든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법
2007년 4월 29일
이 비디오는 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (든 - MS)에 의해 펩티드와 단백질 분석을위한 울트라 얇은 매트릭스 / analyte 레이어의 준비를 보여줍니다.
단백질의 정확한 질량 결정에 특히 유용한 초박층법(ultra thin layer method)에 관한 CHI Lab 튜토리얼에 오신 것을 환영합니다. 질량 분석법의 민감한 특성 때문에, 플레이트를 세척할 때는 HPLC 등급의 시약과 분말이 없는 라텍스 또는 니트릴 장갑만을 사용합니다. 메탄올과 물로 교대로 헹군 후, 마지막으로 다시 메탄올로 헹굽니다.
각 세척 단계 사이에 렌즈 티슈를 사용하여 과잉 용매를 부드럽게 닦아냅니다. 깨끗한 플레이트를 얻을 때까지 이러한 세척 단계를 필요한 만큼 반복할 수 있습니다. 세척 후 건조가 완료된 플레이트는 즉시 사용해야 합니다.
깨끗한 MALDI 플레이트에 20~30 µL의 박층 기질 용액을 도포하고 펼쳐줍니다. 이때 P250 피펫 팁을 사용하여 플레이트에 흠집이 나지 않도록 주의하면서 용액을 고르게 펼칩니다. 박층이 건조되는 동안, 남아 있는 물방울이 있다면 킴와이프로 가볍게 닦아내어 제거합니다.
그 다음, 얇은 층이 제대로 형성되도록 킴와이프로 플레이트를 한 번의 매끄러운 동작으로 부드럽게 닦아냅니다. 마지막으로, 질량 분석기가 오염되는 것을 방지하기 위해 플레이트의 가장자리를 깨끗이 닦습니다. 샘플을 도포하기 전에 얇은 층을 테스트하는 것이 매우 중요합니다.
결정이 균일하게 나타나지 않을 정도로 테스트 지점이 건조되는 데 너무 오랜 시간이 걸린다면, 문제는 박층 자체나 매트릭스 용액에 있을 수 있으므로 플레이트를 세척하고 박층을 다시 도포한 후 재시험하십시오. 박층에 점적할 때, 점적된 부위가 완전히 증발하여 마르게 해서는 안 됩니다. 대신, 결정화가 느려지거나 멈추면 과잉 용매를 제거하십시오.
진공 흡입기를 사용하십시오. 염 및 세제와 같은 오염 물질의 존재뿐만 아니라 높은 분석물 농도는 결정화에 방해가 될 수 있습니다. 샘플을 추가로 희석하면 결정화가 개선될 수 있습니다. 샘플과 근접한 위치에 Ants를 배치하십시오. 이렇게 하면 플레이트를 샘플 지점에서 보정 지점으로 이동시켜 유사 내부 보정을 수행할 수 있습니다.
시료 수집 과정에서 CAS의 레이저 샷을 스펙트럼에 몇 차례 추가함으로써, 이 방법은 외부 보정만 사용할 때보다 더 높은 질량 정확도 보정을 보장합니다. 분석물 이온화에 방해가 될 수 있는 염이나 세제와 같은 오염 물질을 씻어내는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 HPLC 등급의 물에 0.1% Trifluoroacetic acid를 섞어 얼음처럼 차갑게 만든 후 스팟 위에 직접 떨어뜨립니다.
여기에 표시된 것처럼 진공 흡입기를 사용하여 세척액을 제거하십시오. 이 방법은 막 단백질과 수용성 단백질 모두에 대해 우수한 스펙트럼을 생성합니다.
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개요
본 영상에서는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석법(MALDI-MS)을 이용해 펩타이드와 단백질을 분석하기 위한 초박형 매트릭스/분석물 층의 준비 과정을 보여줍니다. 이 방법은 단백질의 정확한 질량 결정을 위해 필수적입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 질량 분석법
- 단백질 분석
- 분석 화학
배경
- 질량 분석법은 생체 분자를 분석하는 민감한 기술입니다.
- 정확한 결과를 얻기 위해서는 샘플 플레이트 준비가 매우 중요합니다.
- 세척 시에는 HPLC 등급의 시약을 사용하는 것이 권장됩니다.
- 적절한 취급 및 세척 기술을 통해 분석의 품질을 높일 수 있습니다.
연구 목적
- MALDI-MS를 위한 초박층(ultra-thin layer) 방법을 시연합니다.
- 단백질의 정확한 질량 분석을 보장합니다.
- 시료 준비의 최적 실무 지침에 대한 튜토리얼을 제공합니다.
사용된 방법
- HPLC 등급 시약 사용.
- 메탄올과 물을 이용한 플레이트 세척.
- 렌즈 페이퍼로 과잉 용매 닦아내기.
- 세척한 플레이트를 분석에 즉시 사용.
주요 결과
- 샘플 플레이트의 효과적인 세척 방법을 시연하였습니다.
- 적절한 재료 사용의 중요성을 강조하였습니다.
- 초박층 준비 단계를 보여주었습니다.
- 샘플 무결성 유지에 대한 통찰력을 제공하였습니다.
결론
- 초박막 층 방법은 정확한 질량 분석법을 위해 매우 중요합니다.
- 적절한 세척 및 준비 기술이 필수적입니다.
- 최적의 실무 지침을 따르면 분석 결과가 크게 향상될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
단백질의 정확한 질량 측정은 초기 발견 단계에서 표적 검증 및 리드 물질 식별에 매우 중요합니다. 초박막 층 MALDI 시료 준비법은 불순물에 대한 내성과 공간적 균일성을 향상시켜 데이터 품질을 높이며, 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 지원합니다. 이 방법은 단백질 특성 분석에 있어 예측 신뢰도를 높여 전임상 모델 선택 시 기전적 모호성을 줄여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 단백질의 정확한 질량 결정을 가능하게 하여, 치료 가설 검증 및 기능적 타겟 확인을 지원합니다.
- 운영적 가치: 염 및 계면활성제에 대한 내성이 더 높아, 불순물이 포함되기 쉬운 샘플에서의 위음성 결과를 줄여줍니다.
- 예측적 가치: 해상도와 공간적 균일성을 개선하여, 단백질의 정체 및 변형 상태에 대한 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 과학적 가치: 분석법 표준화 및 정량적 판독 일관성에 필수적인 고품질의 재현 가능한 스펙트럼을 생성합니다.
- 운영적 가치: 고처리량 스크리닝 환경에 적합한 간단하고 견고한 단계를 사용합니다.
- 확장성: 후속 워크플로우를 위한 검증된 샘플 플레이트 준비를 가능하게 하여, 여러 프로젝트에 걸쳐 플랫폼 재사용을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 막 단백질과 수용성 단백질 모두의 분석을 지원하여 질병 관련 시스템 특성 분석을 가능하게 합니다.
- 기전적 리스크 감소: 광범위한 질량 범위(최대 380 kDa)의 단백질에 대한 정확한 질량 측정을 용이하게 하여 리드 최적화를 돕습니다.
- 전임상 모델 일치: 이온 채널, 운반체 및 수용체에 적용 가능하며, 생리학적으로 관련성이 높은 모델에서의 타겟 검증을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
초박막 층 방법은 초기 표적 검증부터 선도 물질 발굴, 전임상 프로파일링에 이르는 발견 연속 체계에 적합하며, 각 단계에서 신뢰할 수 있는 단백질 분석을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 단백질 식별 및 특성 분석을 위한 정확한 질량 데이터를 제공하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 어세이 개발 과정에서 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 하는 재현 가능한 정량적 결과물을 제공합니다.
- 분석학: 공간적 균일성을 갖춘 고해상도 질량 분석 스펙트럼을 생성하여 조건 간 데이터 비교 가능성을 향상시킵니다.
- 중개 연구: 다양한 시료 유형 전반에 걸쳐 일관된 단백질 질량 분석을 수행함으로써 발견 단계와 전임상 단계의 연속성을 연결합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 단백질 클래스와 프로젝트에 적용 가능한 표준화되고 강력한 시료 조제 역량을 나타냅니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 단백질 질량 측정의 예측 신뢰도 향상, 표적 검증 시 기전적 모호성 감소.
- 운영적 가치: 표준화, 재현성 및 염이나 계면활성제와 같은 일반적인 오염 물질에 대한 내성 확보.
- 전략적 가치: 개선된 데이터 품질을 통한 더 나은 go/no-go 결정, 후기 단계의 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: 신뢰할 수 있는 단백질 특성 분석 데이터를 기반으로 한 리스크 조정 우선순위 설정.
실행 시 고려 사항
- 질량 분석 시료 처리 및 MALDI-MS 원리에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- HPLC 등급 시약, 진공 흡입기 및 MALDI 호환 플레이트에 대한 접근이 필요합니다.
- 층의 균일성을 보장하기 위해 표준화된 세척 및 건조 절차가 요구됩니다.
- 다양한 분석물 농도 및 시료 매트릭스에 따른 최적화가 필요합니다.
- 재오염을 방지하기 위해 세척 후 즉시 플레이트를 사용해야 한다는 제약이 있습니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
