Name: 성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 성인 제브라피시 복강내 주사법으로 혈당 항상성 연구를 수행하는 방법을 알아보세요. NanoFil 마이크로주사기와 냉수 마취를 활용한 이 기술은 대사 질환 연구에 필수적인 정확한 약물 전달을 가능하게 합니다.

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본 연구는 당뇨병과 소화 국립 연구소 신장 질환으로 소아 당뇨병 연구 재단 부여 5-2007-97 (VEP)을, 지원했다 보조금 R01DK064973 (VEP)를, R01DK48494 (LHP)를, T32DK07074 (SCE을 지원), K01DK083552 (MDK)를, 그리고 시카고 당뇨병 연구 및 교육 센터의 대학에 P60DK20595로. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIDDK 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. 사전 분사 준비 <ol><li> 이전 주사 최소한 24 시간 동안 빠른 물고기. 이것은 장내 전구 (위) 내용을 비어있는 것입니다. 기본 금식 프로토콜은 깨끗한 탱크에 그들의 정상적인 밀도에서 물고기를 전송하는 것입니다, 다음 음식을 보류. (예 : 혈당 연구에 대한) 더 엄격한 조건을 필요로 장기 금식은 토론에 추가 고려 사항을 참조하십시오. </li><li> 코트 랜드 소금 솔루션 (페리 외., 1984)를 준비합니다. 100 ML 볼륨의 경우, 증류수에 다음을 해산 : 725 MG NaCl (124.1 ㎜) 38 MG KCl (5.1 ㎜) 41 MG 나 2 HPO 4 (2.9 ㎜) 24 MG MgSO 4 7H 2 O ∙ (1.9 ㎜) 16 MG CaCl 2 ∙ 2 시간 2 O (1.4 ㎜) 100 MG NaHCO 3 (11.9 ㎜) 4g Polyvinylpyrrolidone (PVP) (4 %) 1,000 USP 단위 헤파린 , 필터 소독 및 저장 4 ° C. </li><li> 현미경을 준비합니다. <ul><li> 유출의 경우 보호를 위해 플라스틱 랩과 현미경 기지를 커버. </li><li> 플라스틱 랩 위에 종이 타월을 넣어. 외과 테이블은 종이 타월 위에 앉아 것입니다. </li><li> 사전 조정 수술 테이블을보고 스폰지에 초점을 맞춤으로써 초점을. </li></ul> 팁 : 스폰지 위에 손가락을 넣고 거기에 중점을두고 있습니다. 물고기가 수술 테이블에되면 이것은 초점 조정을 제거 또는 추가 최소화합니다. </li><li> 물고기의 무게를. <ul><li> 1 / 생선 시설 물로 가득 약 3 500 ML의 비커를 입력합니다. </li><li> 테어 균형. </li><li> NET을 사용하여 물고기를 수집합니다. 멀리 간단히 종이 타월에 그물을 dabbing하여 그물과 물고기에서 초과 물을 윅. 비커에 생선을 전송합니다. </li><li> 물고기의 무게를. </li><li> 깨끗한 수조에 물고기를 전송합니다. </li><li> 자체 분류 탱크에 각각 무게 생선을 전송합니다. </li><li> 생선 무게에 따라 각각의 물고기에 대한 사출 볼륨을 계산합니다. </li></ul></li><li> 주사기 및 관련 사출 장비를 준비합니다. 주입을 위해, 우리는 35G beveled 강철 바늘과 10 μl NanoFil의 microsyringe을 권장합니다. 제조 업체의 지침에 따라 NanoFil 주사기와 silflex 튜브를 준비합니다. 주사기와 튜브의 모든 거품을 제거하는 것이 중요합니다. 주사기와 튜브를 작성 후, 펌프에 주사기를 탑재하고, 프로그램의 첫 번째 물고기에 대한 사출 볼륨을. </li><li> 수술 테이블을 준비합니다. <ul><li> 그것이 높이 약 20mm가되도록 부드러운 스폰지 (예 : # L800 - D, Jaece 산업 등) 잘라. 평면 얼굴에 깊은 10-15mm있는 상처를 확인하십시오. 이 상처는 분사를 위해 물고기를 개최합니다 구유입니다. </li><li> 60mm 페트리 접시에 스폰지를 설정합니다. </li><li> 적절한 크기의 피펫 팁 상자 뚜껑에 스펀지와 페트리 접시를 설정합니다. 뚜껑은 스폰지 온도를 유지하기 위해 물을 잡아 충분히 크게해야하지만, 그것은 방해하지 않도록 충분히 얕은해야합니다. 우리는 11.4 cm X 7.7 cm L W X 1.5 cm입니다 P200 팁 상자에서 뚜껑을 사용 D. </li></ul> (상자 뚜껑에 배양 접시에있는 스폰지) 함께 조립이 세 항목은 수술 테이블을 구성합니다. </li><li> 마취를 준비합니다. <ul><li> 생선 설비 물로 만들어진 큐브를 사용하여 얼음 조각을 만듭니다. </li></ul> 팁 : 일반적으로 얼음 큐브 트레이를 사용하여, 그것이 10-12 물고기를 마취 3 트레이를 취할 것입니다. <ul><li> 얼음 조각과 함께 깨끗한 얼음 양동이를 채우십시오. </li><li> 같은 2.4 리터 Rubbermaid 식품 저장 용기로 큰 용기에 수술 테이블을 넣어. </li><li> 바깥쪽 컨테이너와 수술 테이블에 어떤 시설 물 (따뜻한) 하거라. 따뜻한 물 시설의 보유를 근처 유지. </li><li> 외부 컨테이너에 체온계를 넣어. </li></ul></li></ol> 2. 마취, 분사 및 복구 <ol><li> 마취 바깥쪽 컨테이너 플러스 현미경에 인접한 외과 테이블을 배치합니다. 근처의 얼음 칩 버킷 있습니다. </li><li> 17 물의 온도를 내려줘 ° C 얼음 조각을 추가하여. 중요 :이 단계 17 ° C 아래에 가지 마세요. </li><li> 외부 컨테이너에 물고기를 전송하는 그물을 사용합니다. </li><li> 천천히 12 온도를 넘어뜨리고 ° C, 몇 분의 과정을 통해. 용기에 얼음 조각을 추가 </li><li> 모니터 생선 동작 : 17 ° C 또는 약간 낮은 물고기가 일반적으로 가로의 가슴 지느러미를 확산 말하다하고, 빠른 operculum의 움직임을 것입니다. 온도가 방울로, 물고기가 수영을 중지 더 느리게 그리고 마지막으로 수영합니다. 마취의 수술 비행기가 가까이이므로이 온다 중지하고 operculum의 움직임은 천천히합니다. 그것이 처리되는 반응하지 않는 경우 물고기 주입을위한 준비가 된 것입니다. 대부분의 생선, 12 ° C가 충분합니다. 큰 물고기는 추운 WA 필요할 수 있습니다터. </li><li> 필요한 온도가 포화에 스펀지에 (~ 12 ° C 또는 추워), 언론에 도달 때문입니다. </li><li> 그들은 물고기를 따뜻하게하고 처리하는 동안 마취를 꺼낼 수가없는 것입니다 충분히 있으므로 찬물에 손가락을 유지. </li><li> 차가운 손가락으로 부드럽게 스펀지의 여물에 생선을 전송합니다. 여물에 복부와 아가미와 함께 물고기를 놓습니다. </li><li> 신속 현미경 단계에 수술 테이블을 전송합니다. </li><li> 신속하게 작업, 신중하게 골반 지느러미 사이의 정중선에 바늘을 삽입합니다. 바늘은 cranially 가리 켜야하고 항문에보다 가깝게 골반 환상 골을 삽입할 수 있습니다. 당신은 바늘이 몸을 벽에 깊이 때 느낄 수있을 것입니다. 적절한 볼륨을 삽입하고 바늘을 철회. </li><li> 주입 후, 즉시의 따뜻한 물 (~ 28.5 ° C) 탱크 물 위에 스펀지에서 물고기를 발표하여 복구를위한 탱크. 다시 물고기를 전송 팁 : 물고기가 즉시 수영을 시작하지 않는 경우, 부드럽게 아가미쪽으로 물이 소용돌이로 복구하는 데 도움이됩니다. </li><li> 바늘을 확인합니다. 간혹 규모가 첨부된 수 있으며 다음 주사하기 전에 제거되어야합니다. </li><li> 이후 주사 들어, ° C 다음 생선을 도입하기 전에 17 백업 마취 챔버 물 온도를 가지고 따뜻한 설비 물을 사용합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 0.5 MG / G 포도당이나 차량의 intraperitoneal 주사를 다음과 같은 대표적인 결과. 생선 주입하기 전에 72 시간 금식했다. x 축은 시간 후 주사를 보여줍니다. ± SEM을 뜻합니다.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Intraperitoneal 주사 다섯 단계를 포함 : 금식 계량, 주입, 및 복구를 anesthetizing. 각 단계의 성공을 보장할 수 모범 사례가 없습니다. 성공은 건강한 물고기 환자뿐만 아니라 좋은 실험 결과를 포함하고 있습니다. 금식 : 24 시간 빠른이 장의 전구 비어해야합니다. 이러한 행위는 물고기 동물 문학 (예 : 브라운 1993)에서 발췌한 것입니다. 추가 금식 고려 사항은 아래 설명합니다. 장기 금식 : 우리는 72 시간 빠른하기 전에 주사하는 기본 수준으로 혈당을 감소하는 데 필요한 것으로 나타났습니다 (임스 외, 2010.). 우리는 또한 포도당 연구 물고기가 제대로 금식되는 것을 보장하기 위해 필요한 몇 가지 절차가있다는 것을 발견했습니다. 깨끗한 탱크 (바닥에 부스러기없이)로 시작합니다. 탱크는 명확하게 &#39;금식&#39;으로 분류, 오프라인되어야하고, 위치에 열정 생선 관리 직원이 그들을 먹여 살리지하지 않습니다 어디에. 탱크의 외부 환경을 평가하고 스트레스가 혈당 (Chavin 영, 1970.; 그로프 외, 1999)을 마련하는 것으로 알려져으로 교란에서 강조되는 물고기를 방지하기위한 조치를 취할. 예를 들어, 우리는 라디오가 물고기 탱크를 들고 있던 벤치에서 매일 운영어진 금식 실험을했다. 우리는 혈당이 비정상적으로 높은이고 물고기는 진동에 의해 강조되었다 결론 발견했습니다. 또 다른 스트레스가 사람을 너무 많이들이는 것입니다. 생선 좋은 생선 축산 관행과 준수 밀도에 보관해야합니다. 추천, 브랜드 외를 참조하십시오. (2002 년)와 웨스 터 (1995). 우리는 9리터 탱크 (해당 볼륨의 일부를 차지하지 구슬 3 레이어)에 10-12 물고기의 밀도에 우리 생선 금식 좋은 결과를 있었다. 남녀를 분리하는 것은 스트레스의 원인이 될 수 있습니다, 그래서 우리는 빠른 동안 혼합 성별 인구를 유지하는 것이 좋습니다. 이것은 계란이 여자랑 수있다는 것을 의미하고, 계란 그들이 먹지 않을 수 있도록 분리된해야합니다. 달걀을 격리하는 간단한 방법은 구슬로부터 2-3 레이어와 탱크 바닥을 커버하는 것입니다. 수질은 계란과 쓰레기를 제거하여 매일 탱크의 물을 10-15 % 정도를 교체하여 유지되어야합니다. 몰래 빼내고, 계란과 쓰레기를 제거 잘 작동합니다. 무게 : anesthetized되지 않은 생선 무게 경우, 치료는 정확한 계량을 보장하기 위해, 비커에 그물에 물을 전송을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 그물은 (생선) 종이 타올에 blotted 경우, 초과 물의 대부분은 제거할 수 있으며 무게는 정확하게 측정할 수 있습니다. 그것은 전에 무게로 물고기를 마취하기 쉬울 수 있지만, 우리는 하루에 두 번 생선을 anesthetizing의 가능한 효과를 테스트하지 않았습니다. 우리는 anesthetized 후 다시 무게 물고기 다음 그물 / 방법을 모래 바닥과 함께 먼저 생선을 무게로 우리의 기술을 테스트하고, 부드럽게 건조 blotted있다. 우리는 방법 사이의 무게에 큰 차이를 찾을 수 없습니다 (P = 0.7927, T - 테스트). 또한, 우리는이 그물 /가 (NO 모래 바닥) netted이므로 단순히 즉시 비커에 생선을 전송에 비해, 방법에 영향을 혈당을 모래 바닥 여부를 테스트했습니다. 우리는 두 가지 전송 방법 사이의 혈당 수준에 상당한 차이를 찾을 수 없습니다 (P = 0.2241, T - 테스트). Anesthetizing : 화학 마취 많은 연구에 적합한 수 있습니다. 많은 anesthetics이 (tricaine/MS-222 (브라운, 1993)를 포함), 혈당을 올리기 때문에 여기에서 우리는 대안으로 냉수 마취를 증명하고있다. 이전 연구에서, 우리는 차가운 물 (임스 외., 2010) zebrafish에서 혈당을 인상하지 않는 것으로 나타났습니다. 콜드 워터 마취의 경우, 온도가 천천히 감소한다. 감소의 비율은 작은 물고기가 큰 물고기보다 아래에가는과 함께 물고기의 크기에 따라 달라 보인다. 분사에 따라, 당신은 물고기 (아래 참조) 마취에서 너무 느리게 회복 것을 관찰할 수 있습니다. 시작 온도는 온도가 너무 빠르게 감소합니다 너무 낮은 경우 또는 경우 중이 발생할 수 있습니다. 시작 온도는 물을 입력시 생선 숨어 경우 옆으로 너무 낮습니다. 시작 온도가 맞다면, 물고기는 처음의 균형을 유지합니다. 그것은 수평 위치는 가슴 지느러미를 회전 말하다하고, 빠른 operculum의 움직임을 것입니다. 일반적으로, 그것은 수영을합니다. 온도 감소로, 움직임이 저하되고 물고기는 균형을 잃게됩니다. 물고기가 반응하지 않고 처리할 수있을 때 마취의 수술 비행기에 도달입니다. 외과 마취 물고기를 유지하기 위해, 손가락, 추울 때문에 생선을 취급하기 전에 물에 보관해야합니다. 스폰지는 또한 물고기를 anesthetizing에 사용되는 물 같은 온도에서 추위 보관해야합니다. sufficie는 물로 스폰지를 포화하는 것이 중요하다물고기가 그것에 배치되면 마취를 유지하는 ntly 감기. 사출 : 이전 사업 주사로, 당신이 신체 벽 두께의 감각을 얻으려면 적어도 하나의 물고기를 해부하다 할 수 있습니다. 이것은 바늘이 복강를 입력 삽입할 필요가 얼마나 멀리 당신이 판단하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 당신이 주사 바늘을 삽입으로, 당신은 바늘이 복강를 입력하면 신체 벽은 &quot;줄&quot;느낄 수 있습니다. 주사하는 동안 환자가 행복하게하기위한 조치를 취할. 스폰지가 주입하는 동안 되살리는에서 물고기를 방지하기 위해 정확한 온도 차가운 물로 포화되어 있는지 확인하십시오. 잘 포화 부드러운 스펀지는 비늘과 피부의 커버 가래의 손상을 최소화하는 것이 중요합니다. 잘 포화 스펀지는 아가미가 aerated 유지에도 중요합니다. 우리는 높은 재료 아래에 나열된 거품 스폰지를 권장합니다. 마지막으로, 일단 물고기가 anesthetized이며, 물고기가 아래에되는 시간을 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. 복구 : 물고기가 거의 따뜻한 물 탱크를 입력시 마취에서 회복한다. 물고기는 회복 속도는 아가미쪽으로 소용돌이 물을 부드럽게, 즉시 수영을 시작하지 않으면. 복구가 느리다면, 물고기가 너무 빨리 아래에 가서 당신은 적절하게 마취 절차를 조정해야합니다. 느린 회복의 원인은 Anesthetizing 아래에 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>폼 스펀지</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 박스 뚜껑</td><td></td><td></td><td>너무 깊지 않은 것, 예: 1.5 cm</td></tr><tr><td>플라스틱 보관 용기</td><td></td><td></td><td>깊은 것, 예: 7 cm</td></tr><tr><td>온도계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분쇄 얼음</td><td></td><td></td><td>시설 용수로 제조</td></tr><tr><td>따뜻한 시설 용수</td><td></td><td></td><td>1 liter 이상</td></tr><tr><td>500 ml 비커</td><td></td><td></td><td>무게 측정용</td></tr><tr><td>NanoFil 시린지</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>또는 Hamilton 시린지</td></tr><tr><td>35 gauge 바늘</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>사면 형태</td></tr><tr><td>Silflex 튜빙</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III 및 Micro4 컨트롤러</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>풋 스위치</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 랩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortland 염 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

성인 zebrafish에 intraperitoneal 사출

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

화학적 zebrafish 치료를위한 편리한 방법은 그것이 물고기에 의해 촬영되는 탱크 물에 시약을 소개하는 것입니다. 그러나,이 방법은 어려운 시약을 흡수 또는 물고기 당 최대 촬영 어느 정도 알고 있습니다. 신진 대사 연구 특히 이들과 관련된 몇 가지 실험 질문은, 더 나은 무게에 따라 각 물고기에 정의된 수량을 제공함으로써 해결될 수 있습니다. 여기 우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal (IP) 주입을위한 방법을 제시한다. 사출은 복강에 골반 환상 골에 후부 있습니다. 이 절차는 큰 물고기에 사용되는 동물의 적응 방법이다. 우리가 제로 사망률을 관찰 것처럼 그것은 안전합니다. 또한, 우리는 127 주사의 단 5 밖에서 주입 사이트에서 출혈이 볼 수 있고,이 경우 각각의 출혈이 간단한, 지속적인 몇 초 정도 있었고, 분실 혈액의 수량이 작은되었습니다. 이 절차와 성공, anesthetizing, 사출 및 복구 무게, 금식 등 여러 단계를 통해 물고기의 부드러운 핸들링이 필요합니다. 주의 사항이 절차를 통해 스트레스를 최소화하기 위해 필요합니다. 우리의주의는 작은 분사 볼륨 및 35G 바늘을 사용하여 포함됩니다. 우리는 osmotically 민물고기에 대한 균형있는 차량으로 코트 랜드 소금 솔루션을 사용합니다. 아가미의 폭기는 사출 자체 동안 물이 포화 스폰지 내의 여물 물고기를 누른 먼저 느린 operculum의 움직임을 허용 마취 수술 비행기로 물고기를 가져다하여 사출 과정 동안 유지하고, 두번째입니다. 우리는 포도당을 주입하고 혈당 수준의 상승과 정상의 후속 수익을 모니터링하여 IP 주입의 유틸리티를 보여줍니다. 스트레스가 teleost 물고기의 혈당을 증가하는 것으로 알려져 있습니다, 우리는 차량 주입 및 비 주입 성인 혈당 수준을 비교하고 절차는 혈당에 큰 상승을 발생하지 않는 것으로 나타났습니다.

우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal 주사를 보여줍니다. 우리는 Micro4 컨트롤러와 UltraMicroPump III에 의해 통제 10 μl NanoFil microsyringe을 사용합니다. 이 예제는 마취로 찬물의 사용을 포함합니다.

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

제브라피시를 화학적으로 처리하는 편리한 방법은 시약을 수조의 물에 넣어 물고기가 이를 흡수하게 하는 것입니다. 하지만, ...

이 절차의 전체적인 목적은 성체 제브라피시의 복강 내에 용액을 주입하는 것입니다. 본 예시에서는 실험실에서 포도당을 주입해 보겠습니다. 우리는 혈당 항상성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이는 먼저 물고기의 무게를 측정하여 체중 1g당 주입할 용액의 양을 결정함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 찬물을 사용하여 물고기를 마취시키는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 물고기를 현미경 스테이지로 옮겨 주입하는 것입니다.절차의 마지막 단계는 회복을 위해 물고기를 수조로 되돌려 보내는 것입니다. 궁극적으로 혈당 수치 측정을 통해 포도당 항상성의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 시카고 대학교 유기체 생물학 및 해부학과의 Victoria Prince 연구실 소속 Mary Kinkle입니다.저는 Prince Lab의 Stephanie Ames입니다. 오늘은 성체 제브라피쉬(Zebrafish)의 복강 내 주입 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 혈당 항상성 조절을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작해 보겠습니다. 주사를 위해 물고기를 준비하려면, 먼저 물고기를 깨끗한 수조로 옮기고 사료 공급을 중단하십시오. 장구(intestinal bulb)의 내용물을 비우기 위해 24시간 동안, 그리고 혈당 수치를 기저 수준으로 낮추기 위해 72시간 동안 물고기를 금식시킵니다.이 프로토콜에서 사용하는 밀도는 9L 수조당 암수 혼합 개체군 10~12마리입니다. 수조 바닥에 대리석 알갱이를 세 층으로 깔아두면, 알이 대리석 사이로 들어가 포식되지 않도록 격리됩니다. 매일 수조를 사이펀으로 흡입하여 알과 노폐물을 제거하십시오.다음으로, 124.1 millimolar 염화나트륨, 5.1 millimolar 염화칼륨, 2.9 millimolar 피로인산나트륨, 1.9 millimolar 황산마그네슘 칠수화물, 1.4 millimolar 염화칼슘 이수화물, 11.9 millimolar 탄산수소나트륨, 4g의 polyvinyl pyrrolidone, 그리고 1000 USP units의 헤파린을 탈이온수로 최종 부피 100 milliliters가 되게 하여 Cortland 염 용액을 준비합니다. 이를 여과 및 멸균한 후 4°C에서 보관합니다. 이어서, Cortland 염 용액 10 milliliters에 포도당 5g을 녹입니다. 0.5 mg/µL 포도당 용액을 만들기 위해 여과 및 멸균한 후 4°C에서 보관합니다.그 다음, 부드러운 스펀지의 평평한 면을 약 20 millimeter 높이로 잘라 수술대를 준비합니다. 주사를 위해 물고기를 고정할 수 있도록 10 to 15 millimeter 깊이로 홈을 냅니다. 스펀지를 60 millimeter 페트리 접시에 넣고, 스펀지가 담긴 페트리 접시를 P 200 피펫 팁 박스 뚜껑 안에 배치합니다.다음으로, 현미경 베이스를 플라스틱 랩과 종이 타월로 덮어 보호함으로써 현미경을 준비합니다. 액체가 쏟아질 경우를 대비하여 종이 타월 위에 수술대를 설치합니다. 수술대를 관찰하며 스펀지에 초점을 맞추어 미리 초점을 조정합니다.스펀지 위에 손가락을 올리고 초점을 맞추어, 물고기가 수술대에 놓였을 때 추가적인 초점 조정이 최소화되도록 합니다. 500 milliliter 비커의 약 3분의 1을 사육수(fish facility water)로 채운 뒤 물고기의 무게를 잽니다. 저울 위에 놓인 넷을 이용하여 가능한 한 여분의 물을 적게 포함시켜 물고기를 비커로 옮기고 무게를 기록합니다. 무게 측정이 완료된 각 물고기는 라벨이 부착된 투명 수조로 옮깁니다.체중에 근거하여 주입량을 계산합니다. 이 예시에서는 Cortland 염 용액에 용해된 g당 0.5 mg의 포도당 용액을 주입하겠습니다. 용액의 농도가 0.5 mg/µL이므로, 계산식은 1 × 물고기 체중(g) = 주입할 부피(µL)가 됩니다. 시린지와 관련 주입 장비를 준비하십시오.본 프로토콜에서는 포도당 주입을 위해 30 G 베벨 스틸 니들, ultra micro pump, micro four processor 및 10 µL nano fill micro syringe를 사용합니다. Cortland 염수 용액에 용해된 0.5 mg/µL 포도당으로 시린지를 채웁니다. 시린지 내의 모든 공기 방울을 제거하는 것이 중요합니다. 시린지를 ultra micro pump에 장착하고, micro four processor의 숫자 키패드를 사용하여 첫 번째 물고기에 주입할 부피를 nL 단위로 입력하여 설정합니다. 마지막으로, 어류 사육 시설의 물로 만든 얼음 큐브를 충분히 부수어 얼음 마취제를 준비합니다.아이스 버킷을 채우려면, 수술대를 2.4리터 고무제 식품 보관 용기와 같은 더 큰 용기에 넣으십시오. 외부 용기와 수술대에 따뜻한 시설 용수를 붓습니다. 따뜻한 시설 용수가 담긴 예비 탱크를 가까이 두십시오.외부 용기에 온도계를 부착합니다. 마취용 외부 용기와 수술대를 현미경 옆에 배치합니다. 얼음 조각이 든 버킷을 가까이 둡니다.수온이 17 °C가 될 때까지 얼음 조각을 넣기 시작하십시오. 이 단계에서 17 °C 미만으로 내려가지 않도록 하십시오. 뜰채를 사용하여 물고기를 외부 용기로 옮기십시오.온도가 17°C 또는 그보다 약간 낮아지면, 물고기는 일반적으로 가슴지느러미를 수평으로 펼치고 헐떡이며 이개(auricular) 운동을 빠르게 합니다. 수 분에 걸쳐 온도를 12°C까지 낮추기 위해 용기에 얼음 조각을 천천히 추가합니다. 온도가 내려가면서 물고기의 유영 속도는 점차 느려지며 결국 유영을 멈추게 됩니다.결국 헐떡임이 멈추고 아가미의 움직임이 느려질 것입니다. 물고기가 핸들링에 반응하지 않을 때 주사 준비가 된 것입니다. 필요한 온도에 도달하면 스펀지를 눌러 충분히 적셔 줍니다.손가락이 물고기의 체온을 높여 마취 상태에서 깨어나게 하지 않도록, 손가락을 찬물에 충분히 담가 두십시오. 차가워진 손가락을 사용하여 물고기를 스펀지가 깔린 트러프(trough)로 조심스럽게 옮깁니다. 물고기의 복부가 위로 향하고 아가미가 트러프에 위치하도록 배치하십시오.수술대를 신속하게 현미경 스테이지로 옮깁니다. 빠르게 작업하며, 바늘 끝이 머리 방향을 향하고 항문보다 골반대(pelvic girdle)에 더 가깝게 위치하도록 조심스럽게 배치합니다. 골반지느러미 사이의 중앙선에 바늘을 삽입합니다.바늘이 체벽 깊숙이 들어갔을 때 그 느낌을 알 수 있어야 합니다. 바늘을 삽입할 때 체벽이 뚫리는 느낌을 받을 수 있습니다. 바늘이 복강에 진입하면 마이크로 프로세서를 사용하여 적절한 부피를 주입하십시오.풋 페달을 사용하여 물고기 체중 1g당 1µL를 주입한 후, 바늘을 제거하고 즉시 물고기를 회복을 위해 온수 탱크로 옮깁니다. 탱크의 물 위에서 스펀지로부터 물고기를 놓아준 뒤, 현미경으로 바늘을 확인하십시오. 때때로 비늘이 붙어 있을 수 있으며, 다음 주입 전에 이를 제거해야 합니다.적절한 시간이 지난 후, 후속 분석을 진행하십시오. 주사 전 혈당을 기저 수준으로 낮추기 위해서는 72시간의 금식이 필요하다는 것을 확인했습니다. 이 그림에서 녹색으로 표시된 비주사 대조군 데이터는 빨간색으로 표시된 vehicle 주사 대조군과 유의미한 차이가 없는 혈당 수치를 보여줍니다.하지만 파란색 선은 포도당을 주입한 물고기의 혈당 수치를 나타내며, 혈중 포도당의 상승과 하강을 보여줍니다. 시간이 경과함에 따라, 포도당 주입군과 대조물질 주입군 동물 모두 주입 과정 동안 수술 마취 상태였으나, 비주입 대조군은 수술 마취 상태가 아니었습니다. 지금까지 성체 제브라피시의 복강 내 주입 방법을 살펴보았습니다.저희 연구실에서는 포도당 용액을 복강 내(IP) 주입한 후 다양한 시간대별로 혈당 농도의 변화를 연구하고 있습니다. 하지만 방금 보여드린 이 기술은 연구자가 원하는 다른 용액을 주입하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 물고기를 천천히 마취시키고 조심스럽게 다루어야 함을 기억하십시오.이것으로 모두 끝났습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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