다종 항체에 적합한 경제적이고 보편적인 보상 구슬 제조

요약

이 프로토콜은 재조합 단백질 A/G/L 결합 폴리스티렌 미세구체를 사용하여 유세포분석에서 형광 보상을 위한 다종 호환 보상 구슬을 비용 효율적으로 준비하는 방법을 설명합니다.

초록

이 프로토콜은 다색 유세포측측에서 형광 보상을 위한 다종 호환 보상 구슬을 비용 효율적이고 재현 가능하게 준비하는 방법을 설명합니다. 여기서는 여러 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 결합 단백질 A/G/L(Protein A/G/L)을 재조합하여 대장균(대장균)에서 발현하고, 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제한 후 EDC/NHS 화학을 통해 카복실화 폴리스티렌 미세구체에 공유 결합하였습니다. 생성된 구슬은 다양한 종과 아계열의 항체를 결합하여 보상 설정에 적합한 강하고 뚜렷한 형광 신호를 생성합니다. 이 결과들은 다양한 보상 요구사항에 적합한 형광 강도를 달성하기 위해 구슬 직경과 단백질 부하를 선택하는 데 실질적인 지침을 제공합니다. 프로토콜의 성공은 효율적인 단백질 정제와 유세포분석 중 대조군 구슬과 비교해 명확하고 고강도의 형광 피크를 통해 나타난다. 이 간단하고 확장 가능한 접근법은 표준 실험실에서 안정적이고 다용도인 보상 비즈를 일상적으로 준비할 수 있게 하여 비용을 절감하고 유세포분석 응용의 유연성을 향상시킵니다.

서론

유세포분석은 면역학, 세포생물학 및 임상 연구에서 세포 집단의 다중 매개변수 분석을 위한 필수 도구가^{되었습니다.} 전통적인 다색 유동 세포분석에서 중요한 과제는 형광 스플로로우로, 형광색소의 방출 스펙트럼이 여러 검출기 채널로 겹쳐져 신호 오염과 오해 해석을 초래하는 ^4,5. 따라서 정확한 데이터 해석을 위해서는 적절한 보상이 필수적입니다.

전통적으로 보상 조절은 단색 염색 셀을 사용하여 준비됩니다. 그러나 제한된 세포 수, 변동성 있는 항원 발현, 그리고 항체의 세포 간 차별 결합 등^{은 도전 과제}를 제공합니다. 그 결과, 형광색소 결합 항체에 결합하도록 변형된 합성 구슬이 실용적인 대안으로 등장했습니다 ^7,8. 구슬은 일관된 결합 능력, 높은 형광 강도, 세포 항원 발현 수준으로부터 독립적인 장점을 제공합니다⁹. 단일 종 또는 Fc 제한 포획 시약과 비교할 때, 여러 면역글로불린 결합 도메인(단백질 A, G, L)의 도입은 종 커버리지와 항체 형식 호환성을 확장하여 단일 비즈 제제로 다양한 플루오로크롬 결합 항체를 수용할 수 있게 합니다.

보상에 사용되는 구슬 중에서는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L과 같은 면역글로불린 결합 단백질의 결합이 서로 다른 종의 항체 아이소타입과 광범위한 호환성을 제공합니다. 단백질 A와 G는 많은 IgG 하위 클래스의 Fc 영역에 결합하는 반면, L은 면역글로불린의 κ 가쇄에 결합하여 Fab 단편과 단일 사슬 항체에 대한 결합 능력을 확장합니다^10,11.

상업용 보상 비즈가 존재하긴 하지만, 예산이 제한된 실험실에서는 비교적 높은 비용 때문에 광범위한 적용이 제한적일 수 있습니다^. 이러한 도전 과제를 고려할 때, 연구자들이 비즈 크기, 항체 결합 도메인, 보상 조절에 사용되는 항체 유형을 정의할 수 있는 유연하고 맞춤화 가능한 비즈 플랫폼이 필요합니다. 이 프로토콜의 목표는 다색 유세포측을 위한 다종 호환 보상 비즈를 준비하는 간단하고 경제적이며 재현 가능한 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 단백질 A, G, L의 여러 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질의 설계, 발현 및 정제를 설명하며, 이후 정의된 직경의 카복실 변형 폴리스티렌 구슬과의 공유 결합을 진행합니다.

프로토콜은 융합 단백질의 분자 설계, 대장균 에서의 발현 및 정제, 그리고 여러 형광색소 결합 항체와 호환되는 구슬 기반 보상 시약의 제조법을 설명합니다. 이 프로토콜은 면역학, 종양학, 번역 연구 등 다양한 연구 환경에서 다색 유세포분석을 수행하는 실험실을 대상으로 하며, 특히 비용 절감, 종 간 호환성, 유연한 보상 통제가 필요한 경우에 적합합니다.

프로토콜

참고: 표 1에 나열된 대로 모든 버퍼와 시약을 새로 준비 하세요. 사용 전에 즉시 EDC 및 NHS 용액을 준비하세요; 보관하지 마세요. 다른 모든 완충제(용해, 결합, 세척, 용출, MES, PBS, 트리스)는 사전에 스톡 용액을 준비하여 4 °C에서 보관하세요. 사용 전에 저장된 완충류를 적절한 반응 온도(실온 또는 4 °C)로 평형으로 만듭니다. FACS 버퍼와 저장 버퍼는 신선하게 준비하거나 4 °C에서 보관되도록 하세요.

1. 재조합 단백질 A/G/L의 발현 및 정제

1. 재조합 단백질 A/G/L의 발현
   1. 표준 열충격 프로토콜을 사용하여 pET28-단백질 A/G/L 플라스미드를 대 장균 BL21(DE3) 적합 세포로 전환합니다.
   2. 변형된 세포를 50 μg·^mL-1 카나마이신이 포함된 LB 한천에 판질하고 37 °C에서 하룻밤 배양합니다.
   3. 단일 집락을 카나마이신이 포함된 LB 육수(50 μg·^mL-1)에 5–10mL에 접종하고, 37°C에서 200 × g에서 진동시키며 하룻밤 배양합니다.
   4. 하룻밤 배양물을 카나마이신이 함유된 LB 200mL(최종 농도 50 μg·^mL-1)에 1:100 희석 비율로 옮깁니다.
   5. 배양물을 37°C에서 600 nM(OD600)에서 광학 밀도가 0.6–0.8에 도달할 때까지 배양합니다.
   6. 최종 농도는 0.5 mM에 이소프로필 β-D-1-티오락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 28 °C에서 12–16시간 배양합니다.
   7. 세포를 4°C, 4000 g, 4000 g × 원심분리하여 10분간 수확합니다.
   8. 상정액은 버리고 세포 펠릿을 용해 버리기에 재현탁합니다. 즉시 진행하거나 펠릿을 -80 °C에 보관하세요.
      정지 시점: 세포 펠릿은 용해 전 몇 주간 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
2. 세포 용해
   1. 박테리아 펠릿을 습식 세포 덩어리당 10mL의 용해 버퍼에 재현탁합니다.
   2. 1000바로 설정된 고압 균질제를 사용해 세포를 용해시키고, 용액이 점도가 낮고 투명해질 때까지 2–3사이클을 통과시킵니다.
      참고: 또는 펄스 모드(5초 ON / 10초 OFF)를 사용하여 얼음 위에서 초음파 처리를 8–12 사이클 동안 수행할 수 있으며, 과열을 방지할 수 있습니다. 현미경으로 작은 부위를 검사하여 완전한 용해를 보장합니다.
   3. 용해액을 12000 g × 4°C에서 30분간 원심분리합니다.
   4. 상청액을 용해성 단백질 분획으로 수집하여 정제하세요.
3. Ni-NTA 친화 정화
   1. 컬럼 평형화 및 시료 하중
      1. Ni-NTA 컬럼을 10 mM 이미다졸이 포함된 결합 완충제(CV) 10 컬럼으로 평형을 맞춥니다.
      2. 정화된 용해액을 0.45 μM 필터로 여과하고, 최종 농도는 10 mM에 이미다졸을 첨가한 뒤, 0.5 CV·^min-1로 컬럼에 적재합니다.
      3. 유출 분량을 수집하여 결합 효율을 모니터링합니다.
   2. 세척
      1. 컬럼을 10 CV의 결합 버퍼와 20 mM 이미다졸이 포함된 세척 버퍼로 1 CV·분^-1 유량으로 세척합니다.
   3. 유출
      1. 표적 단백질을 용출 버퍼로 1 CV·^min-1 유량으로 용출합니다.
      2. 단백질 분획을 채취하고 A280을 모니터링하여 단백질 함유 분획을 식별하세요.
   4. 완충류 교환 및 단백질 저장
      1. 정제된 단백질 용액을 50 kDa 분자량 차단(MWCO) 원심 초여과관으로 옮깁니다.
      2. 3,500 × g 원심분리기를 4 °C에서 15–20분간 원심분리하여 원하는 농도에 도달할 때까지 조절합니다.
      3. 플로우 스루를 버리고 버퍼 교환을 위해 pH 7.4의 PBS 버퍼를 같은 양의 잔류액에 추가합니다.
      4. 원심분리와 PBS 교체를 2–3번 반복하여 원래 버퍼를 완전히 PBS로 교체합니다.
      5. 최종 농축 단계 후에는 잔류물을 채취하고 단백질 농도를 측정합니다.
      6. SDS-PAGE로 용출된 분획을 검증합니다; 단백질 A/G/L의 예상 분자량은 약 90 kDa입니다.
      7. 정제된 단백질을 알리코트하여 -80°C에서 보관하다가 추가 사용하세요.
         참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시정지할 수 있습니다. 정제된 단백질 A/G/L은 이후 구슬 결합을 위해 -80 °C에 보관할 수 있습니다. 농축 후, 200mL의 박테리아 배양에서 약 10mg의 정제된 단백질 A/G/L을 얻었으며, 최종 농도는 2–5 mg·mL⁻^¹이었습니다.

2. 구슬을 단백질 A/G/L에 접합 처리한다

1. 비드 프리워시
   1. 소용돌이 비드 스톡은 실온(20–25 °C)에서 최대 속도로 20–30초 동안 고르게 재현탁됩니다. 0.2 mL 8 μM 비드(5 mg)를 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
   2. 펠릿은 원심분리로 5000 g, 실온에서 3분간 5000 g × 비드를 만듭니다.
   3. 상청액을 조심스럽게 흡입하고 제거하면서 펠릿을 흔들지 마세요.
   4. 0.1 M MES 완충액 1mL를 추가하고, 피펫팅 또는 부드러운 소용돌이로 부드럽게 재현탁한 후, 실온에서 5000 × g을 원심분리하여 3분간 사용한 후 상원액을 제거합니다. 이 세척을 한 번 반복하세요(총 두 번의 MES 세척).
2. EDC/NHS와의 활성화
   주의: EDC와 NHS는 자극 물질이므로 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기구 처리해야 합니다.
   1. 0.5 mL MES 버퍼에 비즈를 재현탁한 후, 50 μL 50 mg·^mL-1 NHS, 100 μL 50 mg·^mL-1 EDC 100 μL을 순차적으로 첨가합니다.
      참고: EDC 및 NHS 용액은 사용 직전에 신선하게 준비해야 합니다.
   2. 보텍스 비즈를 만들어 상온에서 회전식 셰이커에서 30분간 부양하여 활성화시킵니다.
3. 활성화 시약을 제거하고 세척하세요
   1. 펠릿 비즈: 5000 × g, 3분, 실온에서. 조심스럽게 상원액을 제거하세요.
   2. 1mL PBS 버퍼를 추가하고, 부드럽게 재현탁한 뒤 원심분리기(상온에서 5000 × g, 3분)로 상원액을 제거하세요. 활성화 시약을 제거하기 위해 PBS 세척 한 번 수행하세요.
4. 단백질 결합
   1. 활성화된 비드 펠릿을 0.4–0.5 mL PBS(최종 반응 부피 목표 0.5–0.6 mL)에 재현탁합니다. 효과적인 단백질 농도를 높이기 위해 양을 낮게 유지하세요.
   2. 단백질 A/G/L 100μg을 넣고 부드럽게 섞으세요.
   3. 반응을 실온에서 롤링 셰이커에서 2시간 동안 배양하여 빠른 결합을 시키고, 4°C에서 하룻밤을 유지하세요. 비드가 가라앉지 않도록 부드럽게 굴리세요.
5. 소환/종료 반응
   1. 펠릿 비즈(5000 × g, 3분)를 사용해 상명액을 제거하세요.
   2. 남은 NHS 에스터를 소결하기 위해 1 mL 0.1 M Tris(pH = 7.4)를 첨가합니다. 재현탁 후 실온에서 30분간 롤링 셰이커에서 배양합니다.
   3. 펠릿 비즈를 만들어 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 1mL PBS로 세척합니다. 다시 원심분리기(5000 × g, 3분)를 넣고 상원액을 버립니다. 그 후 0.5mL 저장 버퍼로 구슬을 재현탁합니다.
      일시정지 지점: 이 단계에서 프로토콜을 일시정지할 수 있습니다. 재현수 비즈는 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
6. 믹스 및 저장
   1. 공액 구슬과 비공액 구슬을 세는 것. 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 공액 비즈와 비공액 비즈를 25%–75% 비율로 혼합합니다.
   2. 구슬 혼합물을 1mL의 저장 완충제(PBS 1% BSA와 0.05% 항균 방부제 함유)에 현탁합니다.
   3. 현탁을 라벨이 붙은 튜브로 옮겨 4°C에서 보관하세요. 광 차단은 필수 사항이 아닙니다. 사용 전에 부드럽게 재현탁하여 비즈 분포가 균일하도록 하세요. 이러한 조건에서는 구슬이 최소 6개월 이상 안정적으로 유지됩니다.

3. 대표 QC

1. 10 μL 형광 항체와 함께 100 μL FACS 완충액에서 10 μL 접합 구슬을 15–30분간 실온에서 배양합니다.
   참고: 각 튜브에는 형광 항체 하나만 포함되어야 합니다.
2. 1 mL PBS로 비즈를 세척한 후 300–500 μL PBS에 재현탁한 후 유세포계에서 작동시킵니다.
3. 항체에 결합된 형광체에 따라 검출 채널을 설정하세요(예: FITC 결합 항체에 대해 488 nM 레이저와 FITC 검출기를 사용). 0–200 V의 대표적인 광증배관(PMT) 전압 범위를 시작점으로 사용하며 기기 성능에 따라 조절할 수 있습니다. 샘플당 최소 10,000건의 사건을 수집하세요.
4. FSC/SSC의 구슬에 게이트가 있습니다. 양성 비드는 형광 채널에서 높은 MFI를 가진 명확한 단일 봉크를 보여야 하며; 네거티브 컨트롤은 배경만 보여야 합니다.

결과

재조합 융합체인 단백질 A/G/L은 816개의 아미노산으로 구성되며, 계산된 분자량은 90.5 kDa입니다(보충 파일 1). 이 융합 단백질은 단백질 A의 IgG 결합 B 도메인 5개, G의 IgG 결합 도메인 2개, 단백질 L의 가쇄 결합 B 도메인 5개를 유지한 반면, 알부민 결합 도메인은 제거되었습니다(그림 1A, 보충 표 1). C-말단에 시스테인 잔기가 추가되어 공유 결합을 촉진하고, 6× His 태그가 도입되어 Ni–NTA 친화성 크로마토그래피를 이용한 효율적인 정제가 가능해졌습니다(그림 1A).

SDS–PAGE 분석 결과, 약 90 kDa에서 단백질 A/G/L의 예상 크기에 해당하는 두드러진 밴드가 나타나 발현된 단백질의 대부분이 용해됨을 나...

토론

이 프로토콜은 재조합 단백질 A/G/L을 기반으로 형광 보상 구슬을 준비하는 실용적이고 효율적인 워크플로우를 설명합니다. 이 절차에는 박테리아 발현, Ni-NTA 친화성 정제, 그리고 EDC/NHS 화학을 이용한 정제 단백질의 카복실 변형 폴리스티렌 미구체에 대한 공유 결합이 포함됩니다. 결과된 구슬은 여러 종과 하위 계열의 항체를 결합할 수 있어, 유세포측측에서 형광 보상을 위한 다목적이고 비용 효율적인 도구를 제공합니다.

상업적으로 이용 가능한 카복실 변형 미세구체를 사용하면 이 절차가 크게 간소화됩니다. 일반적인 생물학 실험실에서는 균일하고 단분산인 카복실화 미세구체를 합성하는 것이 기술적으로 까다롭고, 입자 크기와 표면 전하의 변동성을 자주 초래합니다. 반면, 상업적으로 구할 수 있는 마이크로스피어는 저렴하고 고품질이며 재현 가능합니다. 예를 들어, 250mg 카복실 변형 마이크로스피어는 약 $21에 구매할 수 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AF647 랫 Ig2a	바이오레전드	141711
APC 마우스 IgG1	바이오레전드	353311
BL21(DE3) 유능한 세포들	상곤	B528414
BSA	솔라비오	A8010
일상 운송	써모피셔	22980	CAS: 1892-57-5
FITC 아르메니아 햄스터 IgG	바이오레전드	400905
이미다졸	시그마-올드리치	I202	CAS: 288-32-4
IPTG	골드바이오	I2481C	CAS: 367-93-1
카나미신	상곤	A600286	CAS: 8063-07-8
KCl	알라딘	P112134	CAS: 7447-40-7
KH2PO4	알라딘	P434010	CAS: 7778-77-0
MES	시그마-올드리치	M3671	CAS: 145224-94-8
Na2HPO4	알라딘	S274390	CAS: 7558-79-4 & nbsp;
나클	알라딘	C111549	CAS: 7647-14-5
NHS	써모피셔	24500	CAS: 6066-82-6
Ni NTA 비즈 6FF	스마트-라이프사이언스	SA005005
PE 마우스 IgG2a	바이오레전드	362603
프로클린 300	비요타임	ST853
트리스	시그마-올드리치	252859	CAS: 77-86-1
트립톤	옥소이드	LP0042
울트라 원심 필터, 50 kDa MWCO	밀리포어	UFC9050
균일 카복실 폴리스티렌 미세구	토마이크로 바이오텍	10ml, 25mg/ml	중국 상하이
효모 추출물	옥소이드	LP0021