성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

이 절차의 전체적인 목적은 성체 제브라피시의 복강 내에 용액을 주입하는 것입니다. 본 예시에서는 실험실에서 포도당을 주입해 보겠습니다. 우리는 혈당 항상성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이는 먼저 물고기의 무게를 측정하여 체중 1g당 주입할 용액의 양을 결정함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 찬물을 사용하여 물고기를 마취시키는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 물고기를 현미경 스테이지로 옮겨 주입하는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 회복을 위해 물고기를 수조로 되돌려 보내는 것입니다. 궁극적으로 혈당 수치 측정을 통해 포도당 항상성의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 시카고 대학교 유기체 생물학 및 해부학과의 Victoria Prince 연구실 소속 Mary Kinkle입니다.

저는 Prince Lab의 Stephanie Ames입니다. 오늘은 성체 제브라피쉬(Zebrafish)의 복강 내 주입 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 혈당 항상성 조절을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 주사를 위해 물고기를 준비하려면, 먼저 물고기를 깨끗한 수조로 옮기고 사료 공급을 중단하십시오. 장구(intestinal bulb)의 내용물을 비우기 위해 24시간 동안, 그리고 혈당 수치를 기저 수준으로 낮추기 위해 72시간 동안 물고기를 금식시킵니다.

이 프로토콜에서 사용하는 밀도는 9L 수조당 암수 혼합 개체군 10~12마리입니다. 수조 바닥에 대리석 알갱이를 세 층으로 깔아두면, 알이 대리석 사이로 들어가 포식되지 않도록 격리됩니다. 매일 수조를 사이펀으로 흡입하여 알과 노폐물을 제거하십시오.

다음으로, 124.1 millimolar 염화나트륨, 5.1 millimolar 염화칼륨, 2.9 millimolar 피로인산나트륨, 1.9 millimolar 황산마그네슘 칠수화물, 1.4 millimolar 염화칼슘 이수화물, 11.9 millimolar 탄산수소나트륨, 4g의 polyvinyl pyrrolidone, 그리고 1000 USP units의 헤파린을 탈이온수로 최종 부피 100 milliliters가 되게 하여 Cortland 염 용액을 준비합니다. 이를 여과 및 멸균한 후 4°C에서 보관합니다. 이어서, Cortland 염 용액 10 milliliters에 포도당 5g을 녹입니다. 0.5 mg/µL 포도당 용액을 만들기 위해 여과 및 멸균한 후 4°C에서 보관합니다.

그 다음, 부드러운 스펀지의 평평한 면을 약 20 millimeter 높이로 잘라 수술대를 준비합니다. 주사를 위해 물고기를 고정할 수 있도록 10 to 15 millimeter 깊이로 홈을 냅니다. 스펀지를 60 millimeter 페트리 접시에 넣고, 스펀지가 담긴 페트리 접시를 P 200 피펫 팁 박스 뚜껑 안에 배치합니다.

다음으로, 현미경 베이스를 플라스틱 랩과 종이 타월로 덮어 보호함으로써 현미경을 준비합니다. 액체가 쏟아질 경우를 대비하여 종이 타월 위에 수술대를 설치합니다. 수술대를 관찰하며 스펀지에 초점을 맞추어 미리 초점을 조정합니다.

스펀지 위에 손가락을 올리고 초점을 맞추어, 물고기가 수술대에 놓였을 때 추가적인 초점 조정이 최소화되도록 합니다. 500 milliliter 비커의 약 3분의 1을 사육수(fish facility water)로 채운 뒤 물고기의 무게를 잽니다. 저울 위에 놓인 넷을 이용하여 가능한 한 여분의 물을 적게 포함시켜 물고기를 비커로 옮기고 무게를 기록합니다. 무게 측정이 완료된 각 물고기는 라벨이 부착된 투명 수조로 옮깁니다.

체중에 근거하여 주입량을 계산합니다. 이 예시에서는 Cortland 염 용액에 용해된 g당 0.5 mg의 포도당 용액을 주입하겠습니다. 용액의 농도가 0.5 mg/µL이므로, 계산식은 1 × 물고기 체중(g) = 주입할 부피(µL)가 됩니다. 시린지와 관련 주입 장비를 준비하십시오.

본 프로토콜에서는 포도당 주입을 위해 30 G 베벨 스틸 니들, ultra micro pump, micro four processor 및 10 µL nano fill micro syringe를 사용합니다. Cortland 염수 용액에 용해된 0.5 mg/µL 포도당으로 시린지를 채웁니다. 시린지 내의 모든 공기 방울을 제거하는 것이 중요합니다. 시린지를 ultra micro pump에 장착하고, micro four processor의 숫자 키패드를 사용하여 첫 번째 물고기에 주입할 부피를 nL 단위로 입력하여 설정합니다. 마지막으로, 어류 사육 시설의 물로 만든 얼음 큐브를 충분히 부수어 얼음 마취제를 준비합니다.

아이스 버킷을 채우려면, 수술대를 2.4리터 고무제 식품 보관 용기와 같은 더 큰 용기에 넣으십시오. 외부 용기와 수술대에 따뜻한 시설 용수를 붓습니다. 따뜻한 시설 용수가 담긴 예비 탱크를 가까이 두십시오.

외부 용기에 온도계를 부착합니다. 마취용 외부 용기와 수술대를 현미경 옆에 배치합니다. 얼음 조각이 든 버킷을 가까이 둡니다.

수온이 17 °C가 될 때까지 얼음 조각을 넣기 시작하십시오. 이 단계에서 17 °C 미만으로 내려가지 않도록 하십시오. 뜰채를 사용하여 물고기를 외부 용기로 옮기십시오.

온도가 17°C 또는 그보다 약간 낮아지면, 물고기는 일반적으로 가슴지느러미를 수평으로 펼치고 헐떡이며 이개(auricular) 운동을 빠르게 합니다. 수 분에 걸쳐 온도를 12°C까지 낮추기 위해 용기에 얼음 조각을 천천히 추가합니다. 온도가 내려가면서 물고기의 유영 속도는 점차 느려지며 결국 유영을 멈추게 됩니다.

결국 헐떡임이 멈추고 아가미의 움직임이 느려질 것입니다. 물고기가 핸들링에 반응하지 않을 때 주사 준비가 된 것입니다. 필요한 온도에 도달하면 스펀지를 눌러 충분히 적셔 줍니다.

손가락이 물고기의 체온을 높여 마취 상태에서 깨어나게 하지 않도록, 손가락을 찬물에 충분히 담가 두십시오. 차가워진 손가락을 사용하여 물고기를 스펀지가 깔린 트러프(trough)로 조심스럽게 옮깁니다. 물고기의 복부가 위로 향하고 아가미가 트러프에 위치하도록 배치하십시오.

수술대를 신속하게 현미경 스테이지로 옮깁니다. 빠르게 작업하며, 바늘 끝이 머리 방향을 향하고 항문보다 골반대(pelvic girdle)에 더 가깝게 위치하도록 조심스럽게 배치합니다. 골반지느러미 사이의 중앙선에 바늘을 삽입합니다.

바늘이 체벽 깊숙이 들어갔을 때 그 느낌을 알 수 있어야 합니다. 바늘을 삽입할 때 체벽이 뚫리는 느낌을 받을 수 있습니다. 바늘이 복강에 진입하면 마이크로 프로세서를 사용하여 적절한 부피를 주입하십시오.

풋 페달을 사용하여 물고기 체중 1g당 1µL를 주입한 후, 바늘을 제거하고 즉시 물고기를 회복을 위해 온수 탱크로 옮깁니다. 탱크의 물 위에서 스펀지로부터 물고기를 놓아준 뒤, 현미경으로 바늘을 확인하십시오. 때때로 비늘이 붙어 있을 수 있으며, 다음 주입 전에 이를 제거해야 합니다.

적절한 시간이 지난 후, 후속 분석을 진행하십시오. 주사 전 혈당을 기저 수준으로 낮추기 위해서는 72시간의 금식이 필요하다는 것을 확인했습니다. 이 그림에서 녹색으로 표시된 비주사 대조군 데이터는 빨간색으로 표시된 vehicle 주사 대조군과 유의미한 차이가 없는 혈당 수치를 보여줍니다.

하지만 파란색 선은 포도당을 주입한 물고기의 혈당 수치를 나타내며, 혈중 포도당의 상승과 하강을 보여줍니다. 시간이 경과함에 따라, 포도당 주입군과 대조물질 주입군 동물 모두 주입 과정 동안 수술 마취 상태였으나, 비주입 대조군은 수술 마취 상태가 아니었습니다. 지금까지 성체 제브라피시의 복강 내 주입 방법을 살펴보았습니다.

저희 연구실에서는 포도당 용액을 복강 내(IP) 주입한 후 다양한 시간대별로 혈당 농도의 변화를 연구하고 있습니다. 하지만 방금 보여드린 이 기술은 연구자가 원하는 다른 용액을 주입하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 물고기를 천천히 마취시키고 조심스럽게 다루어야 함을 기억하십시오.

이것으로 모두 끝났습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.