무균성 심막염 쥐 모델에서 심방 전기생리학적 및 칼슘 처리 이상의 광학 매핑

요약

이 프로토콜은 쥐 무균성 심막염 심장에서 전압과 칼슘 과도기를 이중 광학 매핑하여 수술 후 심방세동의 염증 유발 심방 재형성을 평가하는 방법을 설명합니다.

초록

수술 후 심방세동(POAF)은 심장 수술 후에 자주 발생하며, 심방 염증과 재형성과 관련이 있습니다. 무균성 심막염(SP) 모델은 쥐에서 이 상태를 재현하여 염증에 의한 심방 전기생리학을 연구하는 데 유용한 기반을 제공합니다. 이 프로토콜은 SP 유도 후 랑겐도르프 관류 쥐 심장을 준비하고, 동시에 이중 광학 매핑을 이용해 막 관통 전압과 칼슘 과도성을 기록하는 방법을 설명합니다. 심장은 전압 감응 염료 RH237과 칼슘 지표 Rhod-2 AM로 염색되며, 수축성은 블레비스타틴을 사용해 움직임 인공물을 최소화합니다. 고속 영상은 제어된 페이싱 프로토콜 중 심방 활동전위와 칼슘 역학의 시공간적 매핑을 가능하게 합니다. 정량적 매개변수로는 활동 전위 지속 시간, 전도 속도, 칼슘 과도 지속 시간, 피크 도달 시간, 그리고 알터네 크기가 포함됩니다. 이 방법은 염증 스트레스 하에서 심방전도 이질성, 전기-칼슘 결합, 부정맥 취약성을 정밀하게 평가할 수 있게 합니다. 이 시각화된 접근법은 POAF 기전을 연구하고 심방 재구성을 표적으로 하는 약리학적 또는 유전적 중재를 시험할 수 있는 재현 가능하고 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

수술 후 심방세동(POAF)은 심장흉부수술 후 흔히 발생하는 합병증으로, 일반적으로 수술 후 2-4일 이내에 일시적으로 심방세동(AF)이 최고조에 달하는 것이 특징입니다. POAF는 종종 자체 제한 방식이지만, 뇌졸중 위험 증가, 더 긴 입원 기간, 높은 의료비와 관련이 있습니다¹. 심방근의 염증성 스트레스는 그 병인에 주요 기여하는 요인으로 간주됩니다².

무균성 심낭염(SP) 모델은 POAF ^3,4 연구를 위한 잘 확립된 소동물 모델입니다. 이 모델에서 심외부 활석 적용은 수술 후 변화를 모방하는 국소적인 심막 염증을 유도합니다. 이 모델을 사용한 이전 연구들은 구조 재형성, 간극 접합부 발현 변화, 그리고 부정맥 발생 ^5,6,7 소인이 되는 칼슘 처리 이상을 보여주었습니다. 그러나 기존의 전기생리학적 기법은 시공간 정보가 제한적이어서 온전한 심방 표면 전반에 걸쳐 전도 이질성과 전기-칼슘 결합 역학을 포착하기 어렵습니다.

광학 매핑은 심방 표면을 가로지르는 막 관통 전압과 칼슘 과도현(CaT)을 동시에 고해상도로 영상화할 수 있게 하여, 심방 전도, 재분극, 칼슘 신호 전달을 정밀하게 시각화할 수 있습니다⁸. 이 프로토콜에서는 랑겐도르프 관류된 SP 쥐 심장에서 이중 광학 매핑을 기술합니다. 이 접근법은 제어된 페이싱 프로토콜 하에서 전도 속도, 활동 전위 지속 시간(APD), CaT 특성, 교류 측정을 정량화할 수 있게 합니다. 염증이 있는 심방 준비물에서 전기 및 칼슘 처리 평가를 통합함으로써, 이 방법은 POAF의 기전적 기초 연구와 표적 치료 개입 검증에 강력한 도구를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인 ID [2024]IACUC 번호 4241에 따라 승인되었으며, 기관 및 국가 지침에 따라 수행되었습니다. 연구 전반에 걸쳐 동물복지 지침을 엄격히 준수했으며, 명확한 인도적 평가 지표가 명확히 정의되었습니다: 지속적인 무기력, 갑작스러운 20% 이상 체중 감소, 호흡 곤란, 정상적으로 먹거나 마실 수 없거나 심각한 수술 후 합병증을 보이는 쥐는 즉시 이소플루란 과다복용(산소 흐름 1L/분)으로 안락사하여 고통을 최소화하였습니다.

1. 용액 및 시약 준비

1. 변형 타이로드 용액(mM) 단위: 128.2 NaCl, 4.7 KCl, 1.3 CaCl₂, 1.05 MgCl₂, 1.19 NaH₂PO₄, 20 NaHCO₃, 11.1 포도당. 95% O₂/5%_CO2로 버블링하고, pH를 7.38-7.42로 조절하며, 37± 1 °C로 데웁니다.
2. 블레비스타틴: DMSO(5 mg/mL)에 녹여 -20°C에서 광 차단 상태로 보관합니다. 최종 농도는 10 μM에서 사용.
3. RH237 (전압 감응 염료): DMSO(2 mg/mL)에 용해하여 −20 °C에서 광 차단 상태로 보관합니다. 최종 농도는 2 μM에서 사용.
4. Rhod-2 AM (칼슘 지표): DMSO에 용해(1 mg/mL); −20°C에서 빛 차단 상태로 보관하세요. 최종 농도는 0.89 μM에서 사용하세요.
5. 플루로닉 F-127 (계면활성제): DMSO(상용 시약) 내 20% 용액.
6. 펜토바르비탈 나트륨(1%): 마취용 10 mL 식염수에 0.1 g을 녹여 마취합니다(40 mg/kg, 초폐).
   참고: 염료와 DMSO 재고는 적절한 개인 보호 장비(PPE)로 다루세요; 블레비스타틴과 염료를 빛으로부터 보호하세요. 생물안전 및 화학 안전 규정을 준수하세요.

2. 장비

1. Langendorff 시스템은 온도 조절(37 ± 1 °C), 저수지, 기포 컬럼, 연동 펌프(분당 유량 10-12 mL)를 갖추고 있습니다.
2. 영상: 고속 CMOS 카메라(≥ 1kHz 프레임레이트; 아트리움용 ≥ 80 × 80 픽셀 시야각), LED 여기 소스(530 ± 25 nm), 이크로익 빔스플리터(~630 nm), 방출 필터(Rhod-2 ~590 nm; RH237>700 nm), 조리개 조절 렌즈, 진동 차단 기능이 있는 광학 테이블. 여기광원: 최대 전류 5A의 LED 레이저, 최대 출력이 2.2W의 녹색 조명.
3. 자극: 일정 전압 자극기, 양극성 박동 전극.
4. 생리학: 잠수 심전도 전극; 서미스터 프로브; 심실 광 오염을 줄이기 위해 검은색 배경 기질(고무); 정교한 외과 기구; 쥐용 인공호흡기. 상세 재고는 자재표에서 확인할 수 있습니다.

3. 쥐에서 멸균성 심낭염(SP) 유도

1. 수컷 스프래그-도울리 쥐(200-220g)를 1% 펜토바르비탈 나트륨(40 mg/kg, 단일 용량)으로 마취합니다. 마취 깊이(발달 반사 상실)를 확인하세요.
2. 직접 시각화 하에 폴리에틸렌 또는 금속 캐뉼라를 사용해 쥐를 삽관합니다. 관을 조심스럽게 기관 안으로 밀어 넣고, 척추 바로 위에 위치시키고, 돌출을 막기 위해 고정하세요. 2 mL/100g 조석 부피로 설정된 인공호흡기에 연결하고, 분당 55회 호흡, I:E = 1:1. 대칭적인 흉부 확장과 안정적인 호흡을 관찰하여 효과적인 환기를 확인하세요.
   참고: 기관지 삽관이나 우발적인 삽관을 방지하기 위해 깊거나 얕은 삽입을 피하세요.
3. 수술 필드 준비해. 흉골 근처 2번째 늑간극 공간인 작은 흉골 부흉부 절개술을 시행하세요. 심장을 부드럽게 드러내세요.
4. 흉선을 들어 양쪽 심방을 시각화하세요. 심방면을 가느다란 겸자로 조심스럽게 열어주세요.
5. 가늘게 주걱(활석가루 용량: 쥐 체중 100 mg/50 mg)을 사용해 좌우 심방면에 균등하게 살균 활석을 바르세요. 큰 혈관이나 심실에 쏟아지지 않도록 주의하세요. 심방 위의 흉선을 교체하여 탈크 이동을 제한하세요.
6. 가슴 근육을 늑간 수술 절개를 덮도록 재배치하세요. 0.5% 포비돈-요오딘으로 소독한 후 흉강을 봉합하기 위해 근육과 피부를 봉합하고, 수술 후 페니실린(160,000 U/100 g, 무이)을 투여합니다.
7. Sham: 심낭 절개술이나 활석 도포 없이 흉강 절개술.
   참고: 심방 상막에만 얇고 균일한 활석 코팅을 적용하세요; 과도한 활석 또는 심실 오염은 사망률을 높이고 심방 특이적 수치를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 이전 연구들은 쥐에서 무균 심막염 수술이 심각한 심방 심근염을 유발하며, 여기에는 심한 섬유화와 IL-6, IL-1β, TGF-β1 등 염증성 인자가 증가한다는 것이 확인^{되었습니다.}

4. 심장 격리 및 랑겐도르프 관류

1. 수술 후 3일째에는 코 콘 을 통해 이소플루란(2-3%)으로 마취하고, 관상동맥 순환을 방해하고 랑겐도르프 관류를 저해할 수 있는 혈관 내 혈전 형성을 방지하기 위해 전신 헤파린(250 U/Kg, ip)을 투여합니다. 이 시점은 이전 생 체 내 발견에 근거해 선정되었는데, 이는 심방세동 유도 가능성이 SP³ 후 3-4일 후에 최고조에 달한다는 점으로, 이는 급성 염증 유발 부정맥 유발 단계를 포착할 수 있게 하고, 이후 유착이 생겨 조료 로딩과 광학 기록에 방해가 되는 것을 방지할 수 있게 했습니다.
   참고: 시작하기 전에 신선하게 준비하세요; 기체와 온도를 균형 있게 조정하세요. 광학 장치를 정렬하고 필터/이색성을 확인하세요. 획득 소프트웨어(1-2 kHz, 노출 1 ms)를 설정하고 형광 카드로 보정을 수행합니다.
2. 흉강을 노출시키기 위해 신속 정중 흉강 절개술을 시행하세요. 심장을 대동맥궁 일부와 함께 한 덩어리 절 제하고, 즉시 차갑고 산소가 풍부한 타이로드 용액에 담가 대사를 멈추고 조직의 생존력을 유지하세요. 캐뼉을 위해 대동맥 길이를 0.5mm로 유지하면서 주변 결합 조직을 조심스럽게 해리하세요. 대동맥을 4-0 실크 봉합사로 랑겐도르프 캐뉼라에 고정하여 밀폐 상태를 유지하고 카테터 하단 가장자리가 심방 상단 가장자리와 일치하도록 합니다. 산소가 포함된 타이로드를 이용해 분당 10-12 mL의 일정 유량으로 역행 관류를 시작하며, 진류수 온도를 37 ± 1 °C로 유지합니다. 재현성을 위해 쥐 대동맥 캐뉼라 사양은 다음과 같습니다: 외경: 1.4 mm; 내경: 1.0 mm; 전체 길이: 3-4 cm; 삽입 깊이: 대동맥근 안쪽 약 0.5-1.0 cm; 팁 모양: 약간 가늘어지며; 재료: 스테인리스 스틸 또는 둔탁한 금속 튜브. 캐뉼라는 일반적으로 60-80 mmHg의 관류압을 견디고 휘지 않을 만큼 충분히 단단해야 하며, 끝부분은 관상동맥 개막기를 막지 않도록 해야 합니다.
3. 즉각적인 재관류 효과를 관찰하세요. 관상동맥 혈관에서 잔류혈이 신속하고 빠르게 세척되고, 균일한 분홍색 심근 색이 회복되며, 자발적인 리듬 수축이 재개됨을 나타냅니다. 추가 실험 전에 심근부종이 최소화되고 심박수(보통 300-400bpm)가 안정적이어야 합니다. 동시에 심장 심전도 기록하세요. 광학 매핑 프로토콜을 시작하기 전에 심장이 최소 20분간 지속적인 관류 상태에서 평형을 맞출 수 있도록 하세요.

5. 모션 억제 및 배기

1. 블레비스타틴을 퍼류액에 첨가합니다(최종 10 μM). 수축이 멈출 때까지 ~10분 정도 관류하세요.
2. 폐정맥을 통해 승모판막을 통해 좌심실에 저혈압 카테터를 삽입하여 심실을 감압하여 심방 형태와 신호 무결성을 유지하면서 구내 압력을 낮춥니다. 재현성을 위해 카테터 사양은 다음과 같습니다: 외경: 1.4 mm; 내경: 1.0 mm; 총 길이: 1.5 cm; 심장 삽입 깊이: 1.0 cm. 심방 기하학과 신호를 보존하기 위해 심방을 열지 마세요.

6. 염료 적재

1. 심장 관류: 심정지 후 상온에서 10-12 mL/분의 일정한 유량으로 심장을 관류합니다.
2. 칼슘 지표 염색: Rhod-2 AM(최종 농도 0.89 μM)과 20% 플루로닉 F-127 20 μL 100 mL 관류 용액을 추가합니다. 이 용액으로 약 30분간 심장을 관류하여 심방과 심실에 균일한 붉은 형광을 보일 때까지 투여합니다.
3. 전압 감응 염색: RH237(최종 농도 2 μM)을 100 mL의 관류 용액에 첨가합니다. 심방과 심실이 분홍색으로 보일 때까지 ~5분 동안 심장을 관류하세요.
4. 재가열 및 세척: 심장을 원래 관류 시스템으로 옮깁니다. 생리적으로 가능한 온도로 데워 5-10분 동안 염료를 사용해 흡수되지 않은 염료를 씻어내세요.
   참고: 약한 CaT 신호는 종종 Rhod-2 부하가 부족함을 반영합니다; 로딩을 10-15분 연장하고 플루로닉이 신선한지 확인하세요. 움직임이 계속되면 블레비스타틴 효능과 빛 차단 효과를 확인하세요.

7. 영상 기하학 및 신호 절연

1. 심장을 37°C 영상 용욕에 넣으세요. 왼쪽 심방(LA)을 카메라 쪽으로 향하세요. 1차와 2차 LED 광원을 LA 쪽으로 정렬하세요.
2. 심장을 지지해 드리프트를 방지하고; 심방을 부드럽게 벌리고 침 바늘로 고정하여 최적의 시각화를 하세요. 심실을 검은색 고무 시트로 덮어 심실 광공해를 최소화하세요.
3. 양극성 조율 전극을 오른쪽 심방(RA)에 위치시키세요. 심방 근처에 심전극을 설치해 큰 P파 포착을 하세요.

8. 획득 및 페이싱 프로토콜

1. 지도 작성 소프트웨어(OMapRecord4.0 소프트웨어)를 실행하세요. 프레임 속도를 1-2 kHz로 설정하세요; LED 부하를 3-4A로 조정; 시야각은 LA 전체를 아우르는 것입니다. 어느 채널에서도 채도를 피하도록 게인/노출을 조절하세요. 포화를 피하면서 신호 대 잡음비를 극대화하기 위해 카메라 게인과 노출을 최적화하세요. 영상 매개변수: 노출 1 ms; 최대 카메라 주파수 30 kHz; 샘플링 속도 12.5 kHz; 해상도 2048 × 2048 픽셀; ROI 프레임 속도는 최대 3.5 kHz; 공간 해상도 70 μm. 이 설정들은 고충실도 AP와 CaT 녹화를 보장합니다.
2. S1S1 조율(기준선): 7Hz RA 조율(맥박 폭 2-4 ms; 이완기 임계치 두 배). APD/CaT 지속 시간(CaD), 피크 시간, 전도 속도에 대한 5초 영화 ≥ 확보하세요.
3. S1S2 프로토콜(난화성/AF): 7 Hz로 30회의 S1 박동을 전달한 후 단일 S2 비트를 투여합니다; S1-S2 간격을 140ms(10/5/1ms)로 줄여 내치성으로 줄이세요. 기록적인 CaT 회복(A2/A1), 유효 불응기(ERP), 심방 유도율/지속 시간.
4. 점진적 페이싱(교대): RA 페이싱을 8Hz에서 18Hz로 1-2Hz 단위로 증가시킵니다. 각 속도마다 5≥ 기록하여 Ca-ALT, APD-ALT, DIS-ALT를 정량화하세요. 동시 듀얼 채널 영화와 동기화된 심전도/자극 추적 기록을 저장해 분석하세요.
   참고: 페이싱 내내 온도와 관류를 일정하게 유지하세요; 저체온증은 전도를 감소시키고 알터나스 인위를 과장시킵니다.

9. 데이터 처리 및 정량화

1. OMapScope 4.0 소프트웨어를 사용하여 광 신호를 분석하세요. 3×3 가우시안 공간 필터를 적용하여 각 픽셀을 이웃 픽셀과 평균화하여 신호 형태를 유지하면서 잡음을 줄였습니다. 활성화 시간은 업스트로크 중 최대 dF/dt가 발생하는 지점으로 정의되며, 이를 바탕으로 가장 이른 활성화 부위와 가장 늦은 활성화 부위 사이의 선형 거리를 해당 활성화 시간 차이로 나누어 전도 속도를 계산합니다. APD_70/90 은 활동전위의 최대 dF/dT에서 AP 진폭의 70% 또는 90% 재분극까지의 시간으로 정의되었습니다. CaD_70/90 은 칼슘 과도기(Ca²⁺)의 정점에서 70% 또는 90% 붕괴까지의 시간으로 정의되었습니다. 알터난은 다음과 같이 정량화되었습니다: Ca-ALT는 평균 CaT 진폭의 크기와 큰 비율을 1에서 뺀 값으로, APD-ALT는 긴 APD₈₀ 값과 짧은 APD 값의 차이로, DIS-ALT는 공간적으로 위상이 다른 알터넌을 노드선으로 구분하여 계산했습니다. RyR 회복 비율은 두 개의 연속된 CaT 피크(작음/크기 피크)의 비율로 계산되었습니다.

10. 임계 매개변수 및 수용 기준

1. 관류: 분당 10-12 mL, 37 ± 1 °C; 안정된 동동(안정된 동동) 또는 박동 리듬; LA는 잘 충실해졌어요.
2. SNR: 업스트로크 dF/F ≥ 두 채널 모두 3; 획득 기간 동안 광표백이 최소화되었습니다.
3. 운동: 블레비스타틴 투여 후 잔여 운동은 무시할 만하다; 프레임 전반에 걸쳐 안정적인 이미지 등록.
4. 온도: 지속적인 모니터링; 채집 시 욕조 온도가 36 °C 또는 > 38 °C< 있는 데이터셋은 제외합니다.

11. 통계 분석

1. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 9를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 제시됩니다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 평가하였습니다. 정규 분포 데이터의 경우, 두 그룹 간 차이는 쌍이 없는 양측 Student's t 검정을 사용해 분석하였으며; 비정규 분포 데이터의 경우에는 Mann-Whitney U 검정이 적용되었습니다. 범주별 변수들은 χ² 검정을 사용해 분석되었습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

AF 유도성
외소성 활동과 재진입은 POAF 시작과 지속에 중요한 메커니즘입니다.². 재진입 파장(λ)은 ERP와 전도 속도(CV)의 곱으로 결정되며, 즉 λ = ERP × CV입니다. 가짜 수술된 심장에서는 S1S2 박동이 부정맥 없이 안정적인 심방 반응을 유도했습니다(그림 2A). 반면, SP 치료를 받은 심장은 심방 제출(그림 2B)과 심방 방방으로 퇴행하는 재진입(그림 2C) 등 비정상적인 반응을 자주 보였습니다. 정량적 분석 결과, 점진적으로 짧아진 S2 간격이 SP 심장에서 심방 외출 또는 세동 발생률을 유의하게 높였음이 밝혀졌습니다(그림 2D). 심방 유효 불응기(ERP)는 두 그룹 간에 변함이 없었다(

토론

이 프로토콜은 SP(염증 유발 POAF 모델)를 따라 분리된 쥐 심장에서 AP와 CaT의 이중 광학 매핑을 설명합니다. 프로그래밍 가능한 페이싱 하에 온전한 심방면을 가로질러 Vm 및 Ca²⁺ 신호를 동시에 고해상도로 기록하면 APD, 피크 도달 시간, 전도 속도, 재분극의 공간적 이질성, CaD, CaT 진폭, CaT 피크 도달 시간, 지역별 Ca 처리 변동성을 평가할 수 있습니다. 또한 주파수 의존성 알터넌(APD-ALT, Ca-ALT, DIS-ALT)의 검출 및 정량화, RyR 회복 및 내응성 분석도 가능하게 합니다. 더 나아가, 이 접근법은 부정맥성 유발 요인(자궁외 활동 및 재진입)을 포함하며, SP 모델에 의해 유도된 기능적 로터 기반 재진입과 이들이 뚜렷한 교류 영역과 함께 위치하는 것을 규명하여 염증에 의한 심방 전기 재형성과 부정맥 생성에 대한 기전적 통찰을 제공합니다. 특히, 심막에서의 활석 노출은 염증에 의한 전기 재형성을 나타내...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
블레비스타틴	앱캠	ab120425
CaCl2	시그마-올드리치	10043-52-4
CMOS 카메라	매핑랩	OMS-PCIE-2002
심전도 시스템	청두 기술자	BL-420F
FE32 -미터	메틀러 톨레도	30254108
필터/이색성 거울	매핑랩	RH237 >700 nm; CaT 590 nm
포도당	시그마-올드리치	921-60-8
임가이 목욕	매핑랩	해당 없음
KCl	시그마-올드리치	7447-40-7
랑겐도르프 관류 시스템	Radnoti / Custom	해당 없음
LED 전원 (530 이상; 25nm)	매핑랩	해당 없음
MgCl2	시그마-올드리치	7786-30-3
나클	시그마-올드리치	7647-14-5
아니2PO4	시그마-올드리치	10049-21-5
NaHCO3	시그마-올드리치	144-55-8
OMapRecord4.0 소프트웨어	매핑랩	해당 없음
OMapScope4.0 소프트웨어	매핑랩	해당 없음
페리스탈틱 펌프	콜-파머	Masterflex® L/S®
플루로닉 F-127	인비트로젠	P3000MP
RH237 (전압 염료)	써모피셔 / 인비트로젠	S1109
로드-2 AM (Ca 지시기)	써모피셔 / 인비트로젠	R1245MP
소동물 인공호흡기	유얀비오	V-100
펜토바르비탈 나트륨	시그마-올드리치	P3761
스프래그-도울리 쥐 (200– 220g, 남성)	현지 인증 공급업체	해당 없음
멸균 탈크 가루	시그마-올드리치	T1586
자극기	매핑랩	LEDC-2002
수욕 (온도 조절)	닝보신즈	SC-15