비 - 방사성 현장에서 하이브 리다이 제이션 노르웨이 스프루스에 대한 해당 프로토콜과 식물 종의 범위
2009년 4월 17일
우리는 수정된 발굴을 설명 현장에서 하이브리드화 프로토콜. 변경된 RNase 처리 및 proteinase K 농도를 포함한 몇 가지 조정을 통해 프로토콜은 서로 다른 조직과 종의 연구에 사용할 수 있습니다.
유럽가문비나무 및 다양한 식물 종에 적용 가능한 비방사성 제자리 하이브리드 형성(in situ hybridization) 프로토콜입니다. Carre Etal. 안녕하세요, 제 이름은 AM GaN이며, 스웨덴의 OBS 대학교와 스웨덴 농업과학대학교에서 연구하고 있습니다.
우리는 여러 가지 식물 종에 적용 가능한 곤충 방문 프로토콜을 수립하였습니다. 오늘은 그중 까다로운 몇 가지 단계들을 보여드리겠습니다. 본 프로토콜에서는 포매, 절편 제작 및 실제 곤충 방문 실험의 다양한 단계들을 설명하겠습니다.
실험실 1의 고정 및 포매 단계로 이동하여 프로토콜의 9단계부터 11단계까지 진행하겠습니다. 9단계, 페트리 접시와 몰드를 60°C로 예열합니다. 10단계, 핀셋을 가열하고 조직을 접시에 고르게 분배합니다.
조직이 완전히 덮이도록 histo wax를 더 추가합니다. 11단계에서는 실온에서 왁스를 굳힙니다. 프로토콜의 12단계부터 19단계까지 두 번 반복합니다.
핫플레이트를 켜고 녹인 조직용 왁스를 준비합니다. 저온실에서 샘플을 꺼냅니다. 13단계에서는 메스를 사용하여 조직 왁스 블록을 조심스럽게 절단합니다.
절단이 용이하도록 조각의 모양을 잡습니다. 14단계에서, 블록의 앞부분과 뒷부분을 가열하여 서로 융합시킵니다. 준비된 시료를 4°C에서 경화시킵니다.
15단계에서는 왁스 블록을 6~8 µm 두께의 섹션으로 절단합니다. 마이크로톰을 사용하여 섹션들을 하나의 긴 리본 형태로 연결합니다. 리본을 절단하여 종이 위로 옮깁니다.
이 시점에서 실체 현미경으로 개별 섹션을 검사하여 관심 있는 섹션을 선택할 수 있습니다. 조직이 있거나 에오신으로 염색된 경우 검사가 더 수월합니다. 17단계에서는 슬라이드에 RNA-free Milli Q water를 첨가합니다.
리본을 작은 조각으로 잘라 슬라이드 위에 올립니다. 슬라이드를 핫플레이트로 옮깁니다. 17단계에서는 리본이 42 °C 플레이트 위에서 1~2분 동안 평평하게 펴지도록 둡니다.
Kim wipe를 사용하여 물기를 제거합니다. 19단계, 조직이 슬라이드에 부착되도록 슬라이드를 42 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. in situ 하이브리드화 4.1 in-situ 섹션의 프로토콜 내 전처리 단계 36~48을 참고하십시오.
36단계에서는 조직층의 절편들을 분리합니다. 슬라이드를 일정한 간격으로 랙에 배치하여 서로 다른 용기 사이의 이동을 용이하게 한 뒤, 절편들을 탈수합니다. 에탄올 시리즈에서 격렬하게 저어주며 무수초산을 첨가합니다.
단계 45, 무수 초산 처리 4.2 인 시투(in situ) 하이브리다이제이션 준비. 프로토콜의 단계 49에서 52까지. 단계 51, ProOne Plus 슬라이드의 숙성.
용액의 점도가 높습니다. 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 슬라이드를 습윤 챔버에서 배양하십시오.
4.3 초기화. 하이브리드화 후, 프로토콜의 53단계부터 72단계를 수행합니다. 62단계에서는 슬라이드를 버퍼 블록과 함께 플라스틱 용기에 넣어 배양합니다.
63단계, 슬라이드가 충분히 덮일 정도로 블로킹 용액을 첨가합니다. 항체는 에이징(aging) 방식을 사용하여 슬라이드에 첨가합니다. 에이징 방식은 Prob Bon Plus 슬라이드에서만 가능합니다. 이와 유사한 설계의 슬라이드의 경우, 65단계에서 모세관력에 의해 anti-dig 항체 용액이 끌어올려지도록 합니다.
이 단계를 반복합니다. 이전과 마찬가지로 70단계에서 샌드위치 방식을 사용하여 western blue 용액을 흡입합니다. anti dig 항체 용액과 마찬가지로 western blue 용액을 두 번 흡입하는 점에 유의하십시오.
65단계 및 71단계에서 슬라이드를 암소에서 1~5일 동안 배양합니다. 실온에서 실체 현미경을 통해 하이브리다이제이션 신호를 모니터링할 수 있습니다. 슬라이드가 여전히 샌드위치 상태인 동안, 보라색에서 갈색의 염색 부위를 관찰할 수 있어야 합니다.
이것은 실제 CW 스테이션 실험의 결과물입니다. 여기서 신호는 보라색 또는 갈색의 염색으로 나타납니다.
개요
본 논문은 유럽가문비나무를 포함한 다양한 식물 종에 효율적으로 적용할 수 있는 수정된 DIG in situ hybridization 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 조직과 종에 걸쳐 적용 가능성을 높이기 위해 RNase 처리 방식과 Proteinase K 농도의 변경과 같은 구체적인 조정 사항을 포함하고 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 식물 생물학
- 분자 생물학
- 인시튜 하이브리다이제이션 기술
배경
- In situ hybridization은 조직 내 유전자 발현을 연구하는 데 매우 유용한 기술입니다.
- 전통적인 방법들은 시간이 많이 소요되며 종 특이적일 수 있습니다.
- 기존 프로토콜을 수정함으로써 효율성과 범용성을 개선할 수 있습니다.
- 본 연구는 다양한 식물 종에 적용 가능한 프로토콜에 초점을 맞춥니다.
연구 목적
- 더 빠르고 적응성이 높은 in situ hybridization 프로토콜을 개발하기 위함입니다.
- 해당 프로토콜이 유럽가문비나무 및 기타 식물 종에 적용 가능함을 입증하기 위함입니다.
- 연구자들에게 상세한 절차적 단계를 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 식물 조직의 포매 및 절편 제작.
- in situ 분석을 위한 전처리 및 하이브리다이제이션 단계.
- 결과 최적화를 위한 특정 시약 및 조건의 사용.
- 현미경을 이용한 하이브리다이제이션 신호 모니터링.
주요 결과
- 수정된 프로토콜은 여러 식물 종에 걸쳐 인 시투 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 성공적으로 촉진합니다.
- RNase 처리 및 proteinase K 농도의 조절을 통해 조직 호환성이 향상되었습니다.
- 하이브리다이제이션 신호의 명확한 시각화를 달성하였습니다.
- 본 프로토콜은 다양한 응용 분야에서 효율적이며 재현 가능합니다.
결론
- 수정된 DIG in situ hybridization 프로토콜은 식물 연구에 매우 유용한 도구입니다.
- 이를 통해 다양한 식물 조직 내의 유전자 발현을 신속하고 효과적으로 분석할 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 이 프로토콜을 기반으로 식물 생물학의 더 넓은 응용 분야로 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업계 관련성 요약
본 프로토콜은 식물 시스템에서 고해상도 공간 유전자 발현 분석을 가능하게 하여, 조직 특이적 발현 패턴을 확인함으로써 초기 발견 단계의 타겟 검증을 지원합니다. 이는 방사성 동위원물에 대한 의존도와 광범위한 종 특이적 최적화 과정을 줄여, 종 간 비교 연구의 재현성과 확장성을 향상시킵니다. 또한, 본 방법은 식물 기반 바이오 제약 파이프라인의 표현형 스크리닝 및 중개 바이오마커 발견에 있어 기전적 리스크 감소 가치를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 조직 특이적 mRNA 국소화를 확인하여 치료 가설을 조사하고 생식 발달 경로에서 유전자 기능을 명확히 함.
- 운영적 가치: 겉씨식물 및 속씨식물 모델의 수컷 생식 기관에서 유전자 발현을 직접 시각화함으로써 기능적 표적 검증을 가능하게 함.
- 예측적 가치: 애기장대, 브라시카 및 유럽가문비나무의 꽃 구조에서 상동 유전자(예: AP3 상동체)의 보존된 발현 패턴을 입증하여 예측 신뢰도를 지원함.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: DIG 표지 프로브를 사용한 일관된 신호 검출을 위해 하위 하이브리다이제이션 분석용 표준 조직 절편을 준비합니다.
- 재현성: RNase 처리를 제거하고 proteinase K 농도를 조절하여 신호 강도를 높이고 종 간 변동성을 줄입니다.
- 확장성: 최소한의 프로토콜 조정으로 다양한 식물 종에 걸쳐 고처리량 적용을 용이하게 하여, 비교 유전학에서 플랫폼 재사용을 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 번역 연속성: 모델 속씨식물부터 겉씨식물까지의 적용 가능성을 입증하여, 바이오매스 및 바이오폴리머 생산과 관련된 목본 다년생 시스템으로의 연구 결과 외삽을 지원합니다.
- 기전적 위험 감소: 서열 상동성과 보존된 발달 구조에서의 공간적 발현을 연계함으로써 유전자 기능 할당의 모호성을 줄입니다.
- 바이오마커 정렬: 생식 조직에서 유전자 발현과 표현형 특성 간의 공간적 상관관계를 가능하게 하여, 식물 분자 농업에서의 바이오마커 발견을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 발견 생물학 단계에 해당하며, 식물 기반 발현 시스템에서 리드 화합물 스크리닝 전의 가설 기반 표적 식별을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 특정 조직 및 발달 단계에서 후보 유전자의 공간적 발현을 검증함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 형질전환 또는 처리된 조직에서 화합물 효과 모니터링을 위한 분석 설계의 기초가 되는 정량적 공간 판독값을 생성합니다.
- 분석(Analytics): 실험 조건 간의 이미징 및 비교 분석에 적합한 검출 가능한 발색 신호(보라색에서 갈색)를 생성합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 생식 기관의 유전자 발현 패턴을 발달 표현형과 연결하여 형질 검증 파이프라인의 진행 결정 과정을 지원합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 종 간 유전자 발현 분석을 위한 표준화되고 적응 가능한 워크플로우를 구축하여 중복되는 최적화 노력을 줄입니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 방사성 위험 없이 직접적이고 공간적으로 분해된 mRNA 검출을 통해 표적 검증의 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: RNase 처리를 제거하고 proteinase K 사용을 표준화함으로써 재현성을 향상시키고 프로토콜 실패율을 낮춥니다.
- 전략적 가치: 발견 초기 단계에서 명확한 발현 데이터를 제공함으로써 표적 선정 시 go/no-go 결정 속도를 가속화합니다.
- 포트폴리오 영향: 종 간의 보존된 발현 패턴을 기반으로 표적의 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 하여, 후속 응용 단계의 성공률을 개선합니다.
실행 시 고려 사항
- 식물 재료의 조직학, 조직 포매 및 절편 제작에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 마이크로톰, 하이브리다이제이션 오븐 및 발색 검출 시스템의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 조직 밀도와 페놀 함량에 근거하여 proteinase K 농도의 표준화가 필수적입니다.
- 종 및 프로브 길이에 따라 배양 시간과 온도의 조정이 필요합니다.
- 리그닌 함량이 높거나 이차 대사산물이 풍부한 시료의 경우, 조직의 자가 형광 및 화합물 침투력으로 인해 제한적일 수 있습니다.
