포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

당단백질의 비결합성 당쇄 분석은 삼중수소 표지 마노스(tritiated mannose)를 사용하여 글리칸과 세포를 표지하는 것으로 시작합니다. 펄스 접시는 얼음 위에서 냉각시키고, 체이스 접시는 원하는 체이스 기간 동안 표지제 없이 배양합니다. 다음으로, 샘플을 용해하고 목적 당단백질을 면역 정제하여 변성시킨 후, 효소를 이용해 글리칸을 분리합니다.

올리고당은 분자 여과를 통해 추가로 정제되며, 이를 통해 30 kilodaltons보다 큰 단백질 및 기타 오염 물질로부터 분리됩니다. 그 다음 글리칸을 HPLC로 분리합니다. 각 용출 분획에서 방사성 신호의 강도를 측정하여 각 글리칸 형태의 양을 결정합니다.

안녕하세요, 텔아비브 대학교 세포 연구 및 면역학과의 Gerardo Letter Kremer 연구실 소속 Edward Azo입니다. 저는 Gerardo Letter Kremer 실험실 소속이기도 합니다. 오늘은 대사적으로 표지 및 결합된 올리고당의 분리 및 분석 절차를 보여드리겠습니다.

저희 실험실에서는 전체 세포 당단백질 풀과 개별 당단백질 모두에 대해 당쇄 가공의 역학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 90mm 디쉬 하나에서 하룻밤 동안 배양한 NIH 3T3 세포를 사용하십시오.

각 시료의 경우, 세포를 포도당 결핍 상태로 만들기 위해 배양 밀도를 sub confluent 상태로 유지합니다. 20% 투석 FCS와 8mM Sodium pyruvate가 포함된 2배 농도의 포도당 결핍 배지를 새로 준비하고, 필요한 양의 2배 농도 배지 1부피를 탈이온수 1부피로 희석합니다. 배지를 미리 데운 후, 각 세포 시료를 5mL의 신선하게 예열된 배지에서 5~15분 동안 배양합니다. 체이스(chase) 시간이 12시간보다 길게 필요한 경우, 세포는 무균 상태에서 취급해야 합니다.

배양 기간이 끝나면 펄스(pulse) 및 체이스(chase) 샘플에 해당하는 디쉬에 표시를 합니다. 면역침전법을 이용한 당단백질 분석을 위해 n-글리칸을 표지하려면, 기아 배지를 400 µCi/mL의 tritium 표지 mannos가 보충된 1 mL의 예열된 무포도당 배지로 교체합니다. 총 당단백질의 표지 및 분석에는 65 µCi/mL를 사용합니다.

기아 배지로 교체한 후, 세포를 일반적인 조직 배양 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 배양이 끝나면 모든 시료에서 표지 배지를 제거합니다. 펄스(pulse)에 해당하는 시료에 4°C의 PBS 2 mL를 조심스럽게 첨가하고 얼음 위에 둡니다. 이 시료들을 펄스 시료라고 합니다.

미리 데워둔 일반 완전 배양 배지 2 mL를 사용하여 체이즈 샘플을 3회 세척하십시오. 그런 다음 세포에 미리 데워둔 일반 배지 5 mL를 추가합니다.

추적 샘플을 37°C의 이산화탄소 배양기에 넣고 원하는 추적 시간 동안 배양합니다. 추적 샘플을 배양하는 동안, 얼음 위에 보관해 두었던 펄스 샘플을 2 mL의 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 그 다음, 셀 스크레이퍼를 사용하여 디시에서 세포를 긁어냅니다.

2 mL의 PBS에 담긴 방출된 세포를 2 mL EOR 튜브에 옮깁니다. 상층액을 분리하기 위해 세포를 16,000 G에서 6~10초 동안 원심 분리하고 세포 펠릿을 -80 °C에서 냉동합니다. 체이스 샘플의 배양이 끝나면 이를 세척합니다.

펄스 샘플과 동일한 방식으로 원심 분리하여 보관하십시오. 세포 용해 단계로 진행할 준비가 되면 냉동고에서 세포를 꺼내십시오. IP 분석을 위해 300 µL의 버퍼를 첨가하여 세포를 용해하십시오.

잠시 동안 보텍싱하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 300 µL의 버퍼 B가 포함된 총 당단백질 샘플의 분석을 위해, 세포를 얼음 위에서 20분 동안 배양한 후, 최대 진폭으로 10초씩 4회 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 5분 동안 가열하여 끓입니다.

마지막으로, 모든 용해물을 4°C에서 16,000 Gs로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새로운 EOR 튜브로 옮기고 펠렛은 제거합니다. 여기에서 제시한 H two A 당단백질의 면역침강을 위해 표적 단백질의 IP를 진행하십시오.

용해된 세포의 상층액에 시료당 20 µL의 protein A/G beads와 시료당 3 µL의 토끼 항-H2A 다클론 항체를 첨가합니다. 4 °C에서 4~16시간 동안 천천히 회전시켜 지속적으로 혼합하며 시료를 배양합니다. 배양이 끝나면 비드를 원심 분리하여 가라앉히고 진공 장치를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 500 µL의 버퍼 T를 첨가하여 비드를 4회 세척합니다.

비드를 원심 분리하여 상층액을 제거함으로써 비드에 결합된 단백질을 분리합니다. endo H 키트의 변성 버퍼 10 µL를 비드 펠렛에 첨가하고 샘플을 5분 동안 가열합니다. 비드를 원심 분리한 후 상층액을 새로운 EOR 튜브로 옮깁니다.

이제 ellu 단백질의 탈당쇄화(deglycosylation)를 준비합니다. 효소와 OH를 사용하여 IP 및 전체 단백질 샘플 모두에서 글리칸을 분리합니다. IP 샘플의 경우, 각 샘플에 2배 농도의 endo H 반응 버퍼 10 µL와 함께 endo H 효소 0.5 µL를 첨가합니다. 샘플을 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

전체 당단백질의 경우, 세포 용해물의 상층액을 30 kilodalton 컷오프의 MicroCon 필터에 적용합니다. 14,000 Gs에서 반복 원심분리를 수행하여 전체 단백질 추출물을 100 microliters의 buffer E로 3회 세척합니다. 3분 동안, 세척된 단백질이 남아 있는 MicroCon에 10 x endo H 반응 버퍼 3 microliters와 endo H 효소 1.5 microliters를 첨가합니다. 그리고 IP 샘플과 함께 37 degrees Celsius에서 3시간 동안 배양합니다.

3시간의 배양이 끝나면, IP 샘플을 탈이온수로 5배 희석하여 새 MicroCon 필터 위에 놓고 14,000 Gs에서 3분 동안 원심분리합니다. 50 µL의 탈이온수를 가하고 원심분리하여 IP 및 총 단백질 샘플을 모두 세척합니다. 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 원하는 경우, 절단된 글리칸이 포함된 유출액을 endo H 처리된 튜브에 보관합니다. 이후 endo H 내성 당단백질을 15 µL의 버퍼 C에 희석된 200 mU의 N-glycosidase F와 함께 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다.

보여드린 바와 같이 탈이온수로 용출을 수행합니다. 공정을 가속화하기 위해 최대 45°C까지 가열 가능한 신속 농축기(speed vac concentrator)를 사용하여 샘플을 완전히 건조하십시오. 건조된 펠릿을 12 µL의 HPLC 용매에 재현탁하고, HPLC 장치에 설치된 C18 또는 amino 컬럼에 샘플을 로딩합니다.

동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 분석합니다. 각 샘플 분석당 48개의 분획을 수집합니다. 신틸레이션 카운터를 사용하여 수집된 분획의 CPM 값을 측정하고, 분획 번호에 따른 CPM 판독값을 그래프로 나타냅니다.

동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로 모든 글라이칸 종의 mannose 잔기 백분율을 계산하십시오. 다음은 1시간 펄스 라벨링 샘플의 총 당단백질에 대한 당쇄 분석의 대표적인 결과입니다. HPLC 분획의 CPM 판독값이 결과 프로파일의 분획 번호에 따른 함수로 도식화되어 있습니다.

각 피크는 기지(known)의 글라이칸 표준물질을 HPLC로 분석하여 확인된 특정 글라이칸 종을 나타냅니다. 각 글라이칸 종에 대하여, 전체 글라이칸 중 해당 종이 차지하는 몰 백분율이 체이스 시간(chase time)의 함수로 도식화되었습니다. 여기에 제시된 시간은 프로테아좀 억제제 MG 1 32로 처리한 샘플에서 면역침전법으로 분리한 특정 미접힘 당단백질(misfolded glycoprotein)에 대한 분석 결과입니다.

trimming된 당쇄 종 M56은 chase 기간 동안 축적되며, 이는 미스폴딩된 단백질의 올리고당이 분해되기 전 광범위한 man trimming 과정을 거친다는 결론으로 이어집니다. 이는 동일한 방식으로 처리된 샘플의 전체 당단백질 내 올리고당과 대조적입니다. 여기서는 chase 기간 동안 M98이 주요 당쇄 종으로 남아 있으며, M56의 양은 소량만 증가합니다. 이는 전체 당단백질 풀(pool) 중 아주 적은 일부만이 소포체 관련 단백질 분해(ER associated protein degradation)의 대상으로 지정된다는 결론으로 이어집니다.

약어 rad. 동반된 서면 프로토콜에서 더 자세히 설명했듯이, 우리는 생세포 내에서의 펄스-체이스(pulse-chase)법과 HPLC 분석을 조합하여 당단백질의 수명 동안 연결되지 않은 올리고당 조성의 역학을 추적하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 체이스(chase) 샘플이 미량의 방사성 물질에 오염되지 않도록 주의하는 것이 중요하며, 오염될 경우 크기 분리 과정 중 체이스 기간 동안 글리칸의 원치 않는 표지가 발생할 수 있습니다.

글리칸 분획의 일관성을 보장하기 위해 HPLC를 일정 압력으로 조정하는 것 또한 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.