인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

본 프로토콜은 인간 피질 조직 내의 beta malters 검출을 가능하게 합니다. 먼저 균질화된 조직을 프로브 초음파 처리하고 저속 원심분리를 통해 청징화합니다. 다음으로 SDS 버퍼에서 끓여 환원시킨 샘플을 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩합니다.

겔 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전이시킨 후, 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)에서 막을 증기로 가열합니다. 마지막으로 궤도 쉐이커(orbital shaker) 위에서 막을 1차 항체, HRP 결합 2차 항체 순으로 하룻밤 동안 인큐베이션하고, x-ray 필름에 노출시키기 전 루미날 과산화물 시약(luminal peroxide reagent)으로 처리합니다. 안녕하세요, 저는 에모리 대학교 예르케스 국립 영장류 연구 센터 신경과학과의 Larry Walker 교수님 연구실 소속 Rebecca Rosen입니다.

오늘은 열 유도 항원 회복법을 이용한 SDS 겔 전기영동 및 면역 블로팅을 통해 Abeta 다량체와 피질 균질물을 검출하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 사용하여 알츠하이머병 환자의 인간 및 고령의 비인간 영장류에서 유래한 비고정 피질 조직 내 서로 다른 Abeta 다량체의 수준과 분포를 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.

고정되지 않은 피질 조직 약 100mg을 준비하고, 얼음처럼 차가운 버퍼 약 400µL에서 페스틀로 약 30회 균일하게 스트로크하여 균질화합니다. 중량 대 부피 비율(w/v) 20%를 기준으로, 조직 무게 대 버퍼 부피의 비율은 1mg당 4µL가 되어야 합니다. 균질화 후 균질물을 4mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 출력 5에서 5초간 3회 프로브 초음파 처리(probe sonicate)합니다.

초음파 처리를 마친 후 균질액을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 3000 G에서 5분 동안 원심분리하십시오. 투명해진 상층액을 조심스럽게 제거하고, 이 추출액을 50 microliter씩 분주하여 사용 시까지 minus 80 degrees Celsius에서 보관하십시오. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 bio acid 또는 BCA assay를 사용하여 갓 해동한 투명 균질액 분주액의 총 단백질 농도를 측정하십시오. 투명해진 20% 피질 균질액의 단백질 농도는 5 micrograms per microliter보다 높아야 하며, 따라서 플레이트 리더의 측정 범위 내에 들어오도록 1:10으로 희석할 수 있습니다. BCA assay를 위해, 동일한 투명 균질액 분주액으로 변성 시료 반응액을 준비하십시오.

총 단백질을 약 50에서 60 µg 사용하고, 각각 동일한 총 단백질을 포함하도록 피질 균질액의 부피를 적절히 조절하십시오. 실행할 각 10~20% trice gel에 대해 샘플의 총 부피를 25 µL로 준비하십시오. 각 젤에 대해, 1X PBS에 희석한 10~100 ng의 합성 a beta 40 또는 a beta 42 펩타이드 10 µL, 2X SDS 샘플 버퍼 12.5 µL, 그리고 10x 환원제 2.5 µL를 혼합하여 양성 대조군을 준비하십시오.

베타 컨트롤을 포함한 모든 샘플을 준비한 후, 5~10초 동안 볼텍싱하고 100 °C의 드라이 배스에서 5분 동안 가열한 다음, 모든 튜브를 빠르게 원심 분리하여 캡의 응축수를 제거합니다. Tris-SDS 러닝 버퍼에 담긴 젤 박스의 젤에 샘플을 로딩하고, 최소 한 개의 웰에 희석하지 않은 분자량 마커 10 µL를 로딩합니다. 125 V의 정전압에서 약 90분 동안 또는 4 kDa 마커가 젤 바닥에서 약 1 cm 거리까지 내려올 때까지 젤을 전기영동합니다.

플라스틱 케이스에서 젤을 조심스럽게 꺼낸 후, 제조사의 지침에 따라 트랜스퍼 샌드위치를 조립합니다. 블로팅 패드와 마이크로미터 니트로셀룰로스 멤브레인을 tris glycine 트랜스퍼 버퍼로 미리 적시고, 블로팅 패드나 필터 페이퍼 멤브레인 샌드위치에서 기포를 모두 제거합니다.

전이 장치의 내부 챔버를 전이 버퍼로 채우고 외부 챔버를 증류수로 채웁니다. 25 mA의 일정 전류에서 2~3시간 동안 전이를 수행합니다. 전이가 완료되면 샌드위치 구조를 해체하고, 겔은 증류수가 담긴 접시에, 막은 모든 프로토콜 단계에 사용되는 1X PBS가 담긴 접시에 각각 넣습니다.

겔과 멤브레인이 건조되는 것을 방지하기 위해 액체로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 단백질 전이 효율을 시각화하려면 겔을 희석하지 않은 Simply Blue Safe 스테인으로 약 1시간 동안, 멤브레인을 1x PON S red 스테인으로 약 5분 동안 염색하십시오. 배양 시간은 제조사의 지침에 따르며, 이 염색 과정은 면역 블로팅(immuno blotting)에 영향을 주지 않습니다.

염색 결과 단백질 전이가 효율적이지 않은 것으로 나타나면, 항원 회복을 위해 3단계의 전이 시간을 수정하십시오. 실온의 1x PBS 약 50 mL를 채운 고강도 CapEx 플라스틱 파우치에 멤브레인을 넣고 열 밀봉합니다. 파우치를 100 °C로 예열된 스티머에 평평하게 놓고, 파우치가 팽창하기 시작하면 15분 동안 추가로 배양한 후 스티머에서 꺼내십시오.

실온에서 막이 과도하게 구겨지는 것을 방지하기 위해, 파우치에서 꺼내기 전 막을 천천히 식힙니다. 파우치에서 막을 조심스럽게 꺼내어 오비탈 쉐이커에서 XPBS로 5분 동안 헹군 후, 다시 오비탈 쉐이커에서 TBST로 5분 동안 헹굽니다. 다음으로, 헹구지 않은 상태로 막을 블로킹 용액에 넣고 오비탈 쉐이커에서 1시간 동안 반응시킵니다. 이후 블로킹 용액에 1:1000에서 1:5,000 비율로 희석한, A beta 및 터미널 영역에 특이적인 1차 항체 six E 10이 들어 있는 디시에 막을 옮깁니다.

실온의 오비탈 셰이커에서 1시간 동안 배양한 후, 4°C에서 셰이킹하며 24~48시간 동안 배양하십시오. 빠르게 한 번 헹군 후, 멤브레인을 30분 동안 세척하십시오. TBST를 사용하여 오비탈 셰이커에서 10분씩 세 번 더 헹굽니다.

블로킹 용액에 1:10,000 비율로 희석한 HRP 접합 2차 항체에 멤브레인을 넣고, 상온의 쉐이커에서 90분 동안 반응시킵니다. 본 프로토콜에서는 sheep anti-US 항체를 사용합니다. 다시 멤브레인을 TBST로 30분 동안 세척하는데, 먼저 빠르게 한 번 헹군 후 오비탈 쉐이커에서 10분씩 세 번 세척합니다.

마지막 세척 후, 갓 제조한 희석되지 않은 super signal West Pico ECL 시약에 멤브레인을 5분 동안 배양합니다. 높은 RPM의 쉐이커에서 멤브레인을 꺼내 과잉 시약을 털어냅니다. 보풀 없는 필터 페이퍼나 Kim wipes를 사용하여, 플라스틱 보호 시트 사이에 멤브레인을 놓고 필름 카세트에 넣은 다음, 먼지가 없는 Kim wipes로 추가적인 super signal 시약을 닦아냅니다.

필요한 경우, 30초 간격으로 최대 30분까지 Kodak Biomax MR.Film에 노출시킨 후 필름 현상액에서 현상합니다. 이 실험에서 5분 후에는 A beta 단량체 밴드가 포화될 가능성이 높습니다. 7명의 피험자로부터 얻은 총 단백질 50 micrograms가 포함된 정제된 균질액을 사용하여 다량체 beta amyloid 또는 a beta 및 amyloid precursor protein 또는 a PP(A beta 펩타이드가 절단되는 transmembrane protein)의 존재 여부를 분석하였습니다.

여기 A beta a PP 웨스턴 블롯 실험의 30분 및 5분 노출 대표 이미지를 보여줍니다. 30분 노출 시에는 훨씬 희미한 Abeta의 이량체(dimer), 삼량체(trier), 사량체(tetramer) 및 더 높은 분자량 또는 리간드 밴드를 시각화할 수 있으나, 5분 노출 시간의 다른 레인들은 과노출됩니다. 동일한 사량체 밴드가 존재하지만 희미하게 나타나며, 이를 통해 다른 레인들을 명확하게 시각화할 수 있습니다.

1번에서 3번 레인에서는 알츠하이머병(AD) 환자의 피질 균질액이 확인되며, 4번 레인에서는 루이소체 치매(DLB) 및 알츠하이머병으로 진단된 인간 피험자가, 5번과 6번 레인에서는 루이소체 치매 사례가, 그리고 7번 레인에서는 치매가 없는 고령의 인간 대조군 사례가 확인됩니다. 항체 6C10을 이용한 면역 블로팅 결과, 모든 알츠하이머 사례에서 Aβ 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 및 APP가 검출되었으며, 두 건의 AD 사례에서는 고분자량의 Aβ 다량체가 풍부하게 나타났습니다. 이는 인간 피험자 간의 Aβ 응집 양상의 이질성을 나타냅니다.

오른쪽 레인의 beta 40은 저분자량 밴드의 정체를 확인시켜 줍니다. 지금까지 신경퇴행성 질환 환자의 뇌에서 얻은 비고정 조직 균질액 내의 beta 멀티머를 확인하기 위한 SDS page Western body 실험을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 함량이 낮은 Abeta 멀티머를 검출하기 위해서는 젤 전기영동으로 분리할 수 있도록 고농도의 피질 균질액을 준비하는 것이 중요합니다.

Abeta 펩타이드 항체를 이용한 면역 블로팅 전에 열 유도 항원 에피토프 회복을 수행하는 것 또한 중요합니다. 항원 회복은 가려진 Abeta 에피토프를 드러내어 면역 블로팅 과정 중 항체의 결합이 최적화되도록 돕습니다. 100°C를 유지할 수 있는 증기 발생기, 전자레인지 또는 항온 수조라면 무엇이든 사용 가능합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.