Name: Fluorescencia In situ (FISH) Protocolo en el esperma humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Aprende el protocolo de hibridación in situ fluorescente (FISH) para analizar espermatozoides humanos y detectar aneuploidías en cromosomas 13, 18, 21, X e Y. Este método es esencial para el diagnóstico clínico de infertilidad masculina.

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Este trabajo fue apoyado por la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Los autores agradecen a J. Blanco y F. Vidal para su supervisión y estímulo, y Lucas J. por su asistencia técnica.

I. tratamiento de las muestras y la fijación de células <ol><li> Deja la muestra de semen en recipientes estériles a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta la licuefacción. </li><li> Transferir la muestra a un tubo de centrífuga y girar a 1000 g durante 5 minutos. </li><li> Retire con cuidado y descartar el sobrenadante con una pipeta Pasteur. </li><li> Añadir una solución hipotónica (KCl, 0.075M) pre-calentado a 37 ° C, gota a gota, mientras se mezcla en un vórtice de obtener un volumen final de 10 ml. </li><li> Colocar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. Elimine con cuidado el sobrenadante por decantación, sin perturbar el precipitado. </li><li> Después de resuspender el pellet, añada recién preparada fijador de Carnoy (3:1 metanol: ácido acético) gota a gota mientras se mezcla en un vórtice de obtener un volumen final de 8 ml. </li><li> Repetir los puntos 6 y 7 tantas veces como sea necesario para obtener una bolita blanca. </li><li> Añadir metanol recién preparada: ácido acético (3:1) gota a gota para ajustar el volumen final a la concentración celular requerida para la obtención de células buena difusión (en los casos con una pequeña bolita, unas cuantas gotas será suficiente mientras que las muestras con una gran cantidad de los espermatozoides recuperados, el volumen final puede llegar a 1-2 ml). Una diapositiva de prueba se puede hacer dejando caer la muestra se resuspendió en una diapositiva sin engrasar y examinarla bajo el microscopio de contraste de fase. Esto le permitirá comprobar la dispersión celular obtenido y que permita corregir, si es necesario, en una presentación de más. </li><li> Para hacer las extensiones, la caída de una altura mínima de 40 cm de dos o tres gotas de la suspensión celular en el centro de las diapositivas no congelado (previamente almacenados en metanol a -20 ° C para desengrasar). Para permitir la ubicación de la muestra durante todo el protocolo, marque el área que contiene la extensión de espermatozoides en el lado opuesto de la diapositiva con un lápiz de diamante. </li><li> Tienda de las diapositivas a -20 ° C durante al menos 24 horas. Nota: La adición de metanol: ácido acético (3:1) gota a gota, mientras que la mezcla es un paso muy importante para evitar la formación de agregados de espermatozoides. </li></ol> II. Descondensación <ol><li> Las diapositivas almacenadas a -20 ° C debe ser descongelado para continuar con el protocolo (dejarlos a temperatura ambiente). </li><li> Colocar el portaobjetos en dos frascos de Coplin consecutivos con una solución de 2x citrato salino-sódico (2XSSC) durante 3 minutos cada uno. </li><li> La transferencia de la diapositiva a través de una serie de lavados de etanol durante 2 minutos en cada frasco de Coplin. Comience con etanol al 70%, sigue en un 90% y terminar con un 100%. Secar el portaobjetos dejando a temperatura ambiente. </li><li> Incubar el portaobjetos en la solución de ditiotreitol (1,4-ditiotreitol 5 mM, 1% Triton X-100, 2-amino-2-(hidroximetil) -1,3-propanodiol 50 mm) a 37 ° C en la incubadora para decondense la cromatina. Este producto actúa rompiendo los puentes disulfuro de las protaminas que la bobina del ADN en el núcleo de los espermatozoides. Este es un paso muy importante porque el ADN en el núcleo del espermatozoide está muy compactado. El tiempo de incubación de los portaobjetos en solución de ditiotreitol (DTT) debe ajustarse de acuerdo a la reactividad de la muestra de este producto. Por lo general, esta vez es de alrededor de 8 minutos, aunque puede variar de 2 a 15 minutos. </li><li> Inmediatamente, la transferencia de la diapositiva a dos jarras Coplin consecutivos con 2XSSC durante 3 minutos en cada uno de Coplin. </li><li> Continúe colocando la diapositiva a través de una serie de lavados de etanol durante 2 minutos en cada frasco de Coplin (70%, 90% y el 100% de etanol). Dejó caer a secar a temperatura ambiente. Nota: La exposición excesiva a la TDT se traduciría en dispersar a las señales de FISH en el final del procedimiento, mientras que una exposición muy corta podría resultar en una falta de algunas señales. </li></ol> III. Hibridación <ol><li> Desnaturalizar el ADN de los espermatozoides mediante la incubación de la diapositiva en un frasco Coplin con una solución de formamida (70% Formamide/2xSSC) a 73 ° C durante 5 minutos. </li><li> La transferencia de la diapositiva a través de soluciones de etanol durante 1 minuto por cada frasco de Coplin (empezar con etanol al 70%, 85% y terminar con un 100%). Salga de la diapositiva a secar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir directamente de 5 l de la correspondiente lista para usar mezcla de sondas de una hoja de cubierta de 15x15 (Ensayo AneuVysion Multi-color del panel de la sonda: CEP 18/X/Y o 13/21 LSI). </li><li> Como se muestra en el video, se coloca cuidadosamente la diapositiva en la hoja de la cubierta de armar la región de destino y la mezcla de la sonda. Sellarlo con cemento de goma. </li><li> Colocar la placa en un 37 precalentado ° C cámara de hibridación (HYBrite ™) y se incuba a 37 ° C durante 6-24 horas. Nota: Considerando que la desnaturalización de la muestra de esperma es obligatorio, la necesidad de la desnaturalización de las sondas está determinado por el fabricante. Las mezclas de sonda utilizada en este protocolo están listos para usar y, en este caso, la desnaturalización de la sonda no es necesario. El volumen de la mezcla de la sonda varía según el tamaño de la zona de hibridación. </li></ol> IV. Lavapost-hibridación <ol><li> Sacar el portaobjetos de la cámara de hibridación. </li><li> Quitar el cemento de caucho y tire con cuidado la hoja de cubierta deslizante suavemente a un lado. </li><li> Para eliminar las señales de hibridación no específica el lugar de la diapositiva durante 2 minutos en un frasco Coplin con 0.4xSSC/0.3% NP-40 pre-calentado a 73 ° C en un baño de agua. </li><li> Transferir el portaobjetos a una solución 2xSSC/0.1% NP-40 de lavado a temperatura ambiente durante 1 minuto. Dejó caer a secar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir un producto contratinción de la región de destino (8 l de una hoja de cubierta 18x18). El producto más utilizado es de 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.). </li><li> Como se muestra en el vídeo, la cobertura de la región hibridada con una hoja de cubierta (para preservar la hibridación puede ser la hoja de la cubierta sellada con esmalte de uñas). </li><li> Almacenar los portaobjetos hibridados a -20 ° C en la oscuridad hasta su análisis la perspectiva. En estas condiciones, las diapositivas se pueden almacenar hasta 12 meses sin pérdida significativa en la intensidad de la señal de fluorescencia. Nota: Una temperatura más alta o un tiempo de lavado excesivo puede resultar en la eliminación de algunas señales, mientras que lo contrario no se lave las hibridaciones inespecíficas de la sonda. El volumen del producto contratinción añadido variará según el tamaño de la zona de hibridación de principio a fin. </li></ol> V. Visualización Las preparaciones pueden ser evaluadas bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con un filtro de triple banda de DAPI / Texas Red / FITC y la banda de un solo filtro de Aqua, FITC y Red Texas. Los criterios estándar de evaluación se deben seguir para la correcta evaluación de los núcleos de espermatozoides 1. La preparación de hibridación con sondas para los cromosomas X, Y y 18 debe mostrar señales de estos tres cromosomas. Todos los espermatozoides normales debe mostrar una señal de color azul (que corresponde al cromosoma 18), y una luz verde (X portador de espermatozoides) o una señal en rojo (de rodamientos espermatozoides). En la preparación de hibridación con sondas para los cromosomas 13 y 21, una señal verde para el cromosoma 13 y una señal en rojo para el cromosoma 21, ha de distinguirse en todos los espermatozoides normales.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la forma de procesar las muestras de semen humano para la obtención de preparaciones de esperma de pescado. El uso de este protocolo es posible analizar las anomalías cromosómicas en los gametos masculinos. Los espermatozoides de detección de aneuploidía tiene aplicaciones tanto en el contexto de la investigación básica y en el consejo reproductivo dado a los hombres infértiles. Aunque en el diagnóstico clínico de los cromosomas más estudiados son X, Y, 13, 18 y 21 de otras sondas comerciales par...

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Material</td><td>Grupo Roche</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol</td><td>Material</td><td>Grupo Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Material</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; Kit multicolor de sondas de ADN&lt;ul style=&quot;relleno:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Salina-Citrato de Sodio&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sonda de ADN CEP 18/X/Y&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;sonda de ADN LSI 13/21&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Material</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;relleno:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804R</td><td>Herramienta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td><td>Material</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>frasco Coplin (vidrio)</td><td>Material</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>frasco Coplin (plástico)</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (15x15)</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>Cubrebjetes (18x18)</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>Lápiz de diamante</td><td>Material</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Material</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Material</td><td>Grupo Roche</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Congelador</td><td>Herramienta</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Material</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>Herramienta</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión</td><td>Material</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Herramienta</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Material</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Material</td><td>Labsystems</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>Punta de reemplazo para micropipeta</td><td>Material</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>Barniz de uñas</td><td>Material</td><td>Quo-cosméticos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescente Olympus BX60</td><td>Herramienta</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Equipado con un filtro de triple banda para DAPI/Texas Red/FITC y filtros de banda única para Aqua, FITC y Texas Red.</td></tr><tr><td>Pipeta de Pasteur</td><td>Material</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fases</td><td>Herramienta</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico (3 ml)</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Material</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Cemento de caucho</td><td>Material</td><td>Mejor prueba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láminas</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>Cajas protectoras para portaobjetos</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor estéril</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Material</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>Material</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>Agua tri-destilada</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Material</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>Laminar vertical &lt;em&gt;cabina de flujo laminar&lt;/em&gt;</td><td>Herramienta</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Herramienta</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencia in situ</emhibridación> (fish) protocolo en el esperma humano

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidías son las anomalías cromosómicas más frecuentes en los seres humanos. La mayoría de estas anomalías el resultado de errores durante el proceso de meiosis gametogénico en los padres. En los machos humanos, estos errores pueden conducir a la producción de espermatozoides con anomalías cromosómicas numéricas que representan un mayor riesgo de transmisión de estas anomalías a la descendencia. Por esta razón, la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) en los núcleos de los espermatozoides se ha convertido en un protocolo ampliamente incorporado en el contexto del diagnóstico clínico. Esta práctica proporciona una estimación de la frecuencia de anomalías cromosómicas numéricas en los gametos de los pacientes que buscan el consejo genético reproductivo. Hasta la fecha, los cromosomas más frecuentemente incluidos en el análisis de esperma de pescado son los cromosomas X, Y, 13, 18 y 21. Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo procesar y fijar una muestra de semen humano, cómo decondense y desnaturalizar la cromatina de los espermatozoides, la forma de proceder para obtener preparaciones de esperma de pescado, y la forma de visualizar los resultados en el microscopio. Comentarios especiales de los pasos más relevantes se dan para alcanzar los mejores resultados.

Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo se procesa una muestra de semen para lograr una buena calidad de fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación en los espermatozoides humanos. Los preparados obtenidos pueden ser utilizados para la detección de aneuploidía en el contexto del diagnóstico clínico.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Las aneuploidías son las anomalías cromosómicas más frecuentes en los seres humanos. La mayoría de estas anomalías son el resultado de errores meióticos durante la gametogénesis...

El protocolo de hibridación fluorescente in situ en núcleos de espermatozoides humanos se ha incorporado ampliamente en el campo del diagnóstico clínico. Una de las aplicaciones de esta metodología es el cribado de la ploidía de los espermatozoides. Como parte del asesoramiento reproductivo ofrecido a hombres infértiles, la presencia de anomalías numéricas es mayor en estos individuos que en la población general, y con frecuencia presentan parámetros seminales anormales.Esto representa un riesgo aumentado de transmitir estas anomalías a cualquier descendencia. Hoy vamos a ilustrar el protocolo de hibridación fluorescente in situ en núcleos de espermatozoides descondensados para el análisis de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. Una vez que se ha recolectado la muestra, debe dejarse a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta que ocurra la licuefacción. Para comenzar el protocolo, la muestra debe transferirse a un tubo de centrífuga.Las soluciones que vamos a utilizar en la primera parte del experimento son hipertónicas, precalentadas a 37 grados C, y ácido acético en metanol en la proporción de tres a uno. Estas deben prepararse recién. Luego, la muestra está lista para centrifugar a 1000 G durante cinco minutos.Ahora, retire suavemente el sobrenadante y agregue la solución hipertónica gota a gota hasta obtener un volumen de aproximadamente 10 mililitros. Este tubo debe permanecer a 37 grados C durante 30 minutos, y luego la muestra debe centrifugarse nuevamente. La centrifugación provoca que los espermatozoides se acumulen en el fondo del tubo, lo que nos permite reemplazar la solución hipotónica con metanol.La centrifugación con ácido acético debe repetirse para cambiar el metanol-ácido acético tantas veces como sea necesario para obtener un sedimento blanco. Cuando esto ocurra, debe añadirse más metanol-ácido acético. El volumen final debe ajustarse según la dispersión celular que desee obtener en extensiones posteriores.El paso final consiste en realizar las extensiones dejando caer la muestra fijada sobre portaobjetos Reed almacenados en metanol a menos 20 grados C. Es útil delimitar el área del portaobjetos que contiene la extensión de espermatozoides para futuras relocalizaciones. Esto puede hacerse fácilmente utilizando un lápiz de diamante en el lado opuesto del portaobjetos. Una vez verificada una dispersión celular óptima, los portaobjetos deben almacenarse a menos 20 grados C durante un mínimo de 24 horas.Antes de continuar con el protocolo. En esta parte del experimento, vamos a utilizar solución de citrato de sodio salina, serie de etanol, DRE fatal y fide. Una vez que los portaobjetos hayan sido descongelados, las muestras fijadas deben lavarse y deshidratarse sumergiéndolas en dos frascos coplin consecutivos que contienen dos veces SSC.Esto llevará tres minutos para cada coplano. Luego, las laminillas deben sumergirse durante dos minutos en cada uno de los frascos de coplano de etanol en orden de concentración creciente. En este punto, para continuar con las siguientes etapas, las laminillas deben secarse completamente.Dado que el ADN en el núcleo del espermatozoide está altamente compactado, es necesario descondensar la cromatina antes de desnaturalizarlo. Esto puede hacerse utilizando una solución de DTT a 37 grados C. Este es un producto que actúa rompiendo los puentes de azufre de la protamina que enrolla el ADN en el núcleo del espermatozoide. El tiempo de incubación del portaobjetos en DTT debe ajustarse según la reactividad de la muestra de semen a este producto.Normalmente, esto es de aproximadamente ocho minutos, aunque puede variar de dos a quince minutos; después de este tiempo, las laminillas deben transferirse inmediatamente a dos veces SSC durante tres minutos y nuevamente durante tres minutos adicionales, seguido de dos minutos en cada uno de los frascos de etanol coplán. Para la hibridación de la sonda, es esencial trabajar con cadenas simples de ADN. Esto requiere una etapa de desnaturalización antes de la adición de las sondas, que implica un período de incubación de cinco minutos en una solución de formamida a 73 grados C. Para concluir el tratamiento de las laminillas, se requiere una transferencia final en la solución de etanol, sumergiendo las laminillas durante un minuto por frasco coplán.Luego, las láminas están listas para ser hibridadas en los estudios FISH realizados para el diagnóstico clínico. Los cromosomas analizados con mayor frecuencia incluyen los cromosomas sexuales y los cromosomas 13, 18 y 21. Para analizar estos cromosomas, utilizaremos un kit de sondas de ADN multicolor de vices.Este contiene un vial con una combinación de sondas para la región satélite alfa de los cromosomas X, Y y 18, marcados con origen verde y aqua respectivamente, y otro vial con una combinación de sondas para los cromosomas 13 y 21, marcados verde y naranja respectivamente. El volumen de la mezcla de sonda añadido variará según el tamaño del área que desee hibridar como referencia para una cubierta de 15 por 15. Un volumen de cinco microlitros es suficiente.Ambas mezclas de sondas se pre-desnaturalizan en un tampón de hibridación para facilitar su uso, por lo que se pueden añadir directamente a las preparaciones de cromosomas condensadas y desnaturalizadas. También existen otras sondas comerciales disponibles para una amplia gama de cromosomas y Loki que pueden utilizarse en estos experimentos. Por lo general, sin embargo, estas sondas requieren un tratamiento de pre-desnaturalización antes de añadir la mezcla a la muestra objetivo.En estas situaciones, es suficiente seguir las instrucciones del fabricante. La región objetivo debe cubrirse con una laminilla y sellarse con cemento de goma. Luego, los portaobjetos están listos para colocarse en la cámara de hibridación, precalentada a 37 grados C, e incubarse a esa temperatura durante seis a 24 horas.En la parte final del protocolo, vamos a utilizar estas dos soluciones de lavado compuestas por diferentes concentraciones de solución de citrato de sodio salino y el detergente NP 40. Después del tiempo de incubación, se pueden retirar las laminillas de la cámara de hibridación para eliminar el cemento de goma. Luego se retira cuidadosamente la cubreobjetivo.Como se muestra, los portaobjetos se sumergen durante dos minutos en la primera solución de lavado, precalentada a 73 grados C. Luego se transfieren a la segunda solución de lavado a temperatura ambiente durante un minuto adicional. Estos dos lavados nos ayudarán a eliminar cualquier señal de hibridación inespecífica. Después de estos dos lavados, debemos esperar a que los portaobjetos se sequen para concluir el último paso del protocolo.En este momento, se añade un producto de contratincción para facilitar la visualización del núcleo de las células. Uno de los productos más comunes utilizados con este fin es dpi. El volumen añadido también debe ajustarse al tamaño del área hibridada como referencia para una cubreobjetos de 18 por 18.Un volumen de ocho microlitros de DPI es suficiente. La laminilla puede sellarse con barniz de uñas, y ahora los preparados están listos para ser visualizados. Alternativamente, pueden almacenarse a menos 20 grados C hasta su análisis posterior.El microscopio que vamos a utilizar para la visualización es un Olympus BX 60 epifluorescente equipado con un filtro de triple banda para dpi, Texas Red, FITC y filtros de banda simple para aqua FITC y Texas Red. A través del filtro de triple banda, la preparación hibridada con x, Y y 18 muestra señales para estos tres cromosomas. Utilizando el filtro de banda simple para aqua, solo podemos visualizar las señales fluorescentes del cromosoma 18. Deberíamos esperar una de estas señales en cada espermatozoide normal.Sin embargo, al utilizar el filtro de banda única solo para FITC, algunos espermatozoides muestran una señal fluorescente verde correspondiente al cromosoma X. Los espermatozoides que carecen de la señal verde deben mostrar una señal roja para el cromosoma Y, que puede visualizarse específicamente mediante el filtro para Texas red. Al visualizar la hibridación 1321 a través del filtro de triple banda, podemos distinguir las señales de estos dos cromosomas.La señal verde corresponde al cromosoma 13 y se puede visualizar específicamente utilizando el filtro de banda única para FITC. El filtro de banda única para Texas Red nos permite visualizar específicamente las señales del cromosoma 21. Todos los espermatozoides normales deben mostrar una señal para cada uno de estos dos sondas.Por tanto, para resumir, estas son las principales etapas del protocolo. Nuevamente, el proceso de fijación debe realizarse con precisión para obtener extensiones de buena calidad mediante la adición gota a gota de ácido acético metanólico. Para evitar la formación de agregados de espermatozoides durante el proceso de descondensación, el tiempo de incubación en la solución de DTT debe ajustarse según la reactividad de la muestra de semen a este producto.La exposición excesiva de los espermatozoides al DTT daría como resultado señales dispersas al final del protocolo, mientras que una exposición insuficiente provocaría una hibridación nula de la sonda y la ausencia de algunas señales. Si bien la desnaturalización de la muestra espermática es obligatoria, la desnaturalización de la sonda debe adaptarse a las indicaciones del fabricante. Es importante mantener un control estricto sobre el tiempo y la temperatura de los dos lavados posteriores a la hibridación.Una temperatura más alta o un tiempo de lavado excesivo puede provocar la eliminación de algunas señales, mientras que lo contrario no eliminaría las señales inespecíficas. Finalmente, el uso de un microscopio fluorescente epiluminiscente equipado con filtros específicos adecuados es esencial para una buena visualización e interpretación de las señales. Y eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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