CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

Summary

단순하고 구체적인 방법은 분획화 단계없이 형광 라벨 부착 및 세포 표면 단백질의 향상된 감지를위한 시연했다. 세포 표면 단백질의 차동 풍부한는 (2 - D) 2 차원 전기 영동과 Ettan ™ DIGE 기술을 사용하여 분석했다.

Abstract

표면 단백질은 환경에 반응하고 이웃 세포와 상호 작용하는 세포의 능력의 핵심입니다. 그들은 거의 모든 세포 신호의 inducers 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들은 환경 적응 및 약물 치료에 중요한 역할을하고, 종종 질병 pathogenesis 및 병리 (1)에 참여하고 있습니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 신호 경로에 내장하고 있으며, 이러한 복잡한 생물 학적 과정에 더 많은 통찰력을 얻을 수, 민감하고 안정적​​인 방법은 세포 표면 단백질을 연구 필요합니다. 2 차원 (2 - D) 전기가 차등 변경 사항을 공부 복잡한 단백질 샘플에 생체와 다른 대상의 검출을 위해 광범위하게 사용됩니다. 그들의 낮은 풍부 (세포 단백질의 12 %)로 인해 일부 세포 표면 단백질은 분류 또는 일부 다른 유형의 이득이없는 2 - D 겔에서 감지하기가 어렵습니다. 그들은 또한 종종 제대로 자신의 소수성 자연과 높은 분자량 (2)에 의한 2 - D의 젤으로 표시됩니다. 본 연구에서는, 우리는 단백질이 중요한 그룹의 특정 라벨 및 감지를위한 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료를 사용하여 그대로 전지에 대한 새로운 프로토콜을 제시한다. 결과는 세포 내 단백질의 최소한의 라벨과 함께 세포 표면 단백질의 다수의 특정 라벨을 보여주었다. 이 프로토콜은 사용하는 빠른 속도, 간단하고, 세 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료는 (싸이 2, 싸이 3 싸이 5) 세포 - 표면 단백질에 라벨을 사용할 수 있습니다. 이러한 기능은 DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어를 사용하여 단백질 발현 변화 Ettan DIGE 기술과 분석 2 - D 형광 차이점 젤 전기 영동 (2 - D DIGE)를 사용하여 멀티플렉싱을위한 수 있습니다. 세포 - 표면 단백질의 수준은 시간을 다양한 길이에 대한 CHO 세포를 (표 1 참조)의 혈청 기아 동안 미행했다. 풍부의 작은 변화는 높은 정밀도로 감지했고, 결과는 정의 통계적 방법으로 지원됩니다.

Protocol

세포 배양

1. GlutaMAX 나는 10 % 태아 송아지 혈청, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신 황산 (Invitrogen)를 포함과 함께 F - 12 햄 매체의 표준 세포 배양 절차를 사용하여 중국어 햄스터 난소 세포를 (CHO - K1) 성장.
2. 혈청이없는 미디어로 문화 매체를 교환. 라벨 세포 표면 단백질은 CyDye DIGE 플루어 Cy3 또는 Cy5 최소한의 염료 (아래 섹션 세포 표면 라벨을 참조) 다른 시간 지점에 있었다.
3. 각각의 시점과 CyDye DIGE 플루어 Cy2와 레이블에서 세포의 풀 같은 숫자. 각각의 2 - D 겔을위한 내부 표준으로 이들을 사용합니다.
4. 실험의 대부분은 CHO - K1 세포로 수행할 수 있지만, 마우스 배아 섬유아 세포 (3T3 L1)와 마우스 복수의 림프종 lymphoblasts (EL4)도 (데이터가 표시되지 않음) 사용할 수 있습니다.
5. GlutaMAX II와 DMEM 매체 두 후자의 셀 유형을 성장하지만, 그렇지 않으면, CHO - K1 세포에 사용되는 동일한 조건을 사용합니다.

세포 표면 라벨링

1. 조심스럽게 계산 및 50-10 x106 세포의 aliquots 나누어 아닌 효소 자기편 세포를 분리. 정지 성장 세포 들어, 분리 단계를 생략하십시오.
2. 5 분 약 800 XG에있는 세포를 원심 분리기 suspensions. 매체를 포함하는 supernatants를 제거합니다.
3. 1 ML 얼음 차가운 행크의 밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) 산도 8.5에서 resuspendion하여 알약을 씻으십시오. 4 800 XG ° 2 분 C에서 Centrifuged.
4. 뜨는를 제거하고 200 μl 얼음 차가운 라벨 버퍼에있는 세포 펠렛을 (HBSS 산도 8.5, 1 M 우레아) resuspend.
5. 어두운 얼음 속에서 20 분 동안 600 pmol CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료로 그대로 세포 라벨.
6. 라이신 20 μl 10 MM을 추가하여 반응을 끄다. 10 분 알을 품다.
7. 4 800 XG에서 원심 분리 ° C 2 분 뒤에 500 μl HBSS의 산도 7.4에 resuspension에 의해 두 번 표면 라벨 세포를 씻으십시오.

세포 용해 및 분류

1. 150 μl 차가운 용해 완충액 (7 M의 요소, 2 M 티오 우레아, 4 % 챕스, 30 MM 트리스, 5 MM의 마그네슘 아세테이트 산도 8.5)에 표면 라벨 세포를 Lyse. 가끔 vortexing 최소한 1 H 위해 얼음에 둡니다.
2. 4 10 000 XG에 lysates을 원심 ° C를 5 분. 새로운 튜브에 뜨는를 전송합니다. 이 예제는 모든 세포 단백질을 포함하는 비 fractionated 예제입니다.
3. 병렬, 멤브레인 및 cytosolic 분수 이전 2 - D 겔 전기 영동에로 (막 분획화 키트를 사용하여 피어스), 위에서 다음 분류 셀 알약을 씻으십시오. 멤브레인 분율은 내부와 세포 표면 막 단백질을 포함하고 있습니다.
4. 비교, 표준 Ettan DIGE 절차 ^3에 따라, 그리고 lyse, 레이블, 그리고 세포 마지막으로, 분류. D 퀀트 키트 (GE 헬스케어) - 2를 사용하여 샘​​플의 단백질 농도를 결정합니다.

2 - D 전기 영동

1. Immobiline의 DryStrip의 젤, Immobiline DryStrip Reswelling 트레이, 하루 450 μl DeStreak의 Rehydration 솔루션 24cm (0.5 %는 IPG 버퍼)를 사용하여 pH를 3 11NL을 (24cm) Rehydrate.
2. 매니폴드의 양극 컵로드하여 DryStrip 젤류을 Immobiline하고 지시에 따라 Ettan IPGphor II IEF 시스템을 사용하여 isoelectric 초점 (IEF)을 수행할 수있는 CyDye - 라벨 샘플 (50 μg 총 단백질에 해당)이 적용됩니다.
3. IEF 후, 대형 (26 X 20cm) 12.5 %의 polyacrylamide의 젤 (SDS - PAGE) 위에 두 단계와 장소에 부착된를 평형. 0.5 % 아가로 오스와 중첩 (bromophenol 파란색을 포함하는 버퍼를 실행에). 30 분 5 W / 겔에서 Ettan DALTtwelve 대형 수직 시스템을 사용하여 2 - D 전기 영동을 실행한 다음 15 염료 앞까지 W / 젤은 젤 하단에 도달합니다.

이미징 및 데이터 분석

1. 2 - D 전기 영동을 마친 후, 태풍 9,410 변수 모드 영상기를 사용하여 Cy2, Cy3 또는 Cy5에 대한 젤을 검사합니다.
2. DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어 ^사를 사용하여 막 분수, cytosolic 분수, 비 fractionated 샘플에서 현장지도를 비교합니다.

포스트 - 염색법

1. 이미징 후, 실버 표준 절차에 따라 ⁵ 젤을 얼룩.

단백질 식별

1. , 수확을 성장뿐만 아닌 fractionated 샘플 위에서 설명한 예비 금액 (10 x106 CHO 세포에서 약 1 MG 총 단백질) 세포를 씻어 및 lyse. 대못으로 Cy5 세포 표면 라벨 샘플을 (위 참조)를 사용하고, 단백질의 unlabelled 예비 금액과 함께 적용됩니다.
2. 위에서 설명한 2 - D 전기 영동을 수행하지만, 이번에는, aplly 600 μg 레이블이 지정되지 않은 세포는 양극 컵 응용 프로그램에 의해 스파이크 표시 50 μg 세포 표면과 함께 lysate. 올바른 장소 따기 수 있도록 참조 마커를 사용하여 할 곳추천 ^3에 따라 겔 주조하기 전에 트윈은 유리 접시.
3. 딥 퍼플 총 단백질 ³ 얼룩 사용하는 총 단백질 얼룩 다음 Cy5 세포 표면 현장지도를 얻을 수 Cy5 채널에서 젤 스캔.
4. DeCyder 사용하여 두 개의 현장지도를 2 - D 소프트웨어를 함께 매치하고 싸이 오 표시된 세포 표면 단백질에 해당하는 모든 장소에 대한 선택 목록을 만들 수 있습니다. Ettan 명소 처리 스테이션을 사용하여 세포 표면 단백질을 선택, 겔 플러그에서 추출하고, Ettan의 소화조를 사용하여 trypsinate. 든 - TOF 질량 분광법을 사용하여 식별합니다.

표 1. Ettan DIGE 실험은 그림 1에있는 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 따라 분류 혈청 고갈 세포의 샘플을 사용하여 수행되었습니다.

견본	혈청 고갈의 시간	CyDye과 Labelled	젤 번호
1	-	싸이 3, 싸이 2	1
2	삼십분	싸이 5, 싸이 2	1
3	이시간	싸이 3, 싸이 2	2
4	사시간	싸이 5, 싸이 2	2
5	16시간	싸이 5, 싸이 2	3

Discussion

단백질 농도

두 상표 워크플로우의 개요는 그림 1에 표시됩니다. 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 따라 분류하면 세포가 그대로 있기 때문에, 단지 세포 표면 단백질이 염색에 노출되어 있습니다. 세포 내부뿐만 아니라 외부 라벨 부착 및 단백질은 (그림 1) 표시되기 전에 표준 Ettan DIGE 프로토콜에서는, 세포가 lysed 있습니다. 세포 - 표면 단백질이 특별히 quantitated 수 없으므로 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 단백질 색소의 상대적 금액은 알 수 없다. 그러나, 그것은 세포 표면 단백질은 세포 ^단백질이 매우 낮은 비율을 구성하는 것이 알려져 있습니다. 염료 600 pmol에 약 50-10 X10 ⁶ 셀 사용되었습니다. 그것은이 연구에서 nonfractionated 샘플만을 12.5-25 %가 2 - D 전기 영동에 사용되는 시절부터 적은 세포를 사용할 수 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE 키트, 2 nmol	시약	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	시약	GE Healthcare	80-6484-51
IPG 버퍼 pH 3-11NL	시약	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	시약	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	도구	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox 키트	도구	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration 솔루션	시약	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover 유체	시약	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF 유닛	기기	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor 매니폴드	기기 구성 요소	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve 젤 캐스터	도구	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve 분리 장치 및 전원 공급 장치/제어 장치	기기	GE Healthcare	80-6466-46	230 V 장치: 80-6466-27
Typhoon 9410 가변 모드 이미저	기기	GE 헬스케어	63-0055-81
에탄 스팟 피커	기기	GE 헬스케어	18-1145-28
에탄 소화기	기기	GE 헬스케어	18-1142-68
에탄 스포터	기기	GE 헬스케어	18-1142-67
에탄 MALDI-TOF	기기	GE 헬스케어	18-1142-33
DeCyder 2-D 차등 분석 소프트웨어	기타	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant 분석 소프트웨어	기타	GE Healthcare	28-9236-62
요소	시약	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	시약	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne 디티오트레이톨(DTT)	시약	GE 헬스케어	17-1318-01
브로모페놀 블루	시약	GE 헬스케어	17-1329-01
트리스	시약	GE 헬스케어	17-1321-01
소듐 도데실설페이트(SDS)	시약	GE 헬스케어	17-1313-01
플러스원 글리세롤 87%	시약	GE 헬스케어	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	시약	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	시약	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne 과황산암모늄	시약	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne 글리신	시약	GE Healthcare	17-1323-01
멤브레인 단백질을 위한 2-D 시료 전처리	시약	Pierce, Thermo Scientific	89864
스트렙토마이신 황산염	시약	Invitrogen	15140-122