용 플레이트 코팅에 사용됨
DMEM/F12후지필름 와코 퓨어 케미컬 주식회사042-30795
형광 마운팅 매체다코S302380-2장착 매체
FOXG1 항체ABCAMAB196868
글루타맥스열섬유 과학35050061
염소 항생쥐 IgG(H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor Plus 488열섬유 과학A32723
염소 항토끼 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor Plus 555열섬유 과학A32732
헤파란 황산염 (HS)시그마H7640
고용량 RNA에서 cDNA 키트열섬유 과학4387406RNA로부터 cDNA를 합성하는 데 사용됩니다
호에슈트 33258열섬유 과학H3569
이미지J버전 1.52a오르가노이드의 크기와 원형도를 측정하는 데 사용됩니다
iMatrix-511 실크타카라 바이오 주식회사892021iPSC 배양용 플레이트 코팅
인슐린후지필름 와코 퓨어 케미컬 주식회사그리고 nbsp; 090-06481
IWP2토크리스 생명과학3533
키엔스 BZ-X810키엔스BZ-X810그림 3A의 이미지를 캡처하는 데 사용됨
LSM710칼 자이스 AG공초점 현미경
LSM980칼 자이스 AG공초점 현미경
루나 유니버설 qPCR 마스터 믹스뉴잉글랜드 바이오랩스M3003
마트리젤코닝354277
N2 보충제열섬유 과학17502001
신경기저 매질열섬유 과학21103049
뉴런 해리 솔루션 후지필름 와코 퓨어 케미컬 주식회사291-78001
비필수 아미노산(NEAA)나칼라이 테스크06344-56
일반 염소 혈청잭슨 면역연구소  005000121
눈클론 스페라 96-웰, 눈클론 스페라 처리, U자형 바닥 마이크로플레이트열섬유 과학174929
파라포름알데히드 (PFA)나칼라이 테스크09154-85기관 규정에 따라 버려.
PBS나칼라이 테스크14249-24
PBS나칼라이 테스크27575-31
페니실린/스트렙토마이신 (추신)나칼라이 테스크26253-84
폴리-L-오르니틴 (PO)시그마P3655
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참고문헌

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