Name: 포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 학습하세요 포유 동물 세포에서 N-연결 당단백질의 설탕 사슬 변화를 추적하는 펄스 체이스 분석법을. HPLC와 방사성 표지를 활용한 이 방법은 당생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 기술 지원 Zehavit Frenkel와 산드라 Tolchinsky 감사드립니다. 이 작품은 관련 연구는 이스라엘 과학 재단 (1229년에서 1207년까지)과 독일 - 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP - DFG)에서 기금에 의해 지원됩니다.

다음 프로토콜은 총 glycoproteins이나 관심의 특정 당단백질의 설탕 체인 분석위한 것입니다. 프로 시저는 기본적으로 프로토콜을 통해 언급한 몇 가지 변경 사항과 함께 두 경우 모두에 대해 동일합니다. <ol><li> N - 연결 glycans의 대사 라벨링을 위해 각 샘플에 대해 90mm 접시에 밤새 자란 포유 동물 세포의 subconfluent 문화를 사용하는 한 요구 (샘플 서로 다른 시간 지점이나 트리 트먼트를 나타내는 수 있습니다.) 이 프로토콜은 NIH 3T3 세포에 최적화되어 있습니다. </li><li> 10% dialyzed FCS와 5-15분 4 MM 나트륨 pyruvate와 함께 제공된 신선한 사전 예열 (37 ° C) 포도당없는 매체, 5 ML에서 부화하여 포도당에 대한 세포를 굶어. </li><li> 사전 예열 1 ML과 기아 매체를 교체 (37 ° C) 포도당 무료 400 μCi가 포함된 매체 [2 - 3 H] (낮은 65 농도 μCi / ML은 총 glycoproteins의 라벨에 사용됩니다) mannose - 라벨, 1 시간 동안 정상적인 조직 문화 조건에서 세포를 품어. </li><li> 각 샘플의 라벨 미디어를 제거하고, 신중하게 4 PBS 2 ML을 추가 ° 추적에 해당하는 샘플을 필요로하는 동안 맥박과 얼음 (이 샘플 펄스라고도합니다) 그들을 장소에 해당하는 샘플을 C, 2 ML 3 번 씻어서 미리 예열 (37 ° C) 정상 완료 배지, 그리고 37 CO 2 배양기에 배치 ° C 원하는 추적 기간 동안 미리 예열 정규 매체의 5 ML과 함께. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS 2 ML과 펄스 샘플 (이전 얼음에 위치) 3 번 린스. 세포는 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 두 ML PBS에서 요리를 긁어 냈어요, 그리고 2 ML Eppendorf 튜브에 배치됩니다. </li><li> 16000Xg (60-10 초)에있는 세포 단기 스핀, 표면에 뜨는를 버리고 -80에서 세포 펠릿 ° C.를 동결 </li><li> 단계 5 체이스 시간의 끝에 추적 샘플에도 6 수행합니다. </li><li> 냉동실에서 세포를 제거하고 버퍼 300 μl를 추가하여 그들을 lyse은 잠시을 vortexing하고 부화하여 버퍼 B와 함께 얼음에 20 분 얼음 20 분 잠복기, 또는 총 glycoproteins 분석의 경우, sonication 다음 (4 회, 10 초, 최대 진폭), 다음 5 분에 대한 샘플을 끓여. </li><li> 4 ° C. 20 분 16000Xg에서 lysates을 원심 분리기 새로운 Eppendorf 튜브에 뜨는을 전송하여 펠렛을 삭제. </li><li> 총 glycoproteins를 분석하면, 분자 여과 및 deglycosylation (단계 17)로 진행합니다. H2a의 당단백질의 immunoprecipitation 여기 시연에 대한 (우리의 예를 들어 안티 H2a 항체에 (Repligen) 단백질 A - 아가로 오스 비즈 1시 1분 정지하고 원하는 당단백질를위한 토끼 polyclonal 방지 H2a 항체 3 μl / 샘플 20l/sample을 추가 ), 9 단계에서 뜨는 있습니다. </li><li> 지속적으로 속도가 느린 회전에 의해 혼합, 4 ° C에서 4-16시간에 대한 샘플을 품어. </li><li> 30 초 동안 16000Xg에서 비즈를 스핀 다운, 그리고 신중하게 뜨는 사용하여 진공을 제거합니다. </li><li> 500 μl 버퍼 D를 추가하고 vortexing하여 구슬을 씻어. 12 단계에서와 같이 회전하여 표면에 뜨는를 제거합니다. 세차 3 회 반복합니다. </li><li> 비드 펠렛에 10μl denaturing 버퍼 (코 엔도 - H 키트와 함께 제공되는) 추가하고 5 분 (총 단백질을 분석하는 경우, deglycosylation가 Microcon 필터 단계 17을 수행합니다)에 대한 샘플을 끓여. </li><li> (30 초 동안 16000Xg) 비즈를 스핀 다운, 새로운 Eppendorf 튜브에 뜨는를 전송합니다. 다음 엔도 H 효소의 0.5μl는 반응 버퍼 (도 코 엔도 H 키트와 함께 제공) 10 μl와 함께 각각의 샘플에 추가되며, 샘플은 3 시간 동안 ° C 37 incubated 수 있습니다. </li><li> 단백질에서 릴리스된 glycans을 분리하려면 샘플은 다음 3 분 14000Xg에 centrifuged, 컷 - 오프 30kDa와 탈이온수 5 번 희석 및 분자 필터 (Microcon Ultracel YM30)의 상단에 위치합니다. 탈이온수 및 샘플 반복 원심 분리의 50μl을 적용합니다. 이 워시 아웃은 흐름을 통해 유지, 2 번 더 반복합니다. </li><li> 당신이 총 glycoproteins을 분석하는 경우 Microcon 필터에 lysates의 뜨는을 (9 단계에서) 적용됩니다. 3 분위한 14000Xg에서 반복 원심 분리하여 3 번 버퍼 E, 100 μl로 추출 씻으십시오. 10X 엔도 H 반응 버퍼 3 μl와 Microcon retentate에 엔도 H 효소 1.5 μl를 추가하고, 37 3 시간 동안 품어 ° C. 공개 glycans는 단계 16로 3 반복 centrifugations의 탈이온수와 eluted 있습니다. </li><li> 원하는 경우, 엔도 H 방지 glycoproteins를 포함하는 단계를 16 17 retentates은 다음 37, 버퍼 C 15 μl에 N - glycosidase F 조의 200mU와 incubated 아르 ° C를 16 H.위한 탈이온수과 용출은 단계 16로 이루어집니다. </li><li> Speed​​Vac 농축기에서 엔도 H 반응 흐름을 통해이 (단계 16 17)가 들어있는 튜브를 배치그리고 완전히 샘플을 건조 (이것은 45까지 할 수있는 ° C는이 과정을 가속). </li><li> HPLC에 대한 샘플을 준비하려면, HPLC 용매 (물, 60:40, 1 %의 인산 acetonitrile) 12 μl의 건조 알약을 resuspend. </li><li> 상수 용매의 흐름 (1 ML / 분)와 압력 (1000 2000 PSI 사이의 특정 값)으로 HPLC 장치 (Spherisorb 열 연결되어 있음) 조정 및 튜브 매 1 분 변경 분획 수집기를 놓으십시오. </li><li> HPLC 장치에 샘플을로드하고 동시에 분획 수집기를 시작합니다. </li><li> 각 샘플에서 실행하고 표준 올리 고당 혼합물의 실행에서 1 ML 48 분수를 수집합니다. </li><li> 각 분획에서 섬광 약병 500 μl를 전송하고, 물 miscible 섬광 유체 3 ML과 내용을 섞는다. </li><li> 튜브를로드하고 신틸레이션 계수기에 참조하십시오. </li><li> 노출당 비용 (CPM) 판독이 분수 번호 기능으로 꾸몄다 있습니다. </li><li> 최대 노출당 비용 (CPM) 내의 값은 다음과 같이 특정 glycan 종의 대표 : 분수를 18-21도 M8, M9에 분수 36-39에 M5, M6 분수 22-26로, 분수를 27-31로 M7, 분수 32-35에 해당하는 분수 G2M9에 40-42로 G1M9과 분수 43-45. </li><li> 각 피크 내에서 분수에 대한 노출당 비용 (CPM) 값의 합계는 특정 glycan 종의 절대 금액을 반영합니다. 각 glycan 종의 절대 금액이 포함된 mannose 잔류물의 숫자로 나누어 자세한 mannose 잔류물을 포함하는 종 더 레이블, 다음과 같이 계산되는 각 glycan 종의 "상대적 어금니 금액"을 획득했다는 사실에 대해 보상하기 위해서는 . 이 값은 다음 각 특정 glycan 종에 대해 "전체의 %를 '얻기 위해 얻은 모든 glycan 수종의 상대 어금니 금액의 합계로 나눈 것입니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> 체이스 (H) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> 엔도 H (CPM)과 함께 출시 </td><td> 90,000 </td><td> 16,800 </td></tr><tr><td> N - glycosidase F (CPM)와 B 출시 </td><td> 20,400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> retentate (CPM) C에서 Glycoproteins </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> retentate (CPM) D에 Dolichol - oligosaccharides </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> retentate에 Dolichol - oligosaccharides (%) E </td><td> 1.4 ± 0.7 </td><td> 0.2 ± 0.2 </td></tr></tbody></table> 표 1. deglycosidases과 당단백질 샘플에 dolichol - oligosaccharides의 존재의 N - 연결 설탕 체인 릴리스의 분석. 우리는 NIH 3T3 세포에서 lysate로 펄스 체이스 절차를 적용. Microcon 여과 후, 표시된 N - 연결 oligosaccharides는 펄스 라벨 (높은 mannose 타입) 후 복잡한 유형 (잠돌군 Zz - 처리 glycans)에 해당하는 것입니다 추격전이 기간이 지나면 N - glycosidase F 조로 추가 치료와 엔도 H 주로 출시되었습니다 엔도 H 저항 oligosaccharides. 이것은 정량 분석​​ dolichol - oligosaccharides가 초기 retentate에서 라벨의 사소한 분율 차지하는 사실을 확인했습니다. 참고 : <ol class="lalpha"><li> NIH 3T3 세포는 펄스는 [2-3 H]와 라벨이 붙지만 mannose하고 완전한 매체로 추격. Microcon YM30을 통해 세포 용해 및 여과 후, 높은 mannose oligosaccharides N - 연결은 엔도 H.와 부화하여 retentates에서 출시되었습니다 </li><li> (A)에서 Microcon의 retentates에서 엔도 H - 모성 자료는 다음 N - glycosidase F 조와 incubated 및 신틸레이션 계수기로 측정 oligosaccharides를 발표했다. </li><li> 메탄올 : 전구체 glycolipids를 제거하는 물 10시 10분 3초하고, 1N NaOH의 solubilized 및 섬광 카운터에서 계산 unextracted 소재 Microcon의 retentates는 (a) 엔도 H 처리하기 전에, 클로로포름과 4 번 추출되었다 같이 취득. </li><li> Dolichol - oligosaccharides은 (C)로 1에서 설명하고 섬광 카운터에서 계산에서 추출에서 정화했다. </li><li> retentate 총 노출당 비용 (CPM)의 dolichol - oligosaccharides (D) 비율 3 실험의 평균 (C + D). </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 치료 세포에서 proteasomal 억제에 총 NIH 3T3 glycoproteins의 펄스 체이스 분석 1 시간 후와 펄스 라벨. [2-3 H] 우리는 glucosylated과 예상 프로파일을 획득엽 성의 전구 물질은 (Glc 두 남자 9 GlcNAc 2 (G2M9)와 G1M9) 남아 있지만, M9에있는 라벨 및 M8 종의 대부분은, 후자는 모든 포도당의 트리밍 한 mannose 잔류물 (그림 1)의 결과를 모셨습니다. 아무도 무료로 mannose 또는 기타 작은 엽 성의 전구 물질은 정화의 철저에 증명, 발견되지 않았습니다. 다소 긴 8h 체이스 다음이 M7 - 6와 M5의 작은 금액 트리밍 더 광범위한했지만, 주요 수종은 M9와 M8 (그림 1 B)로 계속했다. 추적이 proteasomal 억제제 (30 μm의 MG - 132)의 존재로 이루어졌다면, 다음과 같은 손질 종의 사소한 축적 (그림 1 C)은 오직가 발생했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. ERAD 기판의 설탕 체인의 정량 분석 총 glycoproteins에 비해. (A) 그림 1에있는 것과 유사한 실험에서, 각 올리 고당 종 상대 어금니 금액은 mannose 콘텐츠를 기반으로 계산했다. 우리는 각 glycan 종족에 대한 얻은 CPM 값을 변환, 모든 종류의 현재의 상대 어금니 금액의 총 합계를 기준으로 각 종족의 %가 후 두 실험의 평균 추적 시간의 함수로 꾸몄다되었습니다. (B)과 유사 을 (A) ERAD 기판 ASGPR H2a에서 공개 glycans를 제외하고 분석 나서 앞에서 4h 추적에 대한 proteasomal 억제제 MG - 132의 존재 또는 부재에 4h까지에 대한 펄스 상표와 체이스가. (C) 값 에서 MG - 132의 (A)와 (B) ASGPR H2a 및 당단백질 수영장에 대한 비교됩니다. 응급실에서 프로세스를 트리밍 N - 연결 설탕 체인 (D) 제도. 이들에 대한 M9 - 8에 비해 ERAD를 타겟으로하는 단백질 (R) 그 잠돌군 Zz와 근교로 종료합니다. 연결된 M6 - 5로 이어질 설탕 트리밍 처리 결과는 ERAD 프로세스 mannose 남은 5-6 mannose 잔류물과 종족을 항복하기 위해 N - glycans의 트리밍과 관련된 것으로 나타났습니다.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

HPLC 분리 살 세포의 glycans의 펄스 체이스 분석 당단백질의 생활 전반에 걸쳐 올리 고당 구조 변경의 역학을 연구하는 방법을 제공합니다. 이러한 변경은 ER의 접이식, 품질 관리 및 인신 매매 시스템 2-5에 대한 신호를 생산에 관여하는 성장 증거가있다. 방법뿐만 아니라 관심의 특정 당단백질뿐만 아니라 우리가 대조 특정 ERAD 기판의 운명과 세포 당단백질 수영장의 비교이 문서에 설명된 총 glycoproteins, 구조의 역학을 분석하는 데 적용할 수 있습니다 . 정화 기술은 간단하지만, 그럼에도 불구하고 구체적인 것입니다. 이러한 O - 연결된 설탕 체인 및 GPI - 정박 단백질로 인간 - 엄격한 deglycosidases와 분자 여과를 사용하여 그것은 [3 H 2]로 표시된 다른 macromolecules 남겨두고, glycoproteins에서 출시만을 N - 연결 glycans를 얻을 것을 보장합니다. dolichol 전구체에서 발표 Oligosaccharides은 무시...

<table><tbody><tr><td>600E 다중 용매 공급 시스템 컨트롤러</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>아세토나이트릴 LiChrosolv (액체 크로마토그래피용 그래디언트 등급)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K 또는 Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 또는 4208</td><td></td></tr><tr><td>농축기 5301, 48 x 1.5 / 2.0 ml 고정각 로터 포함</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>투석된 F&amp;#8211;태아 송아지 혈청</td><td>바이오 산업</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;수정 이블(Modified Eagle)&amp;rsquo;배지</td><td>Life Technologies의 GIBCO</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;수정 이글(Modified Eagle)&amp;rsquo;배지 - 포도당 무첨가</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;인산완충생리식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 이나트륨염(Titriplex Iii)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>생물 산업</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Frac-100 분획 수집기</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 액체 섬광 계수 시스템</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>만노스, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (비방사능: 15-30Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-카보벤조실-류시닐-류시닐-류시날 (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-글리코시다아제 F (1000 units/ml)</td><td>로슈 그룹(Roche Group)</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-옥틸글루코사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 세포</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>옵티-플라워(Opti-Flour)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>인산 용액 (49-51%, HPLC용)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Sepharose 비드</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>토끼 폴리클론성 anti-H2 카복시 말단 항체 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>데옥시콜산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨 용액 (100mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spherisorb NH2 컬럼, 5 $\mu\text{m}$ &amp;mu;m, 4.6 x 250 mm</td><td>Waters</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-Cell 초음파 처리기 VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;강력한&gt;버퍼 A:&lt;/strong&gt; PBS 내 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 2% v/v Protease inhibitor cocktail</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;강력한&gt;완충액 B:&lt;/strong&gt; 0.5% w/v SDS, PBS 내 2% v/v 프로테아제 억제제 칵테일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;강력한&gt;버퍼 C:&lt;/strong&gt; N-glycosidase F 반응 완충액: 200mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2a를 안정적으로 발현하는 NIH 3T3 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;강력한&gt;완충액 D:&lt;/strong&gt; 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v 데옥시콜산나트륨, 0.5% w/v SDS, PBS 내 2% v/v 프로테아제 억제제 칵테일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;강력한&gt;완충액 E:&lt;/strong&gt; 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol&amp;#8211;에탄올, PBS 내 2% v/v 프로테아제 억제제 칵테일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-머캅토&amp;#8211;에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

포유 동물 세포에 glycoproteins의 n - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Glc의 첨부 파일<sub&gt; 3</sub&gt; 맨<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub응급실에서 초기 polypeptides에 올리 고당&gt; 전구체는 분비 단백질에 대한 일반적인 수정입니다. 이 수정은 여러 생물 학적 과정에 연루되었지만, 그 기능의 추가 측면 당단백질 품질 제어 및 인신 매매에 대한 신호의 생산에의 역할 최근 증거로, 신흥 있습니다. 따라서, N - glycans 연결 및 처리에 관한 현상을 집중적으로 조사되고있다. 최근 proteomic 분석을 위해 개발되었습니다 방법은 크게 당단백질 N - glycans 연결의 특성을 향상했습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 관련 설탕 체인 처리의 역학에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 이를 위해, 라벨링 및 펄스 - 체이스 분석 프로토콜은 일반적으로 복잡하며 매우 낮은 수율을주는 데 사용됩니다. 우리는 여기서 metabolically 표시된 N - 연결 oligosaccharides의 분리 및 분석을위한 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 [2 세포의 라벨을 기반으로 -<sup&gt; 3</sup&gt; H 관심 중 하나를 구체적으로 immunoprecipitated 단백질이나 분자 여과 (Amicon) 다음 엔도 H와 N - glycosidase F와 순차 요법에 의해 일반 당단백질 수영장에서] mannose, denaturing 용해와 oligosaccharides의 효소 놓습니다. 이 방법에서는 고립 oligosaccharides은 단일 monosaccharide의 해상도와 함께, 그들로 구성된 monosaccharide 단위의 숫자에 따라 다양한 glycan 구조 사이의 차별을 허용 HPLC 분석에 대한 입력으로 제공하고 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 정상적인 조건에서 펄스 ​​체이스 후 proteasome 억제에 따라 총 세포 glycoproteins 높은 mannose N - 연결 올리 고당 프로파일을 공부할 수 있었다. 이 프로파일은 immunoprecipitated ER - 관련 저하 (ERAD) 기판에서 얻은 것과 비교했다. 우리의 결과는 대부분의 NIH 3T3 세포 glycoproteins은 비교적 안정되는 그들 oligosaccharides의 대부분이 인간의 손질하는 것이 좋습니다<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. 반면, 불안 정한 ERAD 기판은 인간을 손질 아르<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub이 종 베어링&gt;을 glycoproteins은 proteasomal 저하의 억제에 축적.

우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N - 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

소포체(ER) 내에서 nascent 폴리펩타이드에 Glc3Man9GlcNAc2 전구체 올리고당이 부착되는 것은 분비 단백질의 일반적인 수식 과정입니다. 비록...

당단백질의 비결합성 당쇄 분석은 삼중수소 표지 마노스(tritiated mannose)를 사용하여 글리칸과 세포를 표지하는 것으로 시작합니다. 펄스 접시는 얼음 위에서 냉각시키고, 체이스 접시는 원하는 체이스 기간 동안 표지제 없이 배양합니다. 다음으로, 샘플을 용해하고 목적 당단백질을 면역 정제하여 변성시킨 후, 효소를 이용해 글리칸을 분리합니다.올리고당은 분자 여과를 통해 추가로 정제되며, 이를 통해 30 kilodaltons보다 큰 단백질 및 기타 오염 물질로부터 분리됩니다. 그 다음 글리칸을 HPLC로 분리합니다. 각 용출 분획에서 방사성 신호의 강도를 측정하여 각 글리칸 형태의 양을 결정합니다.안녕하세요, 텔아비브 대학교 세포 연구 및 면역학과의 Gerardo Letter Kremer 연구실 소속 Edward Azo입니다. 저는 Gerardo Letter Kremer 실험실 소속이기도 합니다. 오늘은 대사적으로 표지 및 결합된 올리고당의 분리 및 분석 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 전체 세포 당단백질 풀과 개별 당단백질 모두에 대해 당쇄 가공의 역학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 90mm 디쉬 하나에서 하룻밤 동안 배양한 NIH 3T3 세포를 사용하십시오.각 시료의 경우, 세포를 포도당 결핍 상태로 만들기 위해 배양 밀도를 sub confluent 상태로 유지합니다. 20% 투석 FCS와 8mM Sodium pyruvate가 포함된 2배 농도의 포도당 결핍 배지를 새로 준비하고, 필요한 양의 2배 농도 배지 1부피를 탈이온수 1부피로 희석합니다. 배지를 미리 데운 후, 각 세포 시료를 5mL의 신선하게 예열된 배지에서 5~15분 동안 배양합니다. 체이스(chase) 시간이 12시간보다 길게 필요한 경우, 세포는 무균 상태에서 취급해야 합니다.배양 기간이 끝나면 펄스(pulse) 및 체이스(chase) 샘플에 해당하는 디쉬에 표시를 합니다. 면역침전법을 이용한 당단백질 분석을 위해 n-글리칸을 표지하려면, 기아 배지를 400 µCi/mL의 tritium 표지 mannos가 보충된 1 mL의 예열된 무포도당 배지로 교체합니다. 총 당단백질의 표지 및 분석에는 65 µCi/mL를 사용합니다.기아 배지로 교체한 후, 세포를 일반적인 조직 배양 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 배양이 끝나면 모든 시료에서 표지 배지를 제거합니다. 펄스(pulse)에 해당하는 시료에 4°C의 PBS 2 mL를 조심스럽게 첨가하고 얼음 위에 둡니다. 이 시료들을 펄스 시료라고 합니다.미리 데워둔 일반 완전 배양 배지 2 mL를 사용하여 체이즈 샘플을 3회 세척하십시오. 그런 다음 세포에 미리 데워둔 일반 배지 5 mL를 추가합니다.추적 샘플을 37°C의 이산화탄소 배양기에 넣고 원하는 추적 시간 동안 배양합니다. 추적 샘플을 배양하는 동안, 얼음 위에 보관해 두었던 펄스 샘플을 2 mL의 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 그 다음, 셀 스크레이퍼를 사용하여 디시에서 세포를 긁어냅니다.2 mL의 PBS에 담긴 방출된 세포를 2 mL EOR 튜브에 옮깁니다. 상층액을 분리하기 위해 세포를 16,000 G에서 6~10초 동안 원심 분리하고 세포 펠릿을 -80 °C에서 냉동합니다. 체이스 샘플의 배양이 끝나면 이를 세척합니다.펄스 샘플과 동일한 방식으로 원심 분리하여 보관하십시오. 세포 용해 단계로 진행할 준비가 되면 냉동고에서 세포를 꺼내십시오. IP 분석을 위해 300 µL의 버퍼를 첨가하여 세포를 용해하십시오.잠시 동안 보텍싱하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 300 µL의 버퍼 B가 포함된 총 당단백질 샘플의 분석을 위해, 세포를 얼음 위에서 20분 동안 배양한 후, 최대 진폭으로 10초씩 4회 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 5분 동안 가열하여 끓입니다.마지막으로, 모든 용해물을 4°C에서 16,000 Gs로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새로운 EOR 튜브로 옮기고 펠렛은 제거합니다. 여기에서 제시한 H two A 당단백질의 면역침강을 위해 표적 단백질의 IP를 진행하십시오.용해된 세포의 상층액에 시료당 20 µL의 protein A/G beads와 시료당 3 µL의 토끼 항-H2A 다클론 항체를 첨가합니다. 4 °C에서 4~16시간 동안 천천히 회전시켜 지속적으로 혼합하며 시료를 배양합니다. 배양이 끝나면 비드를 원심 분리하여 가라앉히고 진공 장치를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 500 µL의 버퍼 T를 첨가하여 비드를 4회 세척합니다.비드를 원심 분리하여 상층액을 제거함으로써 비드에 결합된 단백질을 분리합니다. endo H 키트의 변성 버퍼 10 µL를 비드 펠렛에 첨가하고 샘플을 5분 동안 가열합니다. 비드를 원심 분리한 후 상층액을 새로운 EOR 튜브로 옮깁니다.이제 ellu 단백질의 탈당쇄화(deglycosylation)를 준비합니다. 효소와 OH를 사용하여 IP 및 전체 단백질 샘플 모두에서 글리칸을 분리합니다. IP 샘플의 경우, 각 샘플에 2배 농도의 endo H 반응 버퍼 10 µL와 함께 endo H 효소 0.5 µL를 첨가합니다. 샘플을 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.전체 당단백질의 경우, 세포 용해물의 상층액을 30 kilodalton 컷오프의 MicroCon 필터에 적용합니다. 14,000 Gs에서 반복 원심분리를 수행하여 전체 단백질 추출물을 100 microliters의 buffer E로 3회 세척합니다. 3분 동안, 세척된 단백질이 남아 있는 MicroCon에 10 x endo H 반응 버퍼 3 microliters와 endo H 효소 1.5 microliters를 첨가합니다. 그리고 IP 샘플과 함께 37 degrees Celsius에서 3시간 동안 배양합니다.3시간의 배양이 끝나면, IP 샘플을 탈이온수로 5배 희석하여 새 MicroCon 필터 위에 놓고 14,000 Gs에서 3분 동안 원심분리합니다. 50 µL의 탈이온수를 가하고 원심분리하여 IP 및 총 단백질 샘플을 모두 세척합니다. 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 원하는 경우, 절단된 글리칸이 포함된 유출액을 endo H 처리된 튜브에 보관합니다. 이후 endo H 내성 당단백질을 15 µL의 버퍼 C에 희석된 200 mU의 N-glycosidase F와 함께 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다.보여드린 바와 같이 탈이온수로 용출을 수행합니다. 공정을 가속화하기 위해 최대 45°C까지 가열 가능한 신속 농축기(speed vac concentrator)를 사용하여 샘플을 완전히 건조하십시오. 건조된 펠릿을 12 µL의 HPLC 용매에 재현탁하고, HPLC 장치에 설치된 C18 또는 amino 컬럼에 샘플을 로딩합니다.동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 분석합니다. 각 샘플 분석당 48개의 분획을 수집합니다. 신틸레이션 카운터를 사용하여 수집된 분획의 CPM 값을 측정하고, 분획 번호에 따른 CPM 판독값을 그래프로 나타냅니다.동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로 모든 글라이칸 종의 mannose 잔기 백분율을 계산하십시오. 다음은 1시간 펄스 라벨링 샘플의 총 당단백질에 대한 당쇄 분석의 대표적인 결과입니다. HPLC 분획의 CPM 판독값이 결과 프로파일의 분획 번호에 따른 함수로 도식화되어 있습니다.각 피크는 기지(known)의 글라이칸 표준물질을 HPLC로 분석하여 확인된 특정 글라이칸 종을 나타냅니다. 각 글라이칸 종에 대하여, 전체 글라이칸 중 해당 종이 차지하는 몰 백분율이 체이스 시간(chase time)의 함수로 도식화되었습니다. 여기에 제시된 시간은 프로테아좀 억제제 MG 1 32로 처리한 샘플에서 면역침전법으로 분리한 특정 미접힘 당단백질(misfolded glycoprotein)에 대한 분석 결과입니다.trimming된 당쇄 종 M56은 chase 기간 동안 축적되며, 이는 미스폴딩된 단백질의 올리고당이 분해되기 전 광범위한 man trimming 과정을 거친다는 결론으로 이어집니다. 이는 동일한 방식으로 처리된 샘플의 전체 당단백질 내 올리고당과 대조적입니다. 여기서는 chase 기간 동안 M98이 주요 당쇄 종으로 남아 있으며, M56의 양은 소량만 증가합니다. 이는 전체 당단백질 풀(pool) 중 아주 적은 일부만이 소포체 관련 단백질 분해(ER associated protein degradation)의 대상으로 지정된다는 결론으로 이어집니다.약어 rad. 동반된 서면 프로토콜에서 더 자세히 설명했듯이, 우리는 생세포 내에서의 펄스-체이스(pulse-chase)법과 HPLC 분석을 조합하여 당단백질의 수명 동안 연결되지 않은 올리고당 조성의 역학을 추적하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 체이스(chase) 샘플이 미량의 방사성 물질에 오염되지 않도록 주의하는 것이 중요하며, 오염될 경우 크기 분리 과정 중 체이스 기간 동안 글리칸의 원치 않는 표지가 발생할 수 있습니다.글리칸 분획의 일관성을 보장하기 위해 HPLC를 일정 압력으로 조정하는 것 또한 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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생물학

면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 - 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.

세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

O-결합 글라이칸의 다양성을 종합적으로 탐구하기 위해 과메틸화 및 신속한 상 분할 방법과 결합된 겔 내 환원적 β-제거를 위한 새로운 절차를 SDS-PAGE에 의해 분해되고 질량 분석법에 의한 후속 글리코마이크 분석이 가능한 당단백질에서 직접 방출되는 O-결합 글라이칸의 분석에 적용됩니다.

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

고처리량 프로토콜은 단백질체학 및 글리코믹스 정제와 혈장에서 LC-MS/MS 정량화를 결합하기 위해 개발되었습니다. N-linked glycosylation motifs의 탈아미드화 분석은 탈glycosylated 부위에 특이적이었습니다. N-글리칸의 정확한 정량화는 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 필터 지원 N-글라이칸 분리를 개별성 정규화에 결합함으로써 달성되었습니다.

양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

이 기사는 GC-MS에 의한 검출을 위해 글리칸을 구성 연결 특이적 단당류로 화학적으로 분해하여 분획되지 않은 생체 유체에서 글리칸의 통합 조성 프로파일을 분석하도록 설계된 새로운 상향식 글리코믹스 기술의 향상된 형태를 제시합니다. 잠재적인 응용 분야에는 암 및 기타 글리칸 정동 장애의 조기 발견이 포함됩니다.

글리 칸 노드 분석 : 글리코 믹스에 대한 상향식 접근

우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다.

SCAP의 분석<em&gt; N</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매

Sialic acid는 전형적인 단 당 류 단위 glycoconjugates에서 발견입니다. 그것은 분자 및 세포 상호 작용의 과다에 관여. 여기 우리가 N-acetylmannosamine 유도체와 대사 glycoengineering를 사용 하 여 셀 표면 sialic 산 식을 수정 하는 방법을 제시.

N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

여기는 접는, 전송 및 라이브 셀에 따라 단백질의 저하의 운동 분석을 허용 하는 일반적인 펄스-체이스 메서드에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

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번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

학습하세요 포유 동물 세포에서 N-연결 당단백질의 설탕 사슬 변화를 추적하는 펄스 체이스 분석법을. HPLC와 방사성 표지를 활용한 이 방법은 당생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

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