진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

이 절차의 전반적인 목표는 세포 용해물에서 mono zone 및 poly ribosome 분획을 분리하고 비교하는 것입니다. 이는 먼저 관심 세포를 배양하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 세포 용해물을 준비하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 자당 구배를 통해 용해물을 원심분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 그래디언트를 분획하고 UV 트레이스를 통해 다양한 리보솜 개체군을 시각화하는 것입니다. 궁극적으로 폴리 리보솜 프로파일 분석을 통해 다양한 실험 조건에서 번역의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 UMD와 J 로버트 우드 존슨 의과대학의 분자 유전학, 미생물학 및 면역학과의 테리 고스 킨제이 박사 연구실의 앤서니 에스포지토입니다. 저는 마커스 루이스입니다. 또한 R-W-J-M-S의 McKinsey Lab에서도 제공합니다.

오늘은 폴리 리보솜 분석 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 돌연변이 또는 환경적 요인으로 인해 발생하는 변화와 단백질 합성을 연구합니다. 시작하겠습니다. 자당.

그래디언트가 연속적으로 될 수 있도록 사용 하루 전에 그래디언트를 준비해야 합니다. 적절한 부피의 7%와 47%의 자당 원액을 혼합하여 다음 자당 농도 각각을 48밀리리터, 7%17%27%37% 및 47%각 자당 용액에 1몰 DTT를 1밀리몰의 최종 농도로 추가합니다. 그라디언트를 붓기 위해 파라 필름으로 고정하고 밀봉하여 20ml 주사기에 파스타 피펫을 부착합니다.

1인치 x 3.5인치 폴리 아머 울트라 원심분리기 튜브의 바닥에 7%자당 7ml를 추가합니다. 다음으로, 파스타 피펫 팁을 튜브 피펫 바닥 근처에 천천히 놓아 7% 용액 아래에 17% 자당 용액 7ml를 추가합니다. 각 레이어를 붓는 데 20초 이상이 걸립니다.

그래디언트가 지루해졌을 때 27%37%와 47%자당 용액을 각각 7ml씩 사용하여 반복합니다. 레이어 사이에 최소한의 혼합이 발생했음을 나타내는 명확한 선을 관찰해야 합니다. 섭씨 4도의 모든 구배를 시료 채취에 사용할 로터, 병 및 튜브와 함께 밤새 보관하십시오.

효모 세포에서 추출물을 준비하려면 먼저 100 25 밀리리터의 효모 배양액을 0.8 대 1의 OD 600으로 성장시키는 것으로 시작하십시오. cyclo heide를 배양액에 최종 농도인 밀리리터당 100마이크로그램으로 추가하고 섭씨 30도에서 15분 동안 계속 흔듭니다. 15분 후 250ml 원심분리기 병에 배양물을 붓고 얼음을 채웁니다.

이 시점부터 모든 것을 얼음 위에 올려 놓고 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 8, 000배로 원심분리기를 유지한다. Resus, 펠릿을 10ml의 얼음에 현탁시키고 냉간 용해, 완충액을 15ml 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 5, 900배 중력에서 섭씨 4도의 3분 동안 원심분리기 Resus.

펠릿을 0.5ml의 용해 완충액에 현탁시킵니다. 현탁액을 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮긴 다음 0.5ml의 냉각된 구운 산 세척 유리 구슬을 추가합니다. 4개의 32번째 간격 동안 세포를 소용돌이치고, 각 간격 사이에 30초 동안 얼음 위의 튜브를 호출합니다.

그런 다음 1.5 밀리리터 튜브 원심 분리기에 5, 000 회에 0.5 밀리리터의 용해 완충액을 추가합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 중력. 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 최대 속도로 원심분리기합니다.

마지막으로 supinate를 새로운 1.5mm 마이크로 센트리 튜브로 옮깁니다. 추출물은 섭씨 영하 80도에서 저장하여 용해물을 자당 구배로 전달할 수 있습니다. 피펫 끝을 그래디언트 표면 근처의 튜브 벽에 대고 그래디언트 위에 용해물을 부드럽게 겹쳐 놓습니다.

35ml 구배의 경우 일반적으로 500마이크로리터의 용해물이 로드됩니다. 집게를 사용하여 스윙 버킷 로터의 버킷으로 기울기를 조심스럽게 내립니다. 100, 000배 중력에 섭씨 4도에 4시간 동안 기온변화도를 원심분리기.

4시간의 탈수가 끝나기 약 30분 전. 바늘을 튜브 피어서에 부착하고 펜을 온라인 흡광도 형광 모니터에 부착합니다. 샘플을 분석하기 전에 안정적인 기준선에 도달할 수 있도록 흡광도 모니터의 전원을 켭니다.

PolyZone 프로파일의 전자 수집은 DI 1 48 U 데이터 수집 장치를 부착하여 실시간으로 쉽게 얻을 수 있습니다. 차트 레코더에 역류 급속 설정을 사용하여 주사기 펌프에 50ml의 플로린 너트를 채웁니다. 기포가 없는지 확인하십시오.

주사기의 호스를 튜브 피어싱기에 연결합니다. 그리고 순방향으로 분당 6 밀리리터의 속도로 Flo 불활성의 흐름을 잠시 켭니다. 호스에서 기포를 제거하려면 플로우 셀 끝에 있는 호스 아래에 일련의 튜브를 배치하여 샘플 유출을 수집합니다.

자당 구배를 포함하는 원심분리 튜브를 고정하기 위해 미리 형성된 우물이 있는 얼음 양동이를 준비합니다. 4시간 동안 원심분리가 완료되면 원심분리기 로터에서 원심분리기 튜브를 조심스럽게 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 그라디언트를 방해하지 않도록 주의하십시오.

세포 추출물을 분석하려면 튜브 피어서에 그라디언트 튜브를 놓고 튜브 상단을 배출구에 연결하고 고정합니다. 하단 s를 들어 올립니다.tage를 원심분리기 튜브로 가져와 바늘이 튜브 바닥을 관통하도록 합니다. 플로린 경보의 흐름을 분당 6 밀리리터로 정방향으로 시작합니다.

플루트가 튜브로 흘러 들어가기 시작하면 온라인 UV 흡광도 모니터에서 바늘의 움직임을 모니터링합니다. 바늘이 움직이기 시작하면 차트 이동을 속도 설정 60으로 켭니다. 폴리 리보솜 프로파일의 끝에 도달하면 원심분리기 튜브에 대한 Flo 불활성의 흐름을 끄고 흡광도 형광 모니터에서 차트 이동을 중지합니다.

튜브에서 주사기로 자당을 끌어당기지 않도록 하여 빠른 속도로 역방향으로 흐름을 시작하여 원심분리기 튜브에서 주사기로 Flo 불활성을 후퇴시킵니다. 튜브 피어서에서 원심분리기 튜브의 나사를 풀고 바늘을 내리고 튜브를 제거합니다. cyclo heide의 존재 하에서 효모로부터 제조된 리보솜 추출물의 대표적인 흔적이 여기에 나와 있습니다.

폴리리보솜과 A TS 60s 및 40s 리보솜을 포함하는 UV 흡광도 피크가 표시됩니다. 이 절차를 수행할 때 폴리 리보솜 분석을 수행하는 방법을 보여주었습니다. 샘플을 차갑게 유지하고 RNA를 무료로 유지하면서 신속하게 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.