Name: 의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 심장 구조의 형광 라벨링 방법을 통해 발달 생물학 연구에서 고해상도 이미징을 활용한 심장 형태학 분석을 수행하는 기법을. 이 프로토콜은 유충과 성충 표본에서 심장 조직의 상세한 시각화를 가능하게 합니다.

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저자는이 원고의 준비에 관한 중요 읽고 도움이 제안 SI 번스타인 (샌디에고 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 SI 번스타인, SDSU,와 R. Bodmer, BIMR에 NIH 교부금에 의해 지원되었다;와 미국 심장 협회의 미국 서부 제휴에서 G. 포글러와 A. Cammarato에 박사후 교제로.

당신이 시작하기 전에 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ol class="lalpha"><li> 편안한 버퍼 (10 MM EGTA을 포함 인공 Drosophila hemolymph (ADH) ( &quot;Drosophila에서 뛰는 심장을 떠올리&quot;참조)) </li><li> 정착액 (1X PBS 4 %의 포름 알데히드) </li><li> PBSTx (PBS는 0.1 % 트리톤 - X - 100을 포함) </li><li> PBSTx에 적절하게 희석 주와 종 특정 찬란 분류 이차 항체 </li></ol></li><li> 다음과 같은 심장병 튜브 (성인 파리 및 / 또는 애벌레의) 노출 Drosophila를 해부하다 <ol class="lalpha"><li> 반 그대로 Drosophila의 심장 준비 &quot;Drosophila에서 뛰는 심장을 떠올리&quot;에서 프로토콜, 또는 </li><li> 다음과 같은 수정 Drosophila 애벌레 NMJ 해부 프로토콜 1 : 사용 애벌레 해부 동안 ADH를 산소와 복부 정중선에서 약간 뒷부분 핀을 치환. 유충은 복부 정중선을 따라 절단됩니다. 전에 고정 어떤 조직을 제거하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 형광 스테 이닝 <ol><li> 모든 마음은 리드미컬 산소 ADH에 뛰는 것을 확인하십시오. 빨리 버퍼 휴식과 ADH를 교체하십시오. 수축을 저해되도록 각 심장병 튜브를 검사합니다. </li><li> 정착액으로 편안한 버퍼를 교체하여 마음을 고쳐. 부드러운 잡고 20 분 실온에서 알을 품다. (애벌레 준비 흔들어 어느 단계에서 필요하지 않습니다, 그리고 심장 조직 무결성에 해로운 것으로 간주됩니다.) </li><li> 지속 잡고 실온에서 PBSTx와 십분 표본 세 번 씻으십시오. </li><li> 성인, 신중하게 어떤 것이 더 남아 타원형 이하 반올림되어 같은 복부 표피의 복부 가장자리를 다시 잘라. 또한 복부와 흉부 사이에 싱글 컷, 신중하게 그리고 깔끔하게 별도의 신체 세그먼트 모두와 함께 심장의 앞쪽에 영역에 최소한의 손상을 보장합니다. 애벌레의 마음을 위해, 신중하게 잘 집게를 사용하여 지방 시신을 제거합니다. 애벌레 마음이 특히 연약하고 다른 근육이나 결합 조직에서 거의 지원을했기 때문에 지방 제거가 극단주의와 함께 실행해야합니다. 이것은 심장 손상을 수 있으므로 tracheal 가지를 제거하지 마십시오. </li><li> PBSTx에 희석 일차 항체의 50-100 μl를 포함 우물과 96 잘 접시로, 중앙에 위치한 심장 튜브와 접촉을 피하기 위해, 가장자리에 의해 복부 표피의 손질 등의 지역을 전송합니다. 물론 당 더 이상 12 이상의 표본을 넣으십시오. 지속적인 교반과 함께 2 시간 동안 실온에서 알을 품다. 부화도 4 밤새 할 수 있습니다 ° C. </li><li> 기본 항체 솔루션을 제거합니다. 지속 잡고 상온 100 μl PBSTx와 십분 마음을 세 번 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 버퍼의 제거에 따라, Alexa594 - phalloidin (1:1000)와 보충 PBSTx에서 이차 항체 100 μl를 추가합니다. 상온에서 지속적으로 흔들어 한 시간 동안 부화. 표백 형광단을 방지하기 위해 적용 샘플을 보관. </li><li> 보조 부화 후, 지속적인 흔들림과 함께 실온에서 PBSTx 100 μl와 십분 마음을 세 번 씻으십시오. 세척 단계에 걸쳐 적용 샘플을 보관. </li><li> 트리톤 - X - 100의 제거를위한 10 분 동안 PBS 100 μl의 마음에게 마지막 시간을 씻어. 표본은 설치하기 전에 며칠 동안 4 ° C에서 어둠에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 성인 하츠 장착 <ol><li> Vectashield 설치 매체의 10 μl와 현미경 슬라이드에 두 18 X 18mm 커버 전표를 준수합니다. coverslips는 ~ 10~15밀리미터 분리 간격해야합니다. 두 coverslips 사이에 매체를 장착의 작은 제 3 방울을 넣으십시오. </li><li> 삼분의 일 coverslip의 중심에 Vectashield 20 μl를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 표피의 극단적인 가장자리 PBS 세척 솔루션의 마음을 각각 제거하고 부드럽게 세 번째 coverslip에 장착 매체의 드롭에 그들 가슴 쪽을 놓으십시오. coverslip에 드롭 당 채 5 마음을 놓으십시오. </li><li> 모든 마음은 아래로 향하게 수 있도록하기 위해 현미경으로 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 마음을 포함하는 coverslip을 반전하고 신속하게 coverslips의 쌍을 포함하는 등 그 coverslip 쌍 사이의 Vectashield의 ​​비말과 심장 튜브의 퓨즈로 비말. 슬라이드에 배치 &quot;다리&quot;가 coverslips에 의해 형성되어야합니다. 마음은 coverslip과 현미경 슬라이드 사이에 일시 중지됩니다. </li><li> 그 마음은 지금 상승세를 직면하기 위해 현미경으로 확인합니다. </li><li> 매니큐어 그들의 가장자리에 coverslips을 수정. </li><li> 마음은 이제 형광등이나 공촛점 현미경을 통해 몇 군데 준비하고 있습니다. </li></ol><ol><li> 현미경 슬라이드에 한 방울 (~ 20 μl) Vectashield를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 텅스텐 바늘을 사용하여 다운 Vectashield과 동양들을 등의 측면 두개의 애벌레 표본까지 전송할 수 있습니다. </li><li> 개별적으로 설치 매체의 표본을 드래그 병렬로 각각 정렬합니다. </li><li> 표본의 측면에 반대에 coverslip 놓으십시오. 포셉를 사용하여 사후 coverslip에 한쪽을 세우고 있으므로 다리를 형성 앞쪽에 coverslip에 아래로 낮추는 방법으로 먼저, 상단에 삼분의 일 coverslip을 놓으십시오. 모세관 세력은 애벌레 마음의 적절한 정렬을하는 데 도움이 앞쪽이 후부에서 Vectashield의 ​​흐름을 발생합니다. </li><li> 매니큐어와, 그들의 가장자리에서, 장소에있는 모든 coverslips를 수정하고 조심스럽게 20-30 μl Vectashield와 coverslips 사이의 공간을 채우십시오. </li><li> 4 매니큐어 및 저장과 인감 ° C 또는 -20 ° C.에 장기 저장을 위해 </li></ol> 대표 결과 제대로 실행되면, 모든 구성 요소와 지느러미 선박의 관련 조직은 그대로 유지하고 쉽게 시각되어야합니다. 배경 형광을 최소화해야합니다. 잘 성인, 복부 세로 근육 계층 얼룩과 상당한 신호 (그림 1 및 그림 2)을 생산하고 있습니다. 기본 원형 cardiomyocytes 그러나, overlying 복부 레이어의 같은 강한 신호로 생성하지 않는 경향이 있습니다. 성인 심장의 앞쪽에 &quot;원뿔 회의소&quot;의 myocytes는 수축성 물질의 상당한 금액을 포함하고, 그 결과,이 지역은 심장 튜브의 나머지 부분에 가장 강력한 상대으로 나타납니다. 애벌레 심장은 성인 수축성 cardiomyocytes (그림 3)의 비슷한 나선형 myofibrillar 배치를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="그림 1A" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="그림 1B" /> 그림 1 : 탑. 마이 오신 - GFP를 표현 성인 Drosophila melanogaster의 전체 심장병 튜브를 보여주는 형광 현미경. 이미지가 Apotome 슬라이딩 모듈이 장착된 자이스 혈구 영상기 Z1 형광 현미경으로 찍은. 마이 오신 - GFP는 녹색으로 표시됩니다, 굴지이 AlexaFluor ® 594 phalloidin (적색)과 α - actinin 물들일있다는 반 α - actinin 항체 (파란색)으로 표시됩니다. 예비 절차가 잘 보존된 구조 심장 샘플 복구를 허용합니다. CC = 원뿔 챔버, AM = alary 근육, V = 내부 밸브; VLL = 복부 세로 근육 층. 바텀. 단지 수축성 cardiomyocytes의 나선형 myofibril 배치를 보여주는 배면의 길이 레이어 아래의 중심부에 3 복부 세그먼트를 통해 CC에서 성인 심장병 튜브의 영역입니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1A의 더 큰 버전을 위해, 그리고 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">여기에</a> 그림 1B의 큰 버전에 대한 <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : AlexaFluor ® 594 phalloidin (적색)과 안티 Pericardin (콜라겐 유형 IV) (녹색) 항체 물들일 성인 심장의 앞쪽에 부분을 대표 공촛점 스택. Pericardin 가능성이 복부 근육 계층의 길이 방향 중심 myofibrils에서 발생, 복부 표면을 따라 마음으로 연결됩니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 위해. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : 무대 세 Drosophila의 유충의 적절한 마음의 세그먼트 A7의 형광 현미경. 이미지가 Apotome 슬라이딩 모듈이 장착된 자이스 혈구 영상기 Z1 형광 현미경으로 찍은. 굴지이 AlexaFluor ® 594 phalloidin (녹색)과 α - actinin과 함께 표시됩니다은 안티 - α - actinin 항체 (적색) 물들일 것입니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">여기를 클릭</a> 그림 3의 더 큰 버전을 위해.

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<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
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</ol>

여기서 우리는 Drosophila melanogaster의 지느러미 선박 및 형광 또는 공촛점 현미경을 통해 이미지를위한 관련 조직을 준비하고 얼룩을위한 유용한 프로토콜을 제시한다. 우리도 세련되고 일반적으로 애벌레와 어른 Drosophila의 심장 튜브의 현장 이미지에 잘 해결을 허용 효과적으로 얼룩을 위해 우리가 실험실에서 고용 단계 간결한 계정을 제공합니다. 기타 약식 형태로 2, 3, 4에서와 비슷한 방법을 설명합니다. 얼룩 절차를 구현할 때 중요 자세한 내용은 배려를 필요로합니다. 예를 들어, 다른 생물 학적 재료로 발견, 공정 준수 Drosophila 심장 근육 섬유는 매우 취성 다음과 같은 고정된다. 특히 주 5 상당히 섬세하고있는 심장병 튜브에 연결된 지원 alary 섬유, 6, 7의 여러 쌍 있습니다. 따라서, 불필요한 조작을 제한하는 것...

<table><tbody><tr><td>Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetra-acetic acid (EGTA)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드, 10%, 메탄올 프리, Ultra Pure</td><td>시약</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 phalloidin</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 포함 형광용 Vectashield&amp;#174; 마운팅 미디엄</td><td>시약</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 핀</td><td>시약</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>핀 홀더</td><td>시약</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

의 형광 라벨링 drosophila 심장 구조

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; 등의 혈관이나 심장 수축성 cardiomyocytes, 성인에서 심장 벽, 지원 alary의 근육과, 복부 세로 근육 세포의 레이어의 각 측면을 따라 정렬 pericardial 세포의 단일 레이어로 구성된 관형 구조입니다. 수축성 섬유의 집 myofibrils과 세포외 기질의 구성 요소와 상호 작용하는 동종 cytoskeletal / submembranous 단백질 단지의 밀도가 높은 포장 번들을 포함하여 근육 cytoarchitecture의 성분을 보존. 여기를 해부 애벌레와 준 그대로 성인의 마음에서 고정 특히 심근 원소의 형광 라벨을위한 프로토콜을 설명<em&gt; Drosophila</em&gt;. 특히, 우리는 애벌레 마음에 F - 굴지 sarcomeric 및 α - actinin의 라벨을 보여줍니다. 또한, 우리는 야생의 유형 성인의 마음에 성인 파리를 표현하고 α - actinin과 pericardin, 유형 IV 세포외 기질의 콜라겐 마이 오신 - GFP에서 F - 굴지과 α - actinin의 라벨 수행합니다. 특히주의는 취급을 최소화하고 심장병 튜브 및 관련 조직의 무결성을 유지하기위한 기회를 최적화 세미 그대로 성인의 마음에 마운트 전략에 주어집니다. 이러한 준비는 형광 및 공촛점 현미경을 통해 이미지에 적합합니다. 전반적으로,이 절차는 강력한 유전자 다루기 쉬운 모델 시스템에서 심장의 구조적 특성주의하고 자세한 분석을 위해 수 있습니다.

여기 우리는 유충과 성인에서 심장 튜브의 다양한 요소의 형광 라벨을위한 기본 프로토콜을 설명<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. 이러한 표본은 형광등이나 공촛점 현미경을 통해 이미지에 적합합니다. 이 기술은 강력한 모델 유기체에서 마음의 기능의 세부 구조 분석을 수 있습니다.

의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조

초파리(*Drosophila melanogaster*)의 배혈관(dorsal vessel), 즉 심장은 단층의 수축성 심근세포, 심낭세포...로 구성된 관 모양의 구조입니다.

안녕하세요, 저는 Burnham 의생명연구소의 발달 및 노화 프로그램 내 Ralph Boer 연구실의 Nikita Ari입니다. 저는 같은 연구실의 Gil ler입니다. 오늘은 larval 및 성체 zebrafish 심장 구조의 형광 표지 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 성체 초파리의 심장 구조를 형광 표지하여 공초점 또는 형광 현미경으로 형태 및 구조 분석을 수행하기 위해 심장 튜브를 준비하는 이 절차를 사용합니다. 먼저, 반쯤 온전한 성체의 흉부와 복부 사이를 한 번 절개하여 체절을 분리합니다. 그런 다음 성체 큐티클의 돌출된 복측 가장자리를 다듬어 줍니다.다음으로, 성체 또는 해부된 유충 표본을 전이시키고 1차 및 2차 항체로 라벨링합니다. 라벨링 후, 세척된 성체 표본의 큐티클 가장자리를 잡고 커버슬립 위의 vector shield 한 방울 위에 심장 쪽이 아래로 향하게 놓아 고정합니다. 그 다음, 슬라이드 위에 두 개의 커버슬립으로 지지된 배지 한 방울 위로 커버슬립을 뒤집어 놓아 브릿지를 형성합니다. 이렇게 하면 심장이 수직으로 매달리게 됩니다. 유충 심장 고정 방법도 이와 동일합니다.표본의 복면이 아래로 향하게 하여 슬라이드 위에 옮기고, 슬라이드 양쪽에 커버슬립 두 개를 고정합니다. 마지막으로, 세 번째 커버슬립을 유충의 후단 근처에 있는 커버슬립 위에 먼저 올려 다리 모양으로 고정합니다. 이제 심장을 이미지화할 준비가 되었습니다.본 절차를 시작하기 전, 이 시리즈의 다른 비디오 프로토콜에서 설명된 대로 A DH가 포함된 A DH 이완 버퍼와 1X PBS-T(PBS, TX) 내 4% formaldehyde로 구성된 10 millimolar EGTA 고정액, 그리고 적절히 희석된 1차 항체 및 형광 표지 2차 항체를 준비하십시오. PBS TX 내에서 성체 및 유충 초파리를 해부하여 심장관을 노출시키는데, 이는 비디오 프로토콜 'visualizing the beating heart in drosophila' 및 'drosophila larval NMJ dissection protocol'에 제시된 반-온전한 초파리 심장 준비법을 따릅니다. 다만, 유충 해부 시에는 산소가 공급된 A DH를 사용하고, 후방 핀들을 복측 중앙선에서 약간 떨어뜨려 배치하는 수정 사항을 적용하십시오.복측 정중선을 따라 절개합니다. 다음 단계의 고정 전까지는 어떠한 조직도 제거하지 마십시오. 현미경으로 모든 심장이 산소화된 A DH 내에서 리듬감 있게 수축 및 이완하는지 확인하여 라벨링 절차를 시작합니다. 그 후 A DH를 이완 버퍼로 빠르게 교체하고, 각 심장관을 다시 검사하여 수축이 억제되었는지 확인하십시오.이완 완충액을 고정액으로 교체하여 심장을 고정합니다. 실온에서 부드럽게 흔들어주며 20분 동안 배양합니다. 유충 표본 준비의 경우, 어느 단계에서도 흔드는 과정이 필요하지 않으며, 오히려 심장 조직의 무결성을 해칠 수 있다는 점에 유의하십시오.20분이 지나면 고정액을 제거하고, P-B-S-T-X로 10분씩 3회 표본을 세척합니다. 성체 표본의 경우, 실온에서 지속적으로 흔들어주며 복부와 흉부 사이를 조심스럽고 깔끔하게 한 번 절개합니다. 심장의 앞부분에 손상을 최소화하면서 두 신체 분절을 분리합니다.심장의 원추형 챔버가 있는 전복부 섹션을 절단하지 않도록 주의하십시오. 현미경으로 표본을 관찰하여 깨끗하게 절단되었는지 확인하십시오. 다음으로, 복부 큐티클의 돌출된 배측 가장자리를 조심스럽게 다듬어, 남은 부분이 원형보다 더 타원형이 되도록 합니다.미세 핀셋을 사용하여 유충 심장의 지방체를 조심스럽게 제거합니다. 이 과정은 매우 주의해서 수행해야 합니다. 유충 심장은 특히 취약하며 다른 근육이나 결합 조직의 지지가 거의 없으므로, 심장에 손상을 줄 수 있는 기관지 분지(tracheal branches)는 제거하지 마십시오.다음으로, PVS TX로 희석하여 96-well 플레이트의 웰당 50 µL씩 분주한 1차 항체와 함께 배양합니다. 성충 파리의 경우, 중앙에 위치한 심장관(cardiac tube)에 닿지 않도록 다듬어진 등쪽 큐티클의 가장자리를 잡고 플레이트로 옮깁니다. 웰당 12개 이하의 표본을 넣고 지속적으로 흔들어주며 실온에서 2시간 동안 배양합니다.포셉을 사용하여 유충 표본의 가장자리를 잡고 PBSTX가 채워진 웰로 옮깁니다. 배양 종료 시 유충 표본을 흔들지 마십시오. 1차 항체 용액을 제거합니다.실온에서 100 µL의 P-B-S-T-X로 심장을 10분씩 3회 세척한 후, Alexa 594 Phin이 첨가된 PBS tx 내의 2차 항체 100 µL로 마지막 세척을 수행합니다. 이후부터는 형광 표백을 방지하기 위해 샘플을 덮어두고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 용액을 제거하고 실온에서 100 µL의 P-B-S-T-X로 심장을 10분씩 3회 세척합니다.마지막으로, 심장을 100 µL의 PBS로 10분 동안 헹구어 TRITTON X 100을 제거합니다. 시료는 마운팅 전까지 4 °C의 암소에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 먼저, 마운팅을 위한 슬라이드를 준비하십시오.현미경 슬라이드 위에 Vector Shield 마운팅 용액 10 µL 방울 세 개를 일정한 간격으로 떨어뜨립니다. 바깥쪽 방울들 위에 18 by 18 mm 커버슬립 두 개를 올리고, 커버슬립 사이의 간격을 약 10 to 15 mm로 유지합니다.또한, 세 번째 커버 슬립 중앙에 vector shield 20 µL를 떨어뜨립니다. 다음으로, 해부된 성체 파리의 큐티클 가장자리 끝부분을 잡습니다. PVS 세척액에서 조심스럽게 꺼내어, 심장 쪽이 아래로 향하게 하여 세 번째 커버 슬립 위 마운팅 매질 방울 위에 살며시 놓습니다. 이때 커버 슬립의 방울 하나당 심장은 5개까지만 배치합니다.커버 슬립 위의 액적에 심장을 놓은 후, 현미경으로 관찰하여 모든 심장이 아래를 향하고 있는지 확인하십시오. 이제 심장이 놓인 커버 슬립을 조심스럽게 뒤집어 슬라이드 위에 빠르게 올려놓습니다. 이때 뒤집힌 커버 슬립의 심장관 액적이 커버 슬립 사이 공간에 놓인 벡터 쉴드 액적과 융합되도록 두 커버 슬립을 고정하십시오. 이런 방식으로 짝을 맞추면, 세 개의 커버 슬립이 다리 형태를 이루게 됩니다.심장은 중간 커버슬립과 현미경 사이에 고정됩니다. 브리지 아래로 슬라이드를 밀어 넣고 현미경으로 관찰하여, 매니큐어를 사용해 고정한 성체 초파리 심장이 위를 향하고 있는지 확인하십시오. 커버슬립의 가장자리를 고정합니다.이제 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 통해 심장을 촬영할 준비가 되었습니다. 유충의 심장을 고정하려면, 미세 핀셋을 사용하여 현미경 슬라이드 위에 약 20 µL의 BTA shield 한 방울을 떨어뜨립니다. 큐티클 가장자리 부분을 잡아 유충을 해당 방울 속으로 조심스럽게 옮깁니다.텅스텐 바늘을 사용하여 유충의 등 쪽이 아래로 향하도록 배치합니다. 슬라이드 한 장당 최대 2마리의 유충을 올립니다. 그다음, 각 표본을 마운팅 매질 밖으로 끌어내어 유충들을 평행하게 정렬합니다.핀셋을 사용하여 정렬된 심장의 양쪽에 커버슬립을 각각 놓습니다. 세 번째 커버슬립의 한쪽 끝을 앞쪽 커버슬립 위에 올린 다음 뒤쪽 커버슬립 방향으로 내려놓아 상단에 배치합니다. 이렇게 하여 브릿지 형태를 만듭니다.모세관력에 의해 vector shield가 뒤에서 앞으로 흐르게 되며, 이는 유충 심장의 적절한 정렬을 돕습니다. 마지막으로, 모든 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 고정하고, 커버슬립 사이의 공간을 20 to 30 µL의 vector shield로 조심스럽게 채운 뒤 매니큐어로 밀봉합니다. 단기 보관 시에는 4 °C에서, 장기 보관 시에는 -20 °C에서 보관하십시오. 올바르게 수행되었다면, dorsal vessel의 모든 구성 요소와 관련 조직이 손상되지 않은 상태로 유지되어 쉽게 관찰될 것입니다.성체의 경우 배경 형광은 최소화되어야 합니다. 복측 종적 근육층은 염색이 매우 잘 되어 상당한 신호를 생성합니다. 하지만 그 아래의 환상 심근세포는 상단의 복측 층에서 나오는 것만큼 강한 신호를 생성하지 않는 경향이 있습니다.성체 심장의 전방 원추형 챔버(anterior conical chamber)의 근세포는 상당량의 수축 물질을 포함하고 있으며, 결과적으로 이 영역은 심장관의 나머지 부분에 비해 가장 튼튼하게 나타납니다. 유생 심장 영상은 나선형의 근섬유 배열을 보여줍니다. 성체의 수축성 심근세포와 마찬가지로, 형광 및 공초점 현미경 관찰을 위한 난형 심장 준비 및 염색 프로토콜을 방금 보여드렸습니다.본 절차를 수행할 때 불필요한 조작을 최소화하는 것이 중요합니다. 이는 심장 구조를 더욱 온전하게 보존하고 유지하는 데 도움이 됩니다. 본 프로토콜은 기초 지침으로만 활용하십시오.다른 면역조직화학 염색과 마찬가지로, 항체마다 서로 다른 조건이 필요하며 개별적인 최적화 과정이 필요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 염색 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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