Name: 인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 배우세요 인간 대뇌피질 조직에서 Aβ 다중체를 SDS-PAGE와 면역블로팅으로 검출하는 방법을. 항원 에피토프 회복 기법을 활용하여 알츠하이머병 병리 연구에 활용할 수 있습니다.

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일레인 Pranski 우수한 기술 지원 캐롤린 Suwyn와 해리 레빈 III, M. 폴 머피, 중요한 대화를 게어링 말라 많은 감사드립니다. 기금은 RR - 00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, 우드러프 재단과 에모리 대학 조사위원회에 의해 제공되었다.

1 부 : 명확히 조직 homogenates의 작성 <ol><li> 약 30도 유봉 스트로크로 (즉, 추가 400μl 버퍼 - 얼음처럼 차가운 버퍼 (플러스 2X 프로 테아제 억제제 칵테일 [산타크루즈] 0.1M 인산 버퍼 호수 [와 MG + + 무료 칼슘 + +])의 4 번 볼륨에서 수정되지 않은 대뇌 피질의 조직을 균질 다운스 100mg 조직). </li><li> 3000 5 분 스핀 homogenates g (4 ° C). 조심스럽게 -80에서 명확히 supernatants 이들 추출물의 저장 aliquots를 제거 ° C를 사용까지. </li><li> 제조 업체의 지침 (ThermoFisher)에 의하면, bicinchoninic 산성 (BCA) 분석을 사용하여 명확히 homogenates에 대한 총 단백질 농도 (μg / μl)를 결정합니다. </li></ol> 2 부 : SDS - PAGE 샘플 준비 <ol><li> 물론 10으로 10~20% Tricine 젤 (Invitrogen), 잘마다 로드할 수있는 최대 볼륨 ~ 25μl이다. 총 볼륨 2X SDS 샘플 버퍼와 10X 감소 에이전트를 포함, 잘마다 로드할 수 명확히 homogenate의 최대 볼륨이 10μl가되도록. 20% (W / V) 명확히 피질 homogenates는 당 잘 50μg 총 단백질에 대한 허용, 5 μg / μl 이상의 총 단백질 농도가 있어야합니다. 이하 5mg/ml 단백질과 샘플 당 자 이하 총 단백질을 로딩 할거 것입니다. 그러나, 높은 단백질 수준은 monomeric 및 집계 Aβ의 검색 (50 - 60μg 총 단백질이 최적입니다)에 최적입니다. 항상마다 잘 총 단백질의 동일한 금액을로드합니다. </li><li> 각 젤 들면 SeeBlue Plus2 (Invitrogen)로 분자량 마커의 10μl와 적어도 하나를로드합니다. 긍정적인 제어로, 합성 Aβ40 또는 다른 우물에 Aβ42 펩타이드 (1xPBS에 희석) 10 - 100ng 실행합니다. </li><li> 갓 해동, 명확히 homogenates을 사용하여 얼음에서 반응 혼합물을 준비합니다. 5-10초에 대한 소용돌이 튜브, 100에서 건조 욕조에 열을 ° C 5 분 후, 신속하게 모자의 결로를 제거하는 모든 샘플을 스핀. </li></ol> 파트 3 : SDS - PAGE 젤 전기 영동 <ol><li> , 제조 업체의 지침 (Invitrogen)에 따라, Tricine SDS 실행 버퍼를 사용하여 XCell 물론 잠금 미니 셀 Gelbox에 10~20%의 Tricine 젤로 vortexed 샘플을로드 </li><li> 약 90 분 동안 125V의 일정한 전압에서 젤을 실행합니다. 4KDa 마커 밴드가 젤의 바닥에서 1cm에 대한 때까지 샘플을 실행하자. </li></ol> 4 부 : 젤에서 세포막으로 전송 단백질 <ol><li> 조심스럽게 제조 업체의 지침 (Invitrogen)에 따라, 플라스틱 케이스에서 젤류를 제거하고 XCell II 얼룩 모듈 내부 전송 샌드위치를​​ 조립. 사전 서부 유럽 표준시 트리스 - 글리신 전송 버퍼 (20 % 메탄올)과 패드와 0.2μm nitrocellulose 막을 모래 바닥, 그리고 모래 바닥 패드 또는 여과지 / 멤브레인 샌드위치에서 모든 거품을 제거하십시오. </li><li> XCell Gelbox에서 전송 버퍼와 내부 챔버를 기입 dIH 2 O (메탄올의 노출 시간이 지남에 따라 플라스틱 gelbox을 입을 수)와 외부 챔버를 입력합니다. </li><li> 25mA의 일정한 암페어에서 2~3시간에 대한 전송을 실행합니다. </li><li> 전송이 완료되면, 샌드위치를 ​​재조 두 사각형 플라스틱 배양 접시에 1xPBS (또는 다른 적절한 컨테이너)에 dIH 2 O와 점막에 젤 넣습니다. </li><li> 단백질 전송의 효율성을 시각화하기 위해, 젤 단순히 블루 SafeStain (Invitrogen) 물들일 수 있으며, 개양귀비빛의 S 붉은 얼룩 (시그마 알드리치)와 안정, 두 제조 업체의 지시에 따라. 이 얼룩은 immunoblotting 영향을주지 않습니다. 얼룩은 비효율적인 단백질 전송을 공개하는 경우 3 단계에서 전송 시간을 수정합니다. </li></ol> 제 5 부. 항원 - 에피토프 복구 및 Immunoblotting <ol><li> 항원 검색은 immunoblotting 동안 항체 바인딩을위한 멤브레인에 Aβ epitopes을 드러내는에서 중요한 단계입니다. 100 일정한 온도를 유지 ° 모든 증기선, 전자렌지, 또는 물이 욕조가 C는 충분합니다. 기선의 항원 검색을 위해, 상온에서, 1xPBS 가득한 강력 Kapak 플라스틱 주머니에서 막을 열 - 인감. 미리 온수 기선의 평면 주머니 라이, 파우치는 추가로 15 분 동안 품어, 확장하기 시작 한때. 멤브레인가 과도하게 주름을 방지하기 위해, 주머니에서 제거하기 전에 천천히 냉각 수 있습니다. </li><li> 상온에서, 신중하게 피어오르는 주머니에서 멤브레인를 제거하고 5 분 (0.05 % 트윈 - 20과 함께 살린, 산도 8.0을 트리스 버퍼 TBS - T에 린스 다음 1xPBS 5 분 동안 멤브레인을 린스 [시그마] ), 궤도 흔드는에. 떨고 한 시간 동안 차단 솔루션에 멤브레인 (TBS - T에서 2.5 %의 무지방 우유)를 품어. rinsing없이, 피하 풍선 (1:1,000 [1μg/ml] 1:5,000 [0.2μg/ml] 희석, Covance에서 6E10) 차단 솔루션에 희석 기본 항체를 포함하는 음식 또는 플라스틱 주머니에 막를 전송S. 4 떨고 ° C (더 이상 부화 더 나은 신호를 줄 수 있습니다.) 1 시간 후 24~48시간에 대한 실온에서 궤도 흔드는에 품어 </li><li> TBS - T 30 분 동안 막을 린스 (한 빠른 3 X 10 분 rinses 다음 린스). </li><li> 상온에서 흔드는에서 90 분간 차단 솔루션 1:10,000에서 희석 HRP - 복합 이차 항체에 멤브레인 (애머스햄 ECL 양 안티 - 마우스, GE 헬스케어)을, 알을 품다. </li><li> TBS - T 30 분 동안 막을 린스 (한 빠른 3 X 10 분 rinses 다음 린스). </li><li> 흔드는에서 플라스틱 시트 보호 장치 사이에 보푸라기가없는 필터 종이에 여분의 시약을 얼룩 및 필름 카세트에 막을 장소, 5 분 갓 만든 SuperSignal 웨스트 피코 Electrochemiluminescence 시약 (ThermoFisher)에서 막을 품어. 먼지없는 Kimwipes 필요한 경우와 추가 SuperSignal 시약을 얼룩. </li><li> 30 분정도 30 초 간격에 대한 코닥 Biomax MR 필름에 노출 및 필름 개발에 개발할 수 있습니다. 오분 후, Aβ 모노머 밴드는 아마 포화됩니다. </li><li> 세포막은 복원에 떨고 플러스 실온에서 30 분 버퍼가 벗겨진하고 원하는 경우 추가 항체와 reprobed하여 (TBS - T에 rinsing 이후) 송두리째 수 있습니다. </li></ol> 6 부 : 대표 Immunoblot : <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="그림 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1A"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="그림 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1B"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="그림 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1C"> 7 인간의 과목에서 50μg 총 단백질을 포함하는 수치 1A - C. 명확히 homogenates는 multimeric Aβ와 APP의 존재에 대해 분석하고 있습니다. 항체 6E10와 Immunoblotting 것은 Aβ 단량체, dimers, trimers, tetramers, 그리고 알츠하이머의 경우 APP (상단 밴드)뿐만 아니라,이 광고의 경우에 풍부 고분자량 Aβ의 multimers를 보여줍니다. 합성 Aβ40은 낮은 분자량 밴드의 신원을 확인합니다. AD : 알츠하이머 질환, DLB : Nondemented 인간 (A) 30 분 필름 노출, (B) 5 분 필름 노출, (C) 30초 필름 노출 :. Lewy 기관, ND와 치매.

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

알츠하이머 병 1,4,5의 pathogenesis에서 Aβ 집합의 중요성에도 불구하고, 몇 가지 연구가 설명 또는 인간의 대뇌 피질의 조직 샘플 2 다양한 Aβ multimers의 분포를 계량 있습니다. 일반적으로 사용되는 immunohistochemical 기법은 고정 피질 조직에서 서로 다른 multimeric Aβ 종의 차별에 대한 허용하지 않습니다. 떼어낸 피질 조직 homogenates에서 Aβ multimers는 분리와 화학적 겔 전기 영동과 항체 기반의 탐지 방법을 사용 평가하실 수 있습니다. 그러나, 타겟으로하는 Aβ epitopes는 감지 및 집계 Aβ의 정확한 양을 정함 방지, 집계 및 사후 translationally 수정 펩타이드 구조 내에 숨겨져있을 수 있습니다. SDS - PAGE와 Aβ 6,7의 N - 터미널 지역에 항체와 immunoblotting와 결합하여 열을 유발 항원 에피토프 검색을 사용하여, 우리는 별도의 자연 인간의 두뇌에서 격리...

<table><tbody><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail 정제</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>25ml 완충액당 정제 1알</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell 및 XCell II Blot Module 키트 CE Mark</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS 샘플 완충액 (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 샘플 환원제 (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose 막, 0.2 &amp;mu;m 공극 크기</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running 완충액 (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer 완충액 (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>면역염색을 방해하지 않음</td></tr><tr><td>ATX Ponceau S Red 염색액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td>면역염색을 방해하지 않음</td></tr><tr><td>Kapak 열 밀봉 가능 플라스틱 샘플 파우치</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>A&amp;#946;(1-16)에 대한 6E10 마우스 단클론 항체</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>WB용으로 1:1,000에서 1:5,000까지 희석</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole A&amp;#946; (sheep 유래)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>1:10,000으로 희석</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 화학발광 기질</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Biomax MR 필름</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 두피 조직에서 aβ multimers의 sds-page/immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 homogenates

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

β - 아밀로이드의 변칙 접지와 중합도 (Aβ) 펩타이드는 알츠하이머 질병 pathogenesis에 neurodegenerative 층계를 시작 생각됩니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 알츠하이머 질환에서 대뇌 치매 plaques의 코어에서 발견되는 β - 시트 풍부한 아밀로이드 원섬유로 자체 집계하는 경향이 있거나 42 아미노산 펩타이드 - Aβ는 주로 40. 증거를 증가하면 해당 낮은 분자량이 용해 Aβ의 multimers가 원섬유의의 Aβ의 아밀로이드보다 독성이 제안<sup&gt; 2</sup&gt;. 뇌 조직에서 낮은과 높은 분자량 multimeric Aβ 종의 식별 및 부량는 알츠하이머 질병 연구에 필수적인 목적이며, 또한 고용 방법은 다른 proteopathies에 독성 multimers의 식별 및 특성에 적용할 수있는<sup&gt; 3</sup&gt;. 자연스럽게 발생 Aβ multimers는 Aβ 특정 항체와 immunoblotting 다음 SDS - polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 감지하실 수 있습니다. 그러나, multimeric Aβ의 분리 및 검출은 고농도 대뇌 피질 homogenates 작은 기공 크기 nitrocellulose의 점막에서 항원 검색의 사용을 필요로합니다. 여기서 우리는 명확히 인간의 대뇌 피질 homogenates의 준비를 위해 기술, SDS - PAGE에 의해 단백질의 분리, 그리고 항원 에피토프 복구 / Aβ 펩타이드의 N - 터미널 지역에 항체 6E10과 모래 바닥 서양을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리와 인간에서 Aβ 단량체, dimers, trimers, tetramers 및 대뇌 피질의 조직에서 높은 분자량의 multimers을 감지.

우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

$\beta$-아밀로이드(A$\beta$) 펩타이드의 비정상적인 접힘과 중합은 알츠하이머병의 신경퇴행성 폭포 현상을 유발하는 것으로 생각됩니다...

본 프로토콜은 인간 피질 조직 내의 beta malters 검출을 가능하게 합니다. 먼저 균질화된 조직을 프로브 초음파 처리하고 저속 원심분리를 통해 청징화합니다. 다음으로 SDS 버퍼에서 끓여 환원시킨 샘플을 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩합니다.겔 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전이시킨 후, 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)에서 막을 증기로 가열합니다. 마지막으로 궤도 쉐이커(orbital shaker) 위에서 막을 1차 항체, HRP 결합 2차 항체 순으로 하룻밤 동안 인큐베이션하고, x-ray 필름에 노출시키기 전 루미날 과산화물 시약(luminal peroxide reagent)으로 처리합니다. 안녕하세요, 저는 에모리 대학교 예르케스 국립 영장류 연구 센터 신경과학과의 Larry Walker 교수님 연구실 소속 Rebecca Rosen입니다.오늘은 열 유도 항원 회복법을 이용한 SDS 겔 전기영동 및 면역 블로팅을 통해 Abeta 다량체와 피질 균질물을 검출하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 사용하여 알츠하이머병 환자의 인간 및 고령의 비인간 영장류에서 유래한 비고정 피질 조직 내 서로 다른 Abeta 다량체의 수준과 분포를 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.고정되지 않은 피질 조직 약 100mg을 준비하고, 얼음처럼 차가운 버퍼 약 400µL에서 페스틀로 약 30회 균일하게 스트로크하여 균질화합니다. 중량 대 부피 비율(w/v) 20%를 기준으로, 조직 무게 대 버퍼 부피의 비율은 1mg당 4µL가 되어야 합니다. 균질화 후 균질물을 4mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 출력 5에서 5초간 3회 프로브 초음파 처리(probe sonicate)합니다.초음파 처리를 마친 후 균질액을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 3000 G에서 5분 동안 원심분리하십시오. 투명해진 상층액을 조심스럽게 제거하고, 이 추출액을 50 microliter씩 분주하여 사용 시까지 minus 80 degrees Celsius에서 보관하십시오. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 bio acid 또는 BCA assay를 사용하여 갓 해동한 투명 균질액 분주액의 총 단백질 농도를 측정하십시오. 투명해진 20% 피질 균질액의 단백질 농도는 5 micrograms per microliter보다 높아야 하며, 따라서 플레이트 리더의 측정 범위 내에 들어오도록 1:10으로 희석할 수 있습니다. BCA assay를 위해, 동일한 투명 균질액 분주액으로 변성 시료 반응액을 준비하십시오.총 단백질을 약 50에서 60 µg 사용하고, 각각 동일한 총 단백질을 포함하도록 피질 균질액의 부피를 적절히 조절하십시오. 실행할 각 10~20% trice gel에 대해 샘플의 총 부피를 25 µL로 준비하십시오. 각 젤에 대해, 1X PBS에 희석한 10~100 ng의 합성 a beta 40 또는 a beta 42 펩타이드 10 µL, 2X SDS 샘플 버퍼 12.5 µL, 그리고 10x 환원제 2.5 µL를 혼합하여 양성 대조군을 준비하십시오.베타 컨트롤을 포함한 모든 샘플을 준비한 후, 5~10초 동안 볼텍싱하고 100 °C의 드라이 배스에서 5분 동안 가열한 다음, 모든 튜브를 빠르게 원심 분리하여 캡의 응축수를 제거합니다. Tris-SDS 러닝 버퍼에 담긴 젤 박스의 젤에 샘플을 로딩하고, 최소 한 개의 웰에 희석하지 않은 분자량 마커 10 µL를 로딩합니다. 125 V의 정전압에서 약 90분 동안 또는 4 kDa 마커가 젤 바닥에서 약 1 cm 거리까지 내려올 때까지 젤을 전기영동합니다.플라스틱 케이스에서 젤을 조심스럽게 꺼낸 후, 제조사의 지침에 따라 트랜스퍼 샌드위치를 조립합니다. 블로팅 패드와 마이크로미터 니트로셀룰로스 멤브레인을 tris glycine 트랜스퍼 버퍼로 미리 적시고, 블로팅 패드나 필터 페이퍼 멤브레인 샌드위치에서 기포를 모두 제거합니다.전이 장치의 내부 챔버를 전이 버퍼로 채우고 외부 챔버를 증류수로 채웁니다. 25 mA의 일정 전류에서 2~3시간 동안 전이를 수행합니다. 전이가 완료되면 샌드위치 구조를 해체하고, 겔은 증류수가 담긴 접시에, 막은 모든 프로토콜 단계에 사용되는 1X PBS가 담긴 접시에 각각 넣습니다.겔과 멤브레인이 건조되는 것을 방지하기 위해 액체로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 단백질 전이 효율을 시각화하려면 겔을 희석하지 않은 Simply Blue Safe 스테인으로 약 1시간 동안, 멤브레인을 1x PON S red 스테인으로 약 5분 동안 염색하십시오. 배양 시간은 제조사의 지침에 따르며, 이 염색 과정은 면역 블로팅(immuno blotting)에 영향을 주지 않습니다.염색 결과 단백질 전이가 효율적이지 않은 것으로 나타나면, 항원 회복을 위해 3단계의 전이 시간을 수정하십시오. 실온의 1x PBS 약 50 mL를 채운 고강도 CapEx 플라스틱 파우치에 멤브레인을 넣고 열 밀봉합니다. 파우치를 100 °C로 예열된 스티머에 평평하게 놓고, 파우치가 팽창하기 시작하면 15분 동안 추가로 배양한 후 스티머에서 꺼내십시오.실온에서 막이 과도하게 구겨지는 것을 방지하기 위해, 파우치에서 꺼내기 전 막을 천천히 식힙니다. 파우치에서 막을 조심스럽게 꺼내어 오비탈 쉐이커에서 XPBS로 5분 동안 헹군 후, 다시 오비탈 쉐이커에서 TBST로 5분 동안 헹굽니다. 다음으로, 헹구지 않은 상태로 막을 블로킹 용액에 넣고 오비탈 쉐이커에서 1시간 동안 반응시킵니다. 이후 블로킹 용액에 1:1000에서 1:5,000 비율로 희석한, A beta 및 터미널 영역에 특이적인 1차 항체 six E 10이 들어 있는 디시에 막을 옮깁니다.실온의 오비탈 셰이커에서 1시간 동안 배양한 후, 4°C에서 셰이킹하며 24~48시간 동안 배양하십시오. 빠르게 한 번 헹군 후, 멤브레인을 30분 동안 세척하십시오. TBST를 사용하여 오비탈 셰이커에서 10분씩 세 번 더 헹굽니다.블로킹 용액에 1:10,000 비율로 희석한 HRP 접합 2차 항체에 멤브레인을 넣고, 상온의 쉐이커에서 90분 동안 반응시킵니다. 본 프로토콜에서는 sheep anti-US 항체를 사용합니다. 다시 멤브레인을 TBST로 30분 동안 세척하는데, 먼저 빠르게 한 번 헹군 후 오비탈 쉐이커에서 10분씩 세 번 세척합니다.마지막 세척 후, 갓 제조한 희석되지 않은 super signal West Pico ECL 시약에 멤브레인을 5분 동안 배양합니다. 높은 RPM의 쉐이커에서 멤브레인을 꺼내 과잉 시약을 털어냅니다. 보풀 없는 필터 페이퍼나 Kim wipes를 사용하여, 플라스틱 보호 시트 사이에 멤브레인을 놓고 필름 카세트에 넣은 다음, 먼지가 없는 Kim wipes로 추가적인 super signal 시약을 닦아냅니다.필요한 경우, 30초 간격으로 최대 30분까지 Kodak Biomax MR.Film에 노출시킨 후 필름 현상액에서 현상합니다. 이 실험에서 5분 후에는 A beta 단량체 밴드가 포화될 가능성이 높습니다. 7명의 피험자로부터 얻은 총 단백질 50 micrograms가 포함된 정제된 균질액을 사용하여 다량체 beta amyloid 또는 a beta 및 amyloid precursor protein 또는 a PP(A beta 펩타이드가 절단되는 transmembrane protein)의 존재 여부를 분석하였습니다.여기 A beta a PP 웨스턴 블롯 실험의 30분 및 5분 노출 대표 이미지를 보여줍니다. 30분 노출 시에는 훨씬 희미한 Abeta의 이량체(dimer), 삼량체(trier), 사량체(tetramer) 및 더 높은 분자량 또는 리간드 밴드를 시각화할 수 있으나, 5분 노출 시간의 다른 레인들은 과노출됩니다. 동일한 사량체 밴드가 존재하지만 희미하게 나타나며, 이를 통해 다른 레인들을 명확하게 시각화할 수 있습니다.1번에서 3번 레인에서는 알츠하이머병(AD) 환자의 피질 균질액이 확인되며, 4번 레인에서는 루이소체 치매(DLB) 및 알츠하이머병으로 진단된 인간 피험자가, 5번과 6번 레인에서는 루이소체 치매 사례가, 그리고 7번 레인에서는 치매가 없는 고령의 인간 대조군 사례가 확인됩니다. 항체 6C10을 이용한 면역 블로팅 결과, 모든 알츠하이머 사례에서 Aβ 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 및 APP가 검출되었으며, 두 건의 AD 사례에서는 고분자량의 Aβ 다량체가 풍부하게 나타났습니다. 이는 인간 피험자 간의 Aβ 응집 양상의 이질성을 나타냅니다.오른쪽 레인의 beta 40은 저분자량 밴드의 정체를 확인시켜 줍니다. 지금까지 신경퇴행성 질환 환자의 뇌에서 얻은 비고정 조직 균질액 내의 beta 멀티머를 확인하기 위한 SDS page Western body 실험을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 함량이 낮은 Abeta 멀티머를 검출하기 위해서는 젤 전기영동으로 분리할 수 있도록 고농도의 피질 균질액을 준비하는 것이 중요합니다.Abeta 펩타이드 항체를 이용한 면역 블로팅 전에 열 유도 항원 에피토프 회복을 수행하는 것 또한 중요합니다. 항원 회복은 가려진 Abeta 에피토프를 드러내어 면역 블로팅 과정 중 항체의 결합이 최적화되도록 돕습니다. 100°C를 유지할 수 있는 증기 발생기, 전자레인지 또는 항온 수조라면 무엇이든 사용 가능합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

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다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

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