이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Methylated DNA의 Immunoprecipitation
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
DNA의 methylation 패턴의 식별은 methylation은 유전자 발현에 큰 영향을 미칠 것으로 알려져으로 epigenetics의 연구에서 일반적인 절차이며, 정상적인 발달뿐만 아니라 질병에 관여
프로토콜
DNA 추출 및 샘플 준비
다른 샘플의 다양한 (교양 세포, 신선한뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 얼어붙은)에서 DNA가 MeDIP 사용할 수 있습니다. 같은 histones으로 관련된 단백질없이 높은 정화 DNA를 사용하는 것이 중요합니다. 그것의 DNA quantitation 및 항체 바인딩 모두를 방해할 수 있으므로, 샘플에서 가능한 한 많은 RNA를 제거하는 것도 중요합니다. MeDIP에 사용되는 DNA의 양은 200 NG에서 사용할 DNA의 양에 따라 1 μg 범위 수 있습니다. 이 프로토콜을 입증하기 위해, DNA 1 μg가 사용됩니다. 다음 프로토콜은 교양 세포에서 고품질의 이중 좌초 DNA를 제공합니다. 다른 프로토콜은 다른 샘플 형식에서 DNA의 추출을위한 고용해야합니다.
- 1.7 ML Eppendorf 튜브에 세포 펠렛을 소화 버퍼 400 μl를 추가합니다.
- 튜브에 proteinase K 100 μg을 추가하고 50 밤새 품어 ° C.
- 500 μl 페놀 산도 7 추가하고 반전에 의해 부드럽게하지만 철저히 섞는다.
- 실온에서 10 분 13 000g에 스핀.
- 새로운 튜브로 수성 (위) 분수를 제거합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
질병에있는 중요한 역할의 DNA methylation의 재생의 성장 의식이있다,이 수정을 측정 assays의 따라서 개발은 13 초, 12 초, 3 점차 중요 해지고 있습니다. MeDIP 기술은 전체 게놈과 로커스 - 특정 레벨 6, 7 모두에서 검사를받을 수있는 도구입니다. 이 기술은 DNA를 시작하는 제한된 양의를 사용하여 DNA의 methylation 수준의 빠른 볼을 제공하며 서로 다른 소스 사이에서 쉽게 비교를 위해 수 있습니다. MeDIP 제품을 사용하는 다운 스트림 응용 프로그램은 전체 게놈 및 CPG 섬 oligonucleotide 배열, 관심 loci에 대한 직접적인 PCR의 assays뿐만 아니라, 시퀀싱 등 microarrays 다양한 있습니다.
MeDIP는 methylated DNA와 6 unmethylated 구분하는 항체에 의존 DNA의 methylation 검출에 대한 독특한 접근 방식을 제.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
감사의 글
우리는이 비디오 및 문서를 비평에 참여를 위해 갈색과 램 실험실의 구성원을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구와 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter 초음파 파쇄기 | 도구 | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal 마이크로원심분리 튜브 | 기타 | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 분광광도계 | 도구 | NanoDrop | ||
| 1차 항체: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb | 시약 | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| 2차 항체: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | 시약 | Invitrogen | 112-01D | |
| 자성 튜브 랙 | 도구 | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | 도구 | Labnet International | H5500 | |
| IP 버퍼 | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. 실온 보관 | |||
| 분해 버퍼 | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
참고문헌
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilbe....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
