Name: 수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 Neu1 시알리다제 활성을 형광 현미경으로 실시간 측정하여 대식세포의 수용체-리간드 상호작용을 분석하는 방법. 이 기술은 면역 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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MRS을 부여하여 부분 지원 자연 과학, 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC), 신경 과학 연구, ARC에 대한 해리 Botterell 재단, 그리고 가필드 켈리 순환기 연구 및 개발 기금에서입니다. SRA는 여왕의 대학 연​​구 대상과 로버트 J. 윌슨의 원정받는 사람입니다. PJ는 여왕의 졸업 수상과 로버트 J. 윌슨의 원정받는 사람입니다. AG와 SA는 여왕의 대학원 수상 수상자입니다. SF는 과학 기술 (OGSST)에서 온타리오 대학원 장학금받는했다. AG는 여왕의 프랭클린 브래켄 대학원 장학금받는 것입니다. SA는 여왕의 RS 맥롤린 대학원 장학금받는 것입니다.

1. 냉동 세포 대식 세포의 세포를 부활 <ol><li> -80에서 냉동 세포를 부활하기 전에 ° C 냉장고 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 5 μg / plasmocin의 ML과 보충 살균 필터 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM)을 사용하여 배지를 준비 하나 필요합니다. Plasmocin은 세포의 문화 mycoplasma 오염을 제거하고 방지하기 위해 우리의 연구에 사용되는 항생제 솔루션입니다. </li><li> 냉동 세포 중 하나가 병에 들어, 4 ML, 살균 생물 학적 봉쇄 후드에서 25cm 2 세포 배양 플라스크에 교양 매체 1 ML을 추가합니다. </li><li> 냉동 세포의 유리병은 -80 ° C의 냉동고에서 가져온 경우, 그들은 빠르게 약 2-3 분 소요 멸균 후드에 손 온난화에 의해 해동됩니다. </li><li> 즉시 세포가 해동되면서, 그들은 신속하게 1mL 피펫을 사용하여 살균 시설이 매체를 포함하고있는 술병으로 전송됩니다. </li><li> 세포를 포함하는 플라스크는 37 ° C와 5% CO 2에서 조직 문화 인큐베이터에 배치됩니다. </li><li> 그들이 거꾸로 현미경을 사용하여 75 % 90% 합류가 될 때까지 세포는 매일 성장과 준수를위한 검사. </li><li> 세포 배양 보육 동안, 12mm 원형 유리 슬라이드는 생물 학적 봉쇄 캐비닛에 1 시간을 위해 큰 유리는 배양 접시에 70 % 에탄올에서 그들을 다루는 소독 있으며, 알코올은 나중에 제거 reusage 보관하고, 젖은 유리 측면입니다 24 시간 또는 그들이 건조 때까지 UV 아래 캐비닛에 멸균 필터링 공기 흐름에 노출 남아 있습니다. </li></ol> 2. Sialidase 분석을위한 도금 셀 <ol><li> 세포를 도금하기 전에 하나의 무균 원형 유리 슬라이드는 신중하게 스테인레스 스틸 forcep, 톱니 모양의, &quot;4, 소독 불타는 전체 곡선을 사용하여 BD 팰컨 잘 하나 24 잘 뚜껑이있는 평면 바닥 조직 문화 처리 폴리스티렌 판 배치됩니다 . 75 %에 합류 세포 중 하나가 술병을 위해, 우리는 대개 문화 판 12 우물을 사용합니다. </li><li> 자기편 대식 세포 세포 들어, DMEM 시설 매체는 멸균 용기 캐비닛에 5 ML 멸균 피펫을 사용하여 플라스크에서 제거됩니다. 1X 무균 트리스와 함께 한번 자기편 세포를 씻고있는 혈청이 포함된 미디어를 제거하고 세포를 감추기에 충분 할만큼 산도 7.4에서 호수 버퍼 칼슘 매체 무료 (CMF) 인산 1 ML를 추가하는 생리 산도 7.4이 버퍼. 세포는 술병에서 발사 전까지는 세포는 약 10 분 또는 37 ° C 배양기에 배치됩니다. 플라스크는 부드럽게 누볐어이나 남아있는 자기편 세포를 풀어야 흔들리고 수 있습니다. </li><li> 술병에서 중단 세포의 제 1 ML하려면, DMEM 시설 중간 3 ML를 추가합니다. 정지 세포의 0.5 ML를 타고 sterilely 12mm 원형 유리 슬라이드를 포함하는 조직 교양 판에게 양도. 약 0.5 X 10 6 세포는 원형 유리 슬라이드로 전송됩니다. </li><li> 조직 배양 플레이트 포함하는 세포는 37 incubated 아르 ° C 5 % 세포가 원형 유리 슬라이드에 충실하기 위해 수 있도록 24 시간에 대한 CO 2. </li></ol> 3. Sialidase 분석 1. 컨트롤 만들기 <ol><li> 봉쇄 캐비닛 또는 실험실 벤치에서 순서대로 다음과 같은 성분 혼합하여 추가 : (1 엔드, 1slide, 25 X 75 X 1mm 프로스트) : 현미경 슬라이드를 삽입 4 MUNANA 1 μL DAKO + 1 μL를 끝으로 + 트리스 3 μL는 생리 산도 7.4 (TBS)을 버퍼. </li><li> 잘 세포를 포함하는 하나의 미디어를 제거한 후, 부드럽게 잘의 모퉁이에 4 &quot;forcep으로 원형 유리 슬라이드 리프트. 조심스럽게 forcep으로 유리 슬라이드를 제거 및 혼합 솔루션에 직면하고있는 세포로 슬라이드를 장소 현미경 슬라이드. </li><li> 바로, UV 필터 설정하고 형광 이미지를 캡처를위한 디지털 카메라를 가지고있다 에피 형광 현미경으로 microcope 슬라이드 가져가라. </li><li> 당신은 형광등 모드로 전환 후 세포를 볼 수 있고 때까지 위상 대조에서 현미경을 집중. 1 분, 2 분, 3 분 형광등 아래에있는 세포의 사진을 가져가라. 위상 대조 아래 세포의 단일 사진을 가져가라. </li></ol> 2. 긍정적인 테스트 만들기 <ol><li> 4 MUNANA 1 μL DAKO + 1 μL LPS의 + 2 μL + TBS 1 μL : 다른 현미경 슬라이드에있는 순서대로 다음과 같은 화합물 스팟. </li><li> 위의 단계 3.1.2에 3.1.4를 반복합니다. </li></ol> 3. Neuraminidase 억제제는 Tamiflu와 함께 긍정적인 테스트 만들기 <ol><li> 다른 현미경 슬라이드에 다음과 같은 순서에 다음과 같은 화합물을 스팟 : 4 MUNANA의 1μL DAKO + 1μL + LPS 2 μL + Tamiflu 1 μL. </li><li> 원형 유리 슬라이드에 살고 세포와 접촉하는 물질의 최종 농도가 5 희석 계수를해야합니다, Tamiflu의 농도는 생리 산도 7.4 버퍼 1X 트리스의 사전 준비. </li><li> 위의 단계 3.1.2에 3.1.4를 반복합니다. </li></ol> 4. 억제제의 농도의 결정은 Sialidase 활동의 50 % (IC 50) 억제하는 데 필요한 <ol><li> 세포를 둘러싼 형광을 계​​량하기 위해 이미지는 RBG을 측정하는 분석 플러그인과 ImageJ 1.38x를 사용하여 분석하고 있습니다. 세포를 둘러싸고있는 형광 50 무작위 현장 판독을 가지고 총 형광의 평균을 계산합니다. </li><li> IC 50 비선형 회귀를 사용하여 Y 축의 평균 형광으로부터 X 축에 (예를 들어, 로그 NG / ML) 로그 단위로 변환 억제제 농도의 플롯에서 생성됩니다. </li></ol> 5. 성공의 비밀 <ol><li> 문화의 세포가 mycoplasma에서 무료로 오염되어 있는지 확인하십시오. 우리는 일상적으로 이에 대한 제어하는​​ 문화 매체 Plasmocin을 사용합니다. </li><li> 인공 neuraminidase 기판, 4 MUNANA는 신선한 사용해야합니다. 준비 기판은 sialidase 분석을위한 일주일 이내 사용할 수 있습니다. </li><li> 세포주의 세포 표면에 낮은 수용체 표현이있다면, 하나는 자극에 대한 리간드의 높은 복용량을 사용할 수 있습니다. </li><li> 우리는 또한 이상의 여섯 번 passaged 세포들의 수용체 표현형을 잃을 수도 경험이있다. 갓, 부활 전지 교양하여야한다. </li></ol> 6. 대표 결과 첨부된을 대표하는 결과 sialidase 분석의 애니메이션 프로토콜 참조 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">PowerPoint 파일을</a> .

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

SRA와 PJ 똑같이 첫번째 저자로 기여.

라이브 대식 세포 세포 2 sialidase 활동을 감지하기 위해 새로 개발된 분석을 사용하여, 우리는 BMC - 2 복용량에 의존 방식으로뿐만 아니라 사는 대식 세포의 세포 DC - 2.4 돌기 세포에 거주 리간드 유도된 sialidase 활동에 sialidase 활동을 감지하는이 기술을 사용 , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 내유 선암 세포, 인간 WT 및 1140F01 및 WG0544 종류 I sialidosis의 fibroblast 세포. Tamiflu (oseltamivir 인산염)과 같은 Neuraminidase 억제제는 IC 50 0.0194의 μm의와 함께 BMC - 2 세포가 neuraminidase 억제제 데이 (2 - 데옥시 - 2 ,3 - dehydro위한 19.17 μm의의 IC 50와 비교하여 사는 thymoquinone 유발 sialidase 활동을 저해 DN - acetylneuraminic 산성) 5. ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation, 형광 마운팅 매질</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>타미플루 (Oseltamivir Phosphate)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 neu1 sialidase 활동 감지

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

포유류의 수신자 같은 수용체 (TLRs)는 병원균 - 관련 분자 패턴을 인식 수용체의 가족입니다. 뿐만 아니라 TLRs는 미생물의 중요한 센서 (예, 바이러스, 세균 및 기생충) 감염되며, 그들은 또한 가능성이 면역 질환으로 전염성 질환, 염증 질환, 그리고 pathophysiology에 중요한 역할을한다. 따라서, 감염증에 대한 TLR의 반응의 강도와 기간은 강력히 제어해야합니다. 이 센서 수용체들은 리간드 상호 작용과 신호 구성 요소의 구조적 무결성을 이해하는 것은 이후의 면역 보호를 위해 필수적인 것이 다음과 같습니다. 또한 센서 조작을 통해 질병 조작을위한 중요한 기회를 제공합니다. TLR 센서의 신호 경로가 잘 묘사되고 있지만, 매개 변수는 센서와 그 리간드 여전히 저조한 정의 남아 사이의 상호 작용을 통제. 우리는 최근 이전에 1,2을 관찰되지 않은 자연 리간드에 의해 TLR 활성화의 소설 메커니즘을 확인했습니다. 그것은 리간드 유도된 TLR 활성화가 밀접하게 Neu1 sialidase 활성화에 의해 제어됩니다 것을 제안합니다. 우리는 또한 Neu1가 단단히 Neu1 및 매트릭스 metalloproteinase - 9 (MMP - 9) 수용체 4 단지에 간 이야기를 포함 TrkA와 TrkB 3 번 neurotrophin 수용체를 조절보고있다. sialidase 분석 처음 GPCR Gαi 단백질 및 MMP - 9 5를 통해 macrophages, 돌기 세포 fibroblast 세포의 세포 표면에 Neu4 sialidase의 활성화에 새로운 리간드, thymoquinone를 찾을 사용되었습니다. TLR 수용체에 대한 우리의 데이터는 Neu1 sialidase는 TLR - 2, -3 및 -4 수용체 복잡한 이미이며, 두 수용체에 리간드 바인딩에 유도되고있는 것으로 나타났습니다. 활성 Neu1 sialidase의 hydrolyzes sialyl α - 2 TLR - 4 dimerization, MyD88/TLR4 복잡한 채용, NFkB의 활성화와 프로 염증성 세포 반응에 steric hinderance를 제거하는 바인딩 리간드에서 멀리 ,3 - 링크 β - galactosyl 잔류물. 공동 보고서에서 Neu1의 sialidase는 대식 세포 세포 6 phagocytosis 조절을 보여줘왔다. 함께 촬영 sialidase 분석은 리간드 유도된 수용체 활성화의 분자 메커니즘에 강력한 통찰력으로 우리를 제공합니다. Neu1 sialidase과 TLR의 활성화 사이의 정확한 관계가, Trk 수용체는 아직 완전히 elucidated 수 있지만, 그것은 세포 규제 경로에 신규 또는 선구적인 접근 방식을 나타내는 것입니다.

sialidase 분석은 미생물의 감염 라이브 macrophages의 세포 표면에 수용체 수준에서 염증성 질환에 관여 TLR 센서 소설 분자 메커니즘 (들)을 명료하게하다하는 간단한 기술 접근​​이다.

수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지

포유류의 Toll-유사 수용체(TLRs)는 병원체 관련 분자 패턴을 인식하는 수용체 군입니다. TLR은 ...의 핵심 센서일 뿐만 아니라...

다음 실험의 전체적인 목표는 특정 수용체에 리간드가 결합함에 따라 유도되는 세포 내 new one sase 활성을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 24웰 조직 배양 플레이트 내의 12 millimeter 원형 유리 슬라이드 위에서 세포를 24시간 동안 배양합니다. 그 다음 단계로, 유리 슬라이드에 부착된 살아있는 세포를 현미경 슬라이드 위에서 미리 준비한 sase 기질과 수용체 리간드의 혼합물(특정 억제제 포함 또는 제외)에 직접 접촉시킵니다.형광 이미지를 시각화하고 디지털로 캡처하기 위해 현미경 슬라이드를 즉시 형광 현미경 아래에 놓습니다. 시간이 경과함에 따라 결과가 도출됩니다. 이는 에피 형광 현미경 하에서 세포 주변의 청색 형광 강도를 바탕으로, 리간드 처리된 살아있는 세포의 세포 표면에서 나타나는 new one sase 활성의 변화를 보여줍니다.분광 광도 분석과 같은 기존 방법보다 이 기술을 사용했을 때의 주요 장점은 시약을 더 적게 사용한다는 점입니다. 또한 살아있는 세포 내에서 sase 활성을 관찰하고 이미지를 캡처할 수 있습니다. 이 방법은 잠재적인 새로운 리간드-수용체 상호작용을 조사하거나, 특정 효소 또는 단백질 억제제가 수용체 활성화에 미치는 영향을 확인하는 등 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다.해당 절차의 시연은 본 연구실의 전 PhD 학생이자 연구 연구에서 이 분석법을 사용하는 Ray Amit 박사와 PT Gath 박사가 진행하겠습니다. 동결된 대식세포를 재생하기 전에, 10% fetal bovine serum과 5 µg/mL의 항생제 plasmin이 첨가된 멸균 여과된 delcos, modified eagles medium을 사용하여 배양액을 준비하십시오. 그다음, 동결 세포 바이알당 4 mL의 배양액을 25 cm² 세포 배양 플라스크에 넣고, -80 °C 냉동고에서 동결 세포 바이알을 꺼내어 멸균 바이오하자드 밀폐 후드 내에서 손의 온기로 빠르게 해동하십시오.이 과정은 약 2~3분 정도 소요됩니다. 세포가 해동되는 즉시 1 mL 멸균 피펫을 사용하여 세포를 조건화 배지가 들어 있는 세포 배양 플라스크로 빠르게 옮깁니다. 세포가 담긴 플라스크를 도립 현미경을 사용하여 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.SASE 분석을 위한 세포 플레이팅 며칠 전, 세포가 75%에서 90%까지 합류(confluent)될 때까지 매일 성장 및 부착 상태를 확인하십시오. 세포를 플레이팅할 12 millimeter 원형 유리 슬라이드를 준비하십시오. 이 작업은 생물학적 위험물 밀폐 캐비닛 내에서 수행하십시오.슬라이드를 커다란 유리 페트리 접시에 넣고 100% ethanol에 1시간 동안 담가 멸균합니다. 알코올을 제거하고, 젖은 유리 슬라이드를 UV 램프가 켜진 캐비닛 내의 멸균 여과 공기에 24시간 동안 또는 도말이 가능할 정도로 마를 때까지 노출시킵니다. 먼저 화염 멸균법을 사용하여 4인치 길이의 곡선형 톱니 모양 스테인리스 스틸 핀셋을 멸균합니다.그 다음, 포셉을 사용하여 24웰 평평한 바닥의 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 멸균된 원형 유리 슬라이드를 한 장씩 조심스럽게 넣습니다. 5 mL 멸균 피펫을 사용하여 부착성 대식세포가 들어 있는 플라스크에서 DMEM 조건화 배지를 제거합니다. 혈청 함유 배지를 모두 제거하기 위해 1x 멸균 tris 완충 식염수 pH 7.4로 세포를 한 번 세척합니다.다음으로, pH 7.4의 칼슘 및 마그네슘이 제거된 인산염 완충 식염수 1 mL를 첨가합니다. 세포를 37 °C 인큐베이터에 약 10분 동안 또는 플라스크에서 세포가 떨어지기 시작할 때까지 둡니다. 세포가 떨어지면, 부유 세포에 DMEM 조건화 배지 3 mL를 첨가합니다.그 다음, 약 0.5백만 개의 세포가 포함된 현탁액 0.5 milliliters를 24웰 플레이트 내의 각 12 millimeter 원형 유리 슬라이드에 옮깁니다. 대식세포가 포함된 조직 배양 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포가 원형 유리 슬라이드에 부착되도록 합니다. sase 활성 분석은 세 개의 서로 다른 조건에서 세 개의 개별 현미경 슬라이드를 사용하여 수행합니다. 음성 대조군 역할을 하는 첫 번째 슬라이드에서는대조군 세포는 마운팅 용액, ANA용 뉴라미니다제 기질 및 tris 완충 식염수에 노출시키며, toll-like 수용체 리간드인 LPS는 처리하지 않습니다. 두 번째 슬라이드의 세포는 마운팅 용액, ANA, toll-like 수용체 리간드인 LPS 및 tris 완충 식염수에 노출시킵니다.세 번째 슬라이드에서는 세포를 ANA, LPS Tris, 완충 식염수 및 뉴라미니데이스 억제제인 Tamiflu가 포함된 고정액에 노출시킵니다. 세 가지 분석법은 현미경 슬라이드 위의 화합물 혼합물만 다르므로, 두 번째 분석법에 대한 절차만 시연하겠습니다. 현미경 슬라이드를 실험대에 놓고 다음 화합물들을 순서대로 첨가합니다.마운팅 매질 1 µL를 넣고, 이어서 LPS 2 µL를 넣은 다음, 마지막으로 pH 7.4의 Tris 완충 식염수 3 µL를 넣습니다. 다음으로, 세포가 포함된 24웰 플레이트의 한 웰에서 배지를 제거합니다. 다음 단계는 4인치 핀셋을 사용하여 조직 배양 플레이트의 웰에서 원형 유리 커버슬립을 깨뜨리지 않고 제거해야 하므로, 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다.원형 유리 슬라이드를 웰의 구석으로 조심스럽게 들어 올린 다음, 주의해서 제거하여 세포가 아래를 향하도록 용액 혼합물에 놓습니다. 현미경 슬라이드를 즉시 UV 필터가 설정되어 있고 형광 이미지 캡처를 위한 디지털 카메라가 장착된 에피 형광 현미경으로 옮깁니다. 위상차 모드에서 세포가 보일 때까지 초점을 맞춘 다음 형광 모드로 전환합니다.형광 모드에서 1분, 2분, 3분 간격으로 세포 이미지를 획득합니다. 또한, 위상차 방식으로 세포 이미지 한 장을 획득합니다. sase 분석 실험 결과가 여기에 표시되어 있습니다.먼저, 음성 대조군으로서 유리 슬라이드에 부착된 생세포를 준비합니다. 이를 마운팅 미디어와 폼 기질의 혼합물 점적 부위에 직접 접촉시켰을 때, IP sase 활성이 존재한다면 기질이 가수분해되어 유리 에틸 룸비온(ethyl lum beone)이 생성됩니다. 이는 365 nanometers에서 여기시킨 후 450 nanometers에서 형광 방출을 나타내며, 기질 첨가 2분 후에 측정합니다.이 형광 이미지에서는 세포 주변에 sase 활성이 나타나지 않습니다. 다음 이미지는 양성 대조군 SASE 분석 결과로, 유리 슬라이드에 부착된 살아있는 세포를 마운팅 배지, substrate 4 및 TLR 4 리간드인 LPS의 혼합물 반점과 직접 접촉시킨 결과입니다. substrate는 sase 효소에 의해 가수분해되어 유리 ethyl lum beone을 생성하였으며, substrate와 LPS를 첨가한 2분 후에 촬영한 형광 이미지는 세포 주변에 높은 수준의 sase 활성이 있음을 나타냅니다.그러나 살아있는 세포를 마운팅 배지, 나노 기질 TLR4 리간드 LPS, 그리고 뉴라미니데이스 억제제인 Tamiflu의 스팟 혼합물과 직접 접촉시킨 결과, 억제제의 농도에 따라 sase 활성이 크게 감소하거나 더 이상 검출되지 않았습니다. 마지막으로, 이 그래프는 약제 농도의 로그 값에 따른 sase 활성의 감소량을 플로팅하여 결정한 Tamiflu와 Oseltamivir carboxylate의 50% 억제 농도를 보여줍니다. 각 그룹의 세포 주변 평균 형광은 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다. 이 절차를 수행할 때, Sade 분석을 시작하기 24시간 전에 24-웰 조직 배양 플레이트의 원형 유리 커버 슬립 위에서 세포를 배양해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.또한, 본 분석에 사용되는 모든 시약은 분석을 시작하기 전에 미리 준비해야 합니다.

detection-neu1-sialidase-activity-regulating-toll-like-receptor

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 대식세포에서 전사 인자인 핵인자-카파-B(NF-κB) 및 활성인자 단백질-1(AP-1)의 톨-유사 수용체(TLR) 의존적 활성을 조사하는 분석을 보여줍니다. TLR은 손상 관련 분자 패턴(DAMP)을 인식하면 전염증 신호 연쇄 반응을 유발하여 NF-κB 및 AP-1을 활성화합니다. 공학적 리포터 대식세포는 NF-κB 및 AP-1 활성화 시 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP)를 생성하며, 이는 발색 반응을 통해 검출됩니다.

대식세포의 TLR-dependent NF-&kcy;B/AP-1 transcription factor signaling에 대한 분석

이 비디오는 TLR(Toll-like receptor) 신호 전달을 억제하는 잠재적인 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하기 위한 리포터 세포 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드와 혼합된 지질다당류(LPS)를 리포터 단백질인 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP) 및 루시페라아제(luciferase)를 발현하는 리포터 대식세포에 도입하는 것을 포함합니다. 하이브리드에 의해 매개되는 LPS 유도 TLR 신호의 감소는 리포터 신호를 측정하여 결정됩니다.

톨 유사 수용체 신호 억제를 위해 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하는 분석

수지상 세포 (DC가) nigericin와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 합성 퓨린, R848의 TLR8 인식에 응답하여 IL-1β 분비, 따라서 IL-1β는 NLRP3의 inflammasome을 활동을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 염색법, 면역 블롯 및 ELISA 정확하게 IL-1β의 발현을 통해 NLRP3의 프라이밍 inflammasome을 및 활성화를 측정하는 데 사용됩니다.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

우리는 마우스 간의 간과 우유에서 N- 아세틸 뉴 라민 산 (N-acetylneuraminic acid)과 N- 글리콜로 누 라민 산 (N-glycolylenuraminic acid)을 측정하기위한 HPLC 기반 방법을 설명합니다.

야생형과 간암의 시알 산의 결정<em&gt; CMAH</em&gt; 넉 아웃 마우스.

Toll-like receptor (TLR) 신호 전달은 많은 인간 염증성 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을하며, 생체 활성 나노 입자에 의한 TLR 반응을 조절하는 것은 많은 염증성 질환에서 유익한 것으로 기대된다. THP-1 세포 기반 리포터 세포는 TLR 신호 전달의 새로운 억제제를 확인하기위한 다양하고 강력한 스크리닝 플랫폼을 제공합니다.

Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

시알리다아제 처리를 사용하여 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 탈시알릴화된 인간 단핵구 유래 수지상 세포(mo-DC)를 생성하는 독특하고 포괄적인 프로토콜이 제시됩니다. 또한, mo-DC의 표현형 및 기능적 특성을 평가하고, 시알리다아제 처리가 mo-DC의 성숙 수준을 어떻게 향상시키는지를 평가하는 방법이 기재되어 있다.

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

배우세요 Neu1 시알리다제 활성을 형광 현미경으로 실시간 측정하여 대식세포의 수용체-리간드 상호작용을 분석하는 방법. 이 기술은 면역 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지

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