방법 논문

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

DOI:

10.3791/935

⸱

2009년 1월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Genetics and Developmental Biology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC, 4Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 5Department of Medical Genetics, Life Sciences Institute,, University of British Columbia - UBC

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.

초록

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DNA의 methylation 패턴의 식별은 methylation은 유전자 발현에 큰 영향을 미칠 것으로 알려져으로 epigenetics의 연구에서 일반적인 절차이며, 정상적인 발달뿐만 아니라 질병에 관여

프로토콜

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DNA 추출 및 샘플 준비

다른 샘플의 다양한 (교양 세포, 신선한뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 얼어붙은)에서 DNA가 MeDIP 사용할 수 있습니다. 같은 histones으로 관련된 단백질없이 높은 정화 DNA를 사용하는 것이 중요합니다. 그것의 DNA quantitation 및 항체 바인딩 모두를 방해할 수 있으므로, 샘플에서 가능한 한 많은 RNA를 제거하는 것도 중요합니다. MeDIP에 사용되는 DNA의 양은 200 NG에서 사용할 DNA의 양에 따라 1 μg 범위 수 있습니다. 이 프로토콜을 입증하기 위해, DNA 1 μg가 사용됩니다. 다음 프로토콜은 교양 세포에서 고품질의 이중 좌초 DNA를 제공합니다. 다른 프로토콜은 다른 샘플 형식에서 DNA의 추출을위한 고용해야합니다.

  1. 1.7 ML Eppendorf 튜브에 세포 펠렛을 소화 버퍼 400 μl를 추가합니다.
  2. 튜브에 proteinase K 100 μg을 추가하고 50 밤새 품어 ° C.
  3. 500 μl 페놀 산도 7 추가하고 반전에 의해 부드럽게하지만 철저히 섞는다.
  4. 실온에서 10 분 13 000g에 스핀.
  5. 새로운 튜브로 수성 (위) 분수를 제거합니다.

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토론

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질병에있는 중요한 역할의 DNA methylation의 재생의 성장 의식이있다,이 수정을 측정 assays의 따라서 개발은 13 초, 12 초, 3 점차 중요 해지고 있습니다. MeDIP 기술은 전체 게놈과 로커스 - 특정 레벨 6, 7 모두에서 검사를받을 수있는 도구입니다. 이 기술은 DNA를 시작하는 제한된 양의를 사용하여 DNA의 methylation 수준의 빠른 볼을 제공하며 서로 다른 소스 사이에서 쉽게 비교를 위해 수 있습니다. MeDIP 제품을 사용하는 다운 스트림 응용 프로그램은 전체 게놈 및 CPG 섬 oligonucleotide 배열, 관심 loci에 대한 직접적인 PCR의 assays뿐만 아니라, 시퀀싱 등 microarrays 다양한 있습니다.

MeDIP는 methylated DNA와 6 unmethylated 구분하는 항체에 의존 DNA의 methylation 검출에 대한 독특한 접근 방식을 제.......

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감사의 글

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우리는이 비디오 및 문서를 비평에 참여를 위해 갈색과 램 실험실의 구성원을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구와 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Biorupter 초음파 처리기도구DiagenodeUCD-200 TM
1.7ml SafeSeal 마이크로 원심분리기 튜브기타Sorenson BioScience11510
ND 3300 분광 광도계도구NanoDrop
1차 항체: Anti-5'-methylcytosine mouse mAb시약Calbiochem162 33 D3
2차 항체: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG시약Invitrogen112-01D
Magnetic Tube RackToolInvitrogenCS15000
Mini LabRollerToolLabnet InternationalH5500
IP Buffer10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. 실온에서 보관
소화 버퍼10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5 % SDS, 50 mM NaCl

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
  2. Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
  3. Zilbe....

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재인쇄 및 허가

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DNADNAProteinase KAnti 5 mCPCR

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