분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

해당 시스템은 분할 유비퀴틴(split ubiquitin) 개념을 기반으로 하며, 이는 유비퀴틴이 N-말단 UBI와 C-말단 CUB의 두 부분으로 안정적으로 분리되었다가 다시 결합하여 전체 길이의 유사 유비퀴틴(pseudo ubiquitin) 분자로 재구성될 수 있는 능력을 의미합니다. 야생형 NUB를 사용할 때는 이러한 재구성이 자발적으로 일어나지만, 아이소루신 13을 글리신으로 치환하는 돌연변이를 도입하여 NUBG라는 단편을 생성하면 CUB에 대한 친화력이 크게 감소하여 유사 유비퀴틴 형성이 차단됩니다. 만약 NUBG와 CUB가 각각 단백질 A와 단백질 B에 융합되어 있고 A와 B가 상호작용할 수 있다면, 유사 유비퀴틴 분자가 다시 형성될 수 있습니다.

미끼(bait)로 쓰이는 통합 막 단백질은 인공 전사 인자와 연결된 CUB 단백질 조각으로 구성된 태그와 융합됩니다. 한편, 먹이(prey) 단백질은 NUBG 단백질 조각과 융합되며, 미끼와 먹이 사이의 상호작용은 의사-유비퀴틴(pseudo ubiquitin)의 재구성을 유도합니다. 이렇게 재구성된 유비퀴틴은 가위 모양으로 묘사된 세포질 내 탈유비퀴틴화 효소에 의해 인식될 수 있습니다. 이 효소들은 CUB의 C-말단 뒤를 절단하여 전사 인자를 방출하며, 방출된 전사 인자는 핵 내로 진입하여 리포터 시스템을 활성화함으로써 미끼-먹이 상호작용이 일어난 세포를 선택적으로 분리하고 식별할 수 있게 합니다.

안녕하세요, 저는 토론토 대학교 분자 유전학 및 생화학과의 Igor STAARs 연구실 소속 Janie Snyder입니다. 오늘은 막 단백질 이중 하이브리드(membrane use two hybrid 또는 M2H) 절차를 보여드리고자 합니다. 저희 연구실에서는 적분 막 단백질의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

Myth 분석을 수행하기 전에, 미끼 단백질의 N-말단 또는 C-말단이 세포의 세포질에 위치하는지 확인하십시오. CUB Lex A VP 16 태그는 해당 말단에 단백질과 융합되어 있어야 합니다. 전사 인자의 방출에 필요한 탈유비퀴틴화 효소들이 세포질에 위치하므로, 미끼 단백질의 위상(topology)을 알 수 없는 경우에는 N-말단과 C-말단 모두에 태그가 붙은 제작물을 생성하고, 곧 설명될 N-U-B-G-I 대조군 테스트를 사용하여 두 가지 중 Myth 사용에 적합한 것이 있는지 확인하여 특정 말단이 세포질에 있음을 나타낼 수 있습니다.

다음으로, 두 가지 주요 myth 변형 중 실험에 적합한 것을 결정하십시오. 천연 효모 단백질의 경우, 통합형 myth 또는 immy 방식이 적절한 선택입니다. Imy 방식에서는 단백질이 내생적으로 CUB Lex a VP 16 태그로 표지되어, 기존의 천연 프로모터 제어 하에 유지됩니다.

Bates의 야생형 발현 수준은 비고유 효모 단백질에 대한 위양성 사례 증가와 같은 단백질 과발현과 관련된 문제들을 해결하는 데 도움이 되므로 유리합니다. 전통적인 myth 또는 T myth가 사용될 수 있는데, 이 경우 CU B Lex A V VP 16 태그 베이트(bait)가 플라스미드로부터 국소적으로 과발현됩니다. 본 프로토콜에서는 T myth 형태가 더 널리 적용 가능하므로 이에 집중하겠습니다. 초기 베이트 제작과 사용되는 배지를 제외하면, 두 형태의 myth는 기본적으로 동일한 방식으로 수행됩니다. 베이트는 태깅 및 발현을 위해 적절한 벡터에 클로닝되어야 합니다.

현재 BV4, pABV4, PCM BV4와 같은 다양한 T myth 벡터를 사용할 수 있으며, 이를 통해 각각 매우 강력한 TF1, 강력한 ADH1 및 약한 CYC1 프로모터의 제어 하에 C-말단 태그가 부착된 Bait-Cub Lexie, VP16을 구축할 수 있습니다. 팀 이펙터가 선택되면, 적절한 제한 효소 부위에서 플라스미드를 제한 효소로 절단합니다. 절단은 C-말단 태깅의 경우 태그 상류의 CUB Lxe VP16 태그 바로 인근에서, N-말단 태깅의 경우 하류에서만 이루어져야 합니다.

예를 들어, PAM BV 벡터를 사용할 때 SFI one이 이상적인 선택입니다. 플라스미드를 제한효소로 절단하고 사용 전까지 -20 °C에서 보관한 후, 다음 단계로 관심 유전자의 증폭 및 클로닝을 위한 프라이머를 설계합니다. 정방향 프라이머의 5' 말단은 제한효소 부위의 상류 약 35~40 뉴클레오타이드와 일치해야 합니다. 반면 3' 말단은 beta 2 및 generic receptor를 인코딩하는 DRB two인 표적 유전자의 처음 18~20 뉴클레오타이드와 일치해야 합니다.

본 예시에서, 리버스 프라이머의 5' 말단은 제한 효소 부위 하류의 약 35~40 뉴클레오타이드에 해당하는 역상보 서열과 일치해야 합니다. 3' 말단은 표적 유전자의 마지막 18~20 뉴클레오타이드의 역상보 서열과 일치해야 하며, 예시와 같이 CUB Lex, VP16 태그가 C-말단에 배치되는 경우에는 종결 코돈을 제외해야 합니다. N-말단 또는 C-말단 태깅 여부에 따라, 포워드 또는 리버스 프라이머에 사용되는 플라스미드 서열의 선택된 35~40 뉴클레오타이드가 표적 유전자를 CUB Lex, VP16 태그와 동일한 프레임으로 클로닝하도록 보장하십시오. 본 예시에서는 A DRB 2 단백질의 C-말단에 태깅을 수행합니다.

A MBV 서열의 역방향 프라이머 내 35개 염기 서열은 A DRB 2 및 CUB 유전자 서열이 동일한 읽기 틀(reading frame) 내에 위치하도록 선택되었으며, 선택한 프라이머를 이용해 PCR로 목적 유전자를 증폭합니다. PCR 매개변수는 갭 복구 상동 재조합(gap repair homologous recombination)이 일어날 수 있는 환경을 제공하기 위해 사용된 특정 효소와 특이적 프라이머에 따라 달라집니다. 이전에 소화시킨 플라스미드와 증폭된 목적 유전자를 Geets와 Woods가 설명한 것과 같은 표준 효모 형질전환 프로토콜을 사용하여 적절한 효모 균주에 형질전환합니다.

형질전환된 효모가 플레이트에서 성장하면, 해당 균주의 단일 콜로니를 선택하여 5 mL의 SD-leucine 배지에 접종합니다. 액체 배지를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 충분히 성장하고 포화 상태에 도달하게 합니다. 세포를 700 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 상용 미니 프렙 키트를 사용하여 세포 펠릿으로부터 베이트 플라스미드 DNA를 분리합니다.

초기 재현탁 후 펠렛에 0.5 millimolar 소다 라임 유리 비드를 첨가하여 소량의 부피에서도 충분한 효모 세포 용해가 이루어지도록 한 가지 수정 사항을 적용한 표준 프로토콜을 따르십시오. 그런 다음 5분 동안 격렬하게 볼텍싱합니다. 이후 일반적인 상용 프로토콜대로 진행하십시오. 분리된 효모 DNA를 microgram DNA당 최소 1 × 10⁷ cells의 형질전환 효율을 가진, 플라스미드 증식에 적합한 화학적 컴피턴트 E. coli 균주로 형질전환하십시오.

형질전환된 e coli로부터 플라스미드 DNA를 회수한 후, 사용 전에 시퀀싱을 통해 베이트 플라스미드가 올바르게 구축되었는지 확인하십시오. 베이트 단백질이 효모 막에 적절히 위치하는지 확인하기 위해 베이트 균주를 분석해야 합니다. 위치 확인은 형광 현미경을 사용하여 결정합니다. 베이트 태그 서열에 YFP 분자를 포함하면 살아있는 세포를 직접 시각화할 수 있으며, 이는 imy에서 흔히 사용됩니다.

대안적으로, 미끼 단백질의 적절한 국소화가 확인된 후에는 태그의 Lex A 또는 VP 16 성분에 대한 항체를 이용한 표준 면역형광법을 사용할 수 있습니다. 미끼 단백질이 자체 활성화되지 않음을 확인하는 것이 필수적입니다. 즉, 미끼 단백질이 단독으로 또는 상호작용하지 않는 먹이 단백질과 함께 있을 때 리포터 시스템을 활성화하지 않아야 합니다. 미끼 단백질의 자체 활성화 여부를 확인하기 위해 N-U-B-G-I 테스트를 실시합니다. 이 테스트에서는

베이트(bait)를 상호작용하는 양성 대조군 프레이(prey)와 상호작용하지 않는 음성 대조군 프레이로 형질전환한 후, 각 형질전환체의 다양한 희석액을 적절한 선택 배지에 스팟팅합니다. 베이트가 이스트 투 하이브리드(yeast two-hybrid) 분석에 사용되기에 적합하려면, 양성 대조군이 있을 때는 선택 배지에서 성장해야 하며, 음성 대조군이 있을 때는 성장하지 않아야 합니다. 베이트가 검증되면, 베이트를 포함하는 이스트 투 하이브리드 리포터 균주를 관심 있는 프레이 라이브러리로 형질전환하여 단백질-단백질 상호작용을 스크리닝할 수 있습니다.

이 대규모 효모 형질전환을 시작하기 위해, 미끼(bait)가 포함된 MYT 리포터 균주의 단일 콜로니를 5 mL의 SD minus leucine 배지에 접종하고 30 °C에서 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 배양액을 200 mL의 SD minus leucine 배지에 희석하고, OD 600이 0.6에서 0.7에 도달할 때까지 30 °C에서 진탕 배양합니다. 목표 OD 600에 도달하면, 200 mL 배양액을 4개의 50 mL 스크류 캡 원심분리 튜브에 나누어 담고 원심분리를 통해 세포를 수확합니다.

멸균된 2차 증류수와 lithium acetate trissy DTA 용액으로 펠렛을 세척한 후, 각 펠렛을 600 µL의 lithium acetate trissy DTA 용액에 현탁하여 4개의 15 mL 스크류 원심분리 튜브에 각각 나누어 담습니다. 600 µL의 재현탁된 세포에 2.5 mL의 PEG lithium acetate 용액, 100 µL의 연어 정자 DNA 용액 및 7 µg의 prey library DNA를 추가합니다. 튜브를 1분 동안 섞어 완전히 혼합되도록 한 다음, 30 °C 항온수조에서 45분 동안 배양합니다.

45분간의 배양 후 15분마다 짧게 혼합합니다. 각 튜브에 160 µL의 dimethyl sulfoxide 또는 DMSO를 첨가하고 튜브를 반전시켜 즉시 혼합합니다. 42 °C 항온수조에서 20분 동안 배양합니다.

열 충격 과정이 완료되면, 원심분리를 통해 세포를 수집하고 재현탁합니다. 각 펠렛을 3 mL의 2X YPD에 현탁합니다. 모든 샘플을 하나의 50 mL 스크류 캡 원심분리 튜브에 모읍니다.

세포 회복을 위해 세포를 30 °C에서 90분 동안 배양합니다. 세포를 원심 분리하고, 재현탁된 세포 100 µL를 사용하여 세포 펠릿을 멸균된 0.9% sodium chloride 4.9 mL에 재현탁합니다. 멸균된 0.9% sodium chloride로 10배 연속 희석을 수행하여 10배에서 10,000배까지 희석하고, 100배 및 1,000배 희석액 100 µL를 선택 배지에 도말한 후 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다.

이 플레이트들은 대조군 역할을 하며, 형질전환 효율을 동일하게 계산하는 데 사용됩니다. 남은 4.8 mL의 재현탁된 세포를 150 mm 대형 플레이트에 분주하고 30 °C에서 3~4일 동안 배양합니다. 콜로니가 성장하면 상호작용 가능성이 있는 bait-prey 쌍을 포함하는 세포를 나타내는 단일 콜로니들을 각각 100 µL의 0.9% 염화나트륨에 재현탁하고, 5 µL씩 분주하여 XG가 포함된 선택 배지에서 2~4일 동안만 배양합니다.

강력한 성장과 푸른색을 나타내는 콜로니를 선택하여 추가 분석을 진행합니다. 양성 효모 콜로니에서 플라스미드를 분리하고 서열 분석을 수행한 후, 모든 서열 데이터를 수집 및 분석하여 상호작용체(interactor)의 예비 목록을 작성합니다. 이러한 상호작용을 재확인하기 위해 베이트 의존성 테스트(bait dependency test)를 실시합니다.

본 테스트에서는 확인된 상호작용 단백질을 발현하는 모든 prey 플라스미드를 원래의 bait 균주뿐만 아니라, CUB Lex에 융합된 단일 transmembrane domain과 VP 16 태그로 구성된 대조군 artificial bait를 보유한 균주로 다시 형질전환합니다. 이러한 형질전환을 통해 얻은 단일 콜로니를 100 µL의 멸균 2중 증류수에 다시 현탁하고, 적절한 선택 배지 및 X sc 위에 5 µL씩 스폿팅합니다. 이상적으로는 각 prey에 대해 여러 개의 형질전환체를 선택해야 하며, 원래의 bait와 artificial bait를 동일한 플레이트에 함께 스폿팅해야 합니다. 플레이트를 30 °C에서 2~4일 동안 배양합니다. artificial bait를 보유한 효모에서 리포터 시스템의 활성화를 유도하는 prey는 비특이적(promiscuous)인 것으로 간주하며, 해당 특정 prey는 상호작용 단백질 목록에서 제외합니다.

관심 대상인 미끼(bait)가 포함된 효모에서는 성장과 푸른색 발색이 나타나지만, 인공 미끼(artificial bait)에서는 나타나지 않는지 확인하십시오. 이를 통해 특이적 상호작용을 확인합니다. 반면, 먹이(prey)와 관심 대상인 미끼를 보유한 효모가 성장하지 않는 경우를 확인하십시오.

이 먹잇감은 상호작용체 목록에서 제거됩니다. 남은 먹잇감들이 myth 스크리닝에서 확인된 상호작용체의 전체 목록을 구성합니다. myth 절차를 완료하면 상호작용체 맵을 얻게 됩니다.

이는 연구자가 사례별로 결정된 특정 연구를 통해 추가로 분석해야 하는 후보 상호작용들의 집합을 나타냅니다. 각각의 생물학적 유의성을 평가하기 위해, 관심 단백질의 상호작용 파트너를 식별하는 막 E2 하이브리드 또는 myth 절차의 수행 방법을 앞서 보여드렸습니다. myth 절차를 수행할 때는 관심 단백질의 N-말단 또는 C-말단이 세포의 세포질(cyto)에 위치하는지 확인하고, 이에 따라 태깅 전략을 설계하는 것이 중요합니다.

또한, 미끼 균주가 미끼를 적절히 발현하고 미끼가 정확한 위치에 국소화되었는지 주의 깊게 평가하는 것이 중요합니다. 아울러, 스크리닝 조건을 설정하는 데 유용한 NUB GI 대조군 테스트를 수행하는 것이 중요합니다. 마지막으로, myth를 사용하여 검출한 모든 상호작용을 독립적으로 검증하십시오.

다음의 간단한 단계들을 따르면 myth 프로시저에서 최선의 결과를 얻을 수 있을 것입니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.