Name: 든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 배우세요 MALDI-MS를 위한 울트라 씬 레이어 샘플 준비 방법으로 단백질의 정확한 질량 측정을 수행합니다. HPLC 등급 시약과 메탄올 세척을 통해 신뢰할 수 있는 분석 결과를 얻을 수 있습니다.

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그것은 얇은 레이어의 준비 기간 동안 가루없는 장갑을 착용하는 것은 매우 중요합니다. 샘플 판의 청소 <ol><li> 스테인리스 스틸 또는 금색 든 샘플 판을 사용하십시오. </li><li> MeOH로 세척하고 Kimwipe로 부드럽게 닦으십시오. 표면 긁힘 방지하기 위해, Kimwipe로 표면을 문질러거나 문지르지 마십시오. </li><li> H 2 O로 씻고 Kimwipe로 부드럽게 닦으십시오. </li><li> MeOH로 세척하고 Kimwipe로 부드럽게 닦으십시오. </li><li> 필요한 경우, 항상 MeOH로 끝나는, MeOH / H 2 O / MeOH 청소주기를 반복합니다. </li><li> 접시에 남은 귀신 명소이나 잔여물이 없는지 확인합니다. 귀신 장소가있다면 귀하의 장갑 낀 손으로 (Kimwipes와 함께 비벼하지 마십시오)와 표면을 마찰하면서, 탈이온수와 접시를 씻어. MeOH / H 2 O / MeOH 청소주기를 반복합니다. </li><li> 즉시 세척 후 접시를 사용합니다. </li></ol> 얇은 레이어 기판 솔루션의 준비 <ol><li> 포화 4 - HCCA (2 부품 ACN, 1 일부 물, 0.1 % 최종 TFA) 3 부품 이소프로판올 1 부분을 섞는다. 참고 : 얇은 레이어 기판 솔루션은 매우 안정이며, 년간 어둠 속에 상온에서 보관하실 수 있습니다. 또한 4 저장될 수 있습니다 ° C. </li></ol> 얇은 레이어 기판 만들기 <ol><li> 접시의 왼쪽 중심과 피펫 팁의 측면과 확산에 얇은 레이어 기판 솔루션의 20 50μL을 적용합니다. 한 방향으로 지나간다. </li><li> 솔루션 마르면 매우 빠르게 유기 용매 증발이 접시의 표면에 물이 방울 분 뒤에 출발로. 이 시점에서, Kimwipe의 플라이와 처음 부드럽게와 접시의 표면을 얼룩으로 집게 손가락을 포장. </li><li> 표면이 물방울에서 해방되면 Kimwipe를 사용하여 단일 방향 전면 대응으로 전체 접시를 닦으십시오. 참고 :이 솔루션은 강판의 표면에 걸쳐 충분히 확산하지 않는 경우, ACN 구성을 향상시키고 얇은 레이어를 재현. 솔루션의 확산에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 매개 변수가 주변 습도 및 온도를 포함합니다. 참고 : 골드 플레이트, 레이어는 일반적으로 보는 가벼운 각도에 따라 노란 반영으로 나타납니다. 강판으로 레이어만을 가장자리가 정상적으로 표시됩니다. </li><li> 악기를 오염으로부터 행렬을 방지하기 위해 접시 홀더에 넣어 전에 신선한 Kimwipe으로 접시의 가장자리를 청소합니다. </li></ol> 매트릭스 솔루션의 준비 <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">4 HCCA 포화</a> FWI에서 (개미의 산 세 부분, 1 일부 물, 2 부품 이소프로판올) 막과 가용성 단백질을 모두 분석을 권장합니다. 매우 소수성 큰 펩티드 (M&gt; 4000 U)의 분석을 위해 특별한 경우에도 사용할 수 있습니다. 완전히 방식의 장점을 물리 치고, 얇은 레이어 기판을 분해하므로 단백질을 찾을 때 사용되는 매트릭스 솔루션 ~ 50% 유기 콘텐츠를 초과하지 않는지 확인하십시오. </li></ol> 얇은 레이어 기판의 시험 <ol><li> 접시에 매트릭스 솔루션의 스팟 0.5μL. 약간 흰 침전물은 얇은 레이어와 비말 사이의 인터페이스에 나타납니다. 이 계층은 완전히 비말의 바닥을 커버하는 경우, 보통 10~15초 내에 진공 라인과 초과 액체를 대기음. 그것이 형태로 침전, 30 초 이상 걸린다면, 그것은 얇은 레이어 기판 및 / 또는 매트릭스 솔루션에 문제가있을 수도 표시됩니다. </li></ol> 샘플 응용 프로그램 <ol><li> 시작 솔루션에 analyte 농도는 10 1000μM 이내에해야합니다. </li><li> 0.2과 2μM 사이에 최종 analyte 농도에 매트릭스 솔루션에 analyte 솔루션을 희석. 예를 들어, 샘플 및 매트릭스 솔루션의 9​​μl의 1μl로 시작합니다. 참고 : 매트릭스가 최종 솔루션에 포화되는 가까운 거리에 있는지 확인하십시오, 그렇지 않으면 당신은 얇은 레이어 기판 redissolve 것입니다. 참고 : 품위있는 신호를 얻기 위해 필요한 Analyte의 농도는 솔루션의 복잡 및 구성 (예 : 오염 물질) 및 analyte의 ionizability에 크게 의존하고 있습니다. 참고 : 단일 단계 희석 좋은 결과를 얻을 수 없다면, 당신이 다른 희석 단계를 시도해야합니다. 카운터 - 직관적이지만, 고농도 analyte 솔루션은 거의 좋은 스펙트럼을 생산하지 않습니다. 참고 : 막 단백질은 일반적으로 큰 dilutions을 필요로합니다. </li><li> 접시 샘플 / 매트릭스 혼합물 스팟 0.5μl. 약간 흰 침전물은 얇은 레이어와 비말 사이의 인터페이스에서 양식됩니다. 이 침전물은 매트릭스와 analyte의 cocrystallization입니다. 이 계층은 완전히 비말의 바닥을 커버, 우스10~15초 이내 앨리, 진공 라인과 초과 액체를 대기음. 그것이 형태로 침전, 30 초 이상 걸린다면, 그것은 결정을 방지하거나 analyte 너무 집중되는 오염 물질 현재의 표시 수 있습니다. </li></ol> Calibrant 응용 프로그램 <ol><li> 0.1 - 0.5μM 사이에 최종 calibrant 농도와 유사한 방식으로 calibrant / 매트릭스 혼합물을 준비합니다. </li><li> 샘플 명소와 근접 거리에 접시에 자리 0.5μl의 calibrant / 매트릭스 혼합물. 이것은 물리적 근접는 접시가 스펙트럼에 calibrants 몇 레이저 주사를 추가하는 샘플 수집 동안 calibrant 자리에 샘플 장소에서 이동되는 의사 내부 교정 절차에 사용됩니다. 이 방법은 외부 교정에만보다 높은 질량 정확도 교정을 보장합니다. </li></ol> 단계 워싱 <ol><li> 얼음 차가운 0.1 % TFA 수성 솔루션의 약 2μL 각 자리를 씻으십시오. 진공 라인 초과 액체를 대기음. </li></ol> 질량 스펙트럼의 취득 <ol><li> 이제 대량 스펙트럼를 얻기위한 준비가되어 있습니다. 당신이 FWI 매트릭스 솔루션을 사용하는 경우 같은 formylation로 analyte에 돌이킬 수없는 수정을 방지하기 위해 가능한 빨리, 당신은 스펙트럼을 획득해야합니다. </li></ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

그것은 모든 시약은 최고의 품질 (예 : HPLC 등급)의 것을 중요합니다. 파우더 - 무료 장갑 (라텍스 또는 nitrile) 스테인레스 스틸 또는 금색 든 샘플 플레이트 메탄올 (MeOH) 물 Kimwipes 알파 - cyano - 4 - hydroxycinnamic 산성 (4 HCCA) Trifluoroacetic 산성 (TFA) (H 2 O에서 0.1 %의 최종 농도) Acetonitrile (ACN) 개미 산성 이소프로판올

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

이 비디오는 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (든 - MS) 1, 2에 의해 펩티드와 단백질 분석을위한 울트라 얇은 매트릭스 / analyte 레이어의 준비를 보여줍니다. 울트라 씬 레이어 방법은 매트릭스 / analyte 혼합물의 후속 결정을위한 시딩 접지 역할을 샘플 접시에 매트릭스 결정의 기판 레이어의 생산 (알파 - cyano - 4 - hydroxycinnamic 산성)을 포함합니다. 다른 샘플 증착 방식 (예 : 말린 소적)을 통해 울트라 얇은 레이어 방식의 장점은 (I)과 같은 소금 및 세제, (2) 더 나은 해상도, 그리고 (iii) 이상의 공간적 균일 같은 불순물에 큰 관용을 제공하고 있습니다. 이 방법은 단백질의 정확한 질량 결정에 특히 유용합니다. 프로토콜은 초기 개발하고 막 단백질의 분석에 최적화된 성공적으로 이온 채널, 신진 대사 전송기 및 수용체를 분석하는 데 사용, 2, 12 transmembrane 도메인 2 사이 포함되었습니다. 원래 출판 이후, 그것은 또한 가용성 단백질의 분석을 위해 동등하게 유용하게 표시하고 있습니다. 사실, 우리는 380 KDA 3만큼 높은 분자 민중 포함 속성의 넓은 범위를 가지고 단백질의 다수를 위해 사용 해왔다. 그것은 현재 모든 단백질의 분자 질량 분석을 위해 선택의 방법입니다. 설명 절차는 지속적으로 고품질의 스펙트럼을 생산하고, 그것은 민감한 강력하고 쉽게 구현할 수 있습니다.

이 비디오는 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (든 - MS)에 의해 펩티드와 단백질 분석을위한 울트라 얇은 매트릭스 / analyte 레이어의 준비를 보여줍니다.

이 영상에서는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)를 통해 펩타이드와 단백질을 분석하기 위한 초박형 매트릭스/분석물 층의 준비 과정을 시연합니다.

단백질의 정확한 질량 결정에 특히 유용한 초박층법(ultra thin layer method)에 관한 CHI Lab 튜토리얼에 오신 것을 환영합니다. 질량 분석법의 민감한 특성 때문에, 플레이트를 세척할 때는 HPLC 등급의 시약과 분말이 없는 라텍스 또는 니트릴 장갑만을 사용합니다. 메탄올과 물로 교대로 헹군 후, 마지막으로 다시 메탄올로 헹굽니다.각 세척 단계 사이에 렌즈 티슈를 사용하여 과잉 용매를 부드럽게 닦아냅니다. 깨끗한 플레이트를 얻을 때까지 이러한 세척 단계를 필요한 만큼 반복할 수 있습니다. 세척 후 건조가 완료된 플레이트는 즉시 사용해야 합니다.깨끗한 MALDI 플레이트에 20~30 µL의 박층 기질 용액을 도포하고 펼쳐줍니다. 이때 P250 피펫 팁을 사용하여 플레이트에 흠집이 나지 않도록 주의하면서 용액을 고르게 펼칩니다. 박층이 건조되는 동안, 남아 있는 물방울이 있다면 킴와이프로 가볍게 닦아내어 제거합니다.그 다음, 얇은 층이 제대로 형성되도록 킴와이프로 플레이트를 한 번의 매끄러운 동작으로 부드럽게 닦아냅니다. 마지막으로, 질량 분석기가 오염되는 것을 방지하기 위해 플레이트의 가장자리를 깨끗이 닦습니다. 샘플을 도포하기 전에 얇은 층을 테스트하는 것이 매우 중요합니다.결정이 균일하게 나타나지 않을 정도로 테스트 지점이 건조되는 데 너무 오랜 시간이 걸린다면, 문제는 박층 자체나 매트릭스 용액에 있을 수 있으므로 플레이트를 세척하고 박층을 다시 도포한 후 재시험하십시오. 박층에 점적할 때, 점적된 부위가 완전히 증발하여 마르게 해서는 안 됩니다. 대신, 결정화가 느려지거나 멈추면 과잉 용매를 제거하십시오.진공 흡입기를 사용하십시오. 염 및 세제와 같은 오염 물질의 존재뿐만 아니라 높은 분석물 농도는 결정화에 방해가 될 수 있습니다. 샘플을 추가로 희석하면 결정화가 개선될 수 있습니다. 샘플과 근접한 위치에 Ants를 배치하십시오. 이렇게 하면 플레이트를 샘플 지점에서 보정 지점으로 이동시켜 유사 내부 보정을 수행할 수 있습니다.시료 수집 과정에서 CAS의 레이저 샷을 스펙트럼에 몇 차례 추가함으로써, 이 방법은 외부 보정만 사용할 때보다 더 높은 질량 정확도 보정을 보장합니다. 분석물 이온화에 방해가 될 수 있는 염이나 세제와 같은 오염 물질을 씻어내는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 HPLC 등급의 물에 0.1% Trifluoroacetic acid를 섞어 얼음처럼 차갑게 만든 후 스팟 위에 직접 떨어뜨립니다.여기에 표시된 것처럼 진공 흡입기를 사용하여 세척액을 제거하십시오. 이 방법은 막 단백질과 수용성 단백질 모두에 대해 우수한 스펙트럼을 생성합니다.

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연구

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Biology

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배우세요 MALDI-MS를 위한 울트라 씬 레이어 샘플 준비 방법으로 단백질의 정확한 질량 측정을 수행합니다. HPLC 등급 시약과 메탄올 세척을 통해 신뢰할 수 있는 분석 결과를 얻을 수 있습니다.

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