인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

이 프로토콜은 인간 피질 조직에서 베타 malter를 검출할 수 있습니다. 첫째, 균질화된 조직은 저속 원심분리에 의해 프로브를 초음파 처리하고 정화합니다. 다음으로 SDS 완충액에서 끓인 환원 샘플을 폴리 아크릴아미드에 적재합니다.

겔 단백질은 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달되고 멤브레인은 인산염 완충 식염수에서 증기로 가열됩니다. 마지막으로, 오비탈 쉐이커에서 멤브레인을 1차 항체 HRP 접합 2차 항체에서 하룻밤 동안 배양한 다음 X선 필름에 노출되기 전에 루미널 퍼옥사이드 시약으로 배양합니다. 안녕하세요, 저는 에모리 대학의 여크스 국립 영장류 연구 센터 신경과학과 래리 워커 연구실의 레베카 로젠입니다.

오늘 우리는 열 유도 항원 검색과 함께 SDS 겔 전기 영동 및 면역 블로팅을 사용하여 Abeta 다중체 및 피질 균질성을 검출하는 방법을 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 알츠하이머병을 앓고 있는 인간의 고정되지 않은 피질 조직에서 뚜렷한 Abeta 다량체의 수준과 분포를 연구하고 인간이 아닌 영장류의 나이를 측정합니다. 시작하겠습니다.

약 100 밀리그램의 고정되지 않은 피질 조직으로 시작하여 약 400 마이크로 리터의 얼음 차가운 완충액에서 약 30 번의 절굿공이 스트로크로 균질화됩니다. 부피 당 20%weight를 위해, 완충기 부피 비율에 조직 무게는 1 밀리그램에서 4 마이크로리터이어야 합니다. 균질화 후 4 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 균질화하고 프로브를 3 번 5 번 5 번 5 번 초음파 처리합니다.

초음파 처리 후 균질화 균질화를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 3000 G에서 5 분 동안 회전하여 정화 된 상층액을 조심스럽게 제거하고 이러한 추출물의 50 마이크로 리터 분취액을 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 바이오 산 또는 BCA 분석을 사용하여 갓 해동한 정제된 균질액의 분취액에 대한 총 단백질 농도를 측정합니다: 20% 피질 균질액은 마이크로리터당 5마이크로그램 이상의 단백질 농도를 가져야 하므로 1에서 10으로 희석하여 플레이트 리더 범위 내에 둘 수 있습니다. BCA 분석의 경우, 동일한 정화된 균질액의 분취량으로 변성 시료 반응을 준비합니다.

대략 50-60 마이크로그램의 총 단백질을 사용하고 그에 따라 피질 균질체의 부피를 조정하여 각각이 동일한 총 단백질을 포함하도록 합니다. 실행할 각 10-20%트리스 젤에 대해 총 25마이크로리터의 샘플로 샘플을 준비합니다. 각 겔에 대해 10-10 μm의 합성 베타 40 또는 베타 42 펩타이드를 12.5 마이크로 리터의 2 개의 XSDS 샘플 버퍼와 2.5 마이크로 리터의 10 x 환원제로 10 마이크로 리터로 희석하여 10-100 나노그램의 양성 대조군을 준비합니다.

베타 제어 와류를 포함한 모든 샘플을 5-10초 동안 준비하고 섭씨 100도의 건조한 수조에서 5분 동안 가열한 다음 모든 튜브를 빠르게 회전시켜 캡의 응결을 제거합니다. 젤 상자의 트리스 SDS 러닝 버퍼에 담근 겔에 샘플을 로드하고 10마이크로리터의 희석되지 않은 분자량 마커를 하나 이상의 웰에 로드합니다. 125볼트의 일정한 전압에서 약 90분 동안 또는 4킬로 달튼 마커가 젤 바닥에서 약 1cm 떨어질 때까지 젤을 실행합니다.

플라스틱 케이스에서 젤을 조심스럽게 제거하고 제조업체의 지침에 따라 전사 샌드위치를 조립합니다. 블로팅 패드를 미리 적시고 트리스 글리신으로 마이크로미터 니트로셀룰로오스 멤브레인을 가리킵니다. 버퍼를 옮기고 블로팅 패드 또는 여과지 멤브레인 샌드위치에서 기포를 제거합니다.

이송 장치의 내부 챔버에 전달 버퍼를 채우고 외부 챔버를 증류수로 채웁니다. 25밀리암페어의 일정한 암페어에서 2-3시간 동안 전송을 실행합니다. 전달이 완료되면 샌드위치를 분해하고 모든 프로토콜 단계에서 증류수가 채워진 접시에 젤을 넣고 멤브레인을 하나의 XPBS로 채워진 접시에 넣습니다.

건조를 방지하기 위해 젤과 멤브레인이 액체로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 단백질 전달 염색 젤의 효율성을 시각화하기 위해 희석되지 않은 파란색 안전 염색으로 약 1시간의 배양 시간 동안 그리고 멤브레인을 1개의 PON S 빨간색 염색으로 약 5분 동안 사용할 수 있습니다. 배양 시간 제조업체의 지침에 따라 이 염색은 면역 블로팅을 방해하지 않습니다.

염색 결과 비효율적인 단백질 전달이 드러나면 항원 회수를 위해 3단계에서 전달 시간을 수정합니다. 찜기에서는 실온에서 약 50ml의 1 XPBS로 채워진 견고한 CapEx 플라스틱 파우치에 멤브레인을 열 밀봉합니다. 파우치가 팽창하기 시작하면 섭씨 100도로 예열된 찜기에 파우치를 평평하게 놓고 찜기에서 꺼내기 전에 추가로 15분 동안 배양합니다.

실온에서 과도한 주름을 방지하기 위해 파우치에서 멤브레인을 꺼내기 전에 멤브레인을 천천히 식히십시오. 파우치에서 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 멤브레인을 5분 동안 헹구고 오비탈 쉐이커에서 XPBS를 한 번 헹군 다음 오비탈 쉐이커에서 TBST를 5분 동안 헹굽니다. 다음으로, 헹구지 않고 궤도 셰이커에 1 시간 동안 막을 막는 배양하고, 막는 해결책에서 1에서 1000에서 1에서 5, 000 묽게 된 A beta와 끝 지구에 특이적인 1 차적인 항체 6 E 10를 포함하는 접시에 막을 옮깁니다.

실온에서 오비탈 쉐이커로 1시간 동안 배양한 다음 섭씨 4도에서 쉐이킹하면서 24-48시간 동안 배양합니다. 한 번의 빠른 헹굼 후 30분 동안 멤브레인을 세척합니다. TBST에서는 오비탈 셰이커로 10분간 3회 헹굽니다.

HRP에 의하여 활용된 2차 항체에 있는 막을 1개에서 10에 묽게 하십시오, 실내 온도에 셰이커에 90 분 동안 막는 해결책에서 000. 이 프로토콜에서는 양 항미 항체를 사용합니다. 다시 TBST에서 30분 동안 멤브레인을 헹굽니다.한 번의 빠른 헹굼으로 시작하여 궤도 셰이커에서 10분 동안 세 번 헹굽니다.

마지막 헹굼 후, 갓 만든 희석되지 않은 Super Signal West Pico ECL 시약에 멤브레인을 5분 동안 배양합니다. 높은 RPM의 셰이커에서 멤브레인을 제거하고 여분의 시약을 치실로 제거합니다. 보푸라기가 없는 여과지 또는 킨 와이프를 사용하여 멤브레인을 플라스틱 시트 보호기 사이의 필름 카세트에 넣고 먼지가 없는 Kim 물티슈로 추가 슈퍼 신호 시약을 닦아냅니다.

필요한 경우 코닥 바이오맥스 MR에 노출시킵니다. 30초, 최대 30분 간격으로 촬영하고 필름 현상액에서 현상합니다. 5분 후, A 베타 단량체 띠는 아마도 이 실험에서 포화될 것입니다. 7명의 인간 피험자로부터 얻은 총 단백질 50마이크로그램을 포함하는 명확한 균질산염을 다중체 베타 아밀로이드 또는 베타 및 아밀로이드 전구체 단백질 또는 PP(A 베타 펩타이드가 절단되는 막관통 단백질)의 존재 여부에 대해 분석했습니다.

여기에서는 30분 및 5분 노출에서 A 베타 PP 웨스턴 블롯 실험의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 30분 노출은 Abeta의 훨씬 더 가벼운 이량체, 트리어, 사합체 및 더 높은 분자량 또는 인대 밴드를 시각화할 수 있지만 5분 노출 시간에 다른 레인을 과도하게 노출합니다. 동일한 사합체 대역이 존재하지만 희미하며 다른 레인을 명확하게 시각화할 수 있습니다.

알츠하이머병 또는 알츠하이머병을 앓고 있는 피험자의 피질 균질화는 1-3열에서 관찰되며, 생체 또는 DLB와 알츠하이머병을 동반한 치매 진단을 받은 인간 피험자는 4열에서 관찰되며, 루이소체를 동반한 치매 사례는 5번째와 6번째 열에서 관찰되며, 고령의 치매가 없는 인간 대조군 사례가 관찰됩니다. 7번째 레인에서 항체 6 C 10으로 꽃을 피우는 면역은 모든 알츠하이머병에서 베타 단량체, 이량체, 트리머, 사합체 및 PP를 밝혔을 뿐만 아니라 풍부한 고분자량을 나타냈습니다. beta는 두 가지 광고 사례에서 변형되는데, 이는 human subjects synthetic 사이의 beta ization의 이질성을 나타냅니다.

오른쪽 차선의 베타 40은 저분자량 밴드의 정체성을 확인합니다. 우리는 방금 SDS 페이지 서양 신체 실험을 보여 주어 신경 퇴행성 질환을 앓고있는 인간의 뇌에서 고정되지 않은 조직 균질체의 베타 다량체를 식별했습니다. 이 절차를 수행할 때, 더 낮은 존재비 Abeta malters를 밝히기 위해 겔 전기영동에 의한 분리를 위해 균일한 고농도 피질을 준비하는 것이 중요합니다.

또한 Abeta 펩타이드에 대한 항체로 면역 블롯팅을 하기 전에 열 유도 항원 에피토프를 회수하는 것도 중요합니다. 항원 검색은 면역 블로팅 중 최적의 항체 결합을 위해 가려진 Abeta 에피토프를 밝히는 데 도움이 됩니다. 섭씨 100도를 유지하는 모든 찜기, 전자레인지 또는 수조로 충분합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.