수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지

다음 실험의 전체적인 목표는 특정 수용체에 리간드가 결합함에 따라 유도되는 세포 내 new one sase 활성을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 24웰 조직 배양 플레이트 내의 12 millimeter 원형 유리 슬라이드 위에서 세포를 24시간 동안 배양합니다. 그 다음 단계로, 유리 슬라이드에 부착된 살아있는 세포를 현미경 슬라이드 위에서 미리 준비한 sase 기질과 수용체 리간드의 혼합물(특정 억제제 포함 또는 제외)에 직접 접촉시킵니다.

형광 이미지를 시각화하고 디지털로 캡처하기 위해 현미경 슬라이드를 즉시 형광 현미경 아래에 놓습니다. 시간이 경과함에 따라 결과가 도출됩니다. 이는 에피 형광 현미경 하에서 세포 주변의 청색 형광 강도를 바탕으로, 리간드 처리된 살아있는 세포의 세포 표면에서 나타나는 new one sase 활성의 변화를 보여줍니다.

분광 광도 분석과 같은 기존 방법보다 이 기술을 사용했을 때의 주요 장점은 시약을 더 적게 사용한다는 점입니다. 또한 살아있는 세포 내에서 sase 활성을 관찰하고 이미지를 캡처할 수 있습니다. 이 방법은 잠재적인 새로운 리간드-수용체 상호작용을 조사하거나, 특정 효소 또는 단백질 억제제가 수용체 활성화에 미치는 영향을 확인하는 등 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다.

해당 절차의 시연은 본 연구실의 전 PhD 학생이자 연구 연구에서 이 분석법을 사용하는 Ray Amit 박사와 PT Gath 박사가 진행하겠습니다. 동결된 대식세포를 재생하기 전에, 10% fetal bovine serum과 5 µg/mL의 항생제 plasmin이 첨가된 멸균 여과된 delcos, modified eagles medium을 사용하여 배양액을 준비하십시오. 그다음, 동결 세포 바이알당 4 mL의 배양액을 25 cm² 세포 배양 플라스크에 넣고, -80 °C 냉동고에서 동결 세포 바이알을 꺼내어 멸균 바이오하자드 밀폐 후드 내에서 손의 온기로 빠르게 해동하십시오.

이 과정은 약 2~3분 정도 소요됩니다. 세포가 해동되는 즉시 1 mL 멸균 피펫을 사용하여 세포를 조건화 배지가 들어 있는 세포 배양 플라스크로 빠르게 옮깁니다. 세포가 담긴 플라스크를 도립 현미경을 사용하여 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.

SASE 분석을 위한 세포 플레이팅 며칠 전, 세포가 75%에서 90%까지 합류(confluent)될 때까지 매일 성장 및 부착 상태를 확인하십시오. 세포를 플레이팅할 12 millimeter 원형 유리 슬라이드를 준비하십시오. 이 작업은 생물학적 위험물 밀폐 캐비닛 내에서 수행하십시오.

슬라이드를 커다란 유리 페트리 접시에 넣고 100% ethanol에 1시간 동안 담가 멸균합니다. 알코올을 제거하고, 젖은 유리 슬라이드를 UV 램프가 켜진 캐비닛 내의 멸균 여과 공기에 24시간 동안 또는 도말이 가능할 정도로 마를 때까지 노출시킵니다. 먼저 화염 멸균법을 사용하여 4인치 길이의 곡선형 톱니 모양 스테인리스 스틸 핀셋을 멸균합니다.

그 다음, 포셉을 사용하여 24웰 평평한 바닥의 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 멸균된 원형 유리 슬라이드를 한 장씩 조심스럽게 넣습니다. 5 mL 멸균 피펫을 사용하여 부착성 대식세포가 들어 있는 플라스크에서 DMEM 조건화 배지를 제거합니다. 혈청 함유 배지를 모두 제거하기 위해 1x 멸균 tris 완충 식염수 pH 7.4로 세포를 한 번 세척합니다.

다음으로, pH 7.4의 칼슘 및 마그네슘이 제거된 인산염 완충 식염수 1 mL를 첨가합니다. 세포를 37 °C 인큐베이터에 약 10분 동안 또는 플라스크에서 세포가 떨어지기 시작할 때까지 둡니다. 세포가 떨어지면, 부유 세포에 DMEM 조건화 배지 3 mL를 첨가합니다.

그 다음, 약 0.5백만 개의 세포가 포함된 현탁액 0.5 milliliters를 24웰 플레이트 내의 각 12 millimeter 원형 유리 슬라이드에 옮깁니다. 대식세포가 포함된 조직 배양 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포가 원형 유리 슬라이드에 부착되도록 합니다. sase 활성 분석은 세 개의 서로 다른 조건에서 세 개의 개별 현미경 슬라이드를 사용하여 수행합니다. 음성 대조군 역할을 하는 첫 번째 슬라이드에서는

대조군 세포는 마운팅 용액, ANA용 뉴라미니다제 기질 및 tris 완충 식염수에 노출시키며, toll-like 수용체 리간드인 LPS는 처리하지 않습니다. 두 번째 슬라이드의 세포는 마운팅 용액, ANA, toll-like 수용체 리간드인 LPS 및 tris 완충 식염수에 노출시킵니다.

세 번째 슬라이드에서는 세포를 ANA, LPS Tris, 완충 식염수 및 뉴라미니데이스 억제제인 Tamiflu가 포함된 고정액에 노출시킵니다. 세 가지 분석법은 현미경 슬라이드 위의 화합물 혼합물만 다르므로, 두 번째 분석법에 대한 절차만 시연하겠습니다. 현미경 슬라이드를 실험대에 놓고 다음 화합물들을 순서대로 첨가합니다.

마운팅 매질 1 µL를 넣고, 이어서 LPS 2 µL를 넣은 다음, 마지막으로 pH 7.4의 Tris 완충 식염수 3 µL를 넣습니다. 다음으로, 세포가 포함된 24웰 플레이트의 한 웰에서 배지를 제거합니다. 다음 단계는 4인치 핀셋을 사용하여 조직 배양 플레이트의 웰에서 원형 유리 커버슬립을 깨뜨리지 않고 제거해야 하므로, 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다.

원형 유리 슬라이드를 웰의 구석으로 조심스럽게 들어 올린 다음, 주의해서 제거하여 세포가 아래를 향하도록 용액 혼합물에 놓습니다. 현미경 슬라이드를 즉시 UV 필터가 설정되어 있고 형광 이미지 캡처를 위한 디지털 카메라가 장착된 에피 형광 현미경으로 옮깁니다. 위상차 모드에서 세포가 보일 때까지 초점을 맞춘 다음 형광 모드로 전환합니다.

형광 모드에서 1분, 2분, 3분 간격으로 세포 이미지를 획득합니다. 또한, 위상차 방식으로 세포 이미지 한 장을 획득합니다. sase 분석 실험 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

먼저, 음성 대조군으로서 유리 슬라이드에 부착된 생세포를 준비합니다. 이를 마운팅 미디어와 폼 기질의 혼합물 점적 부위에 직접 접촉시켰을 때, IP sase 활성이 존재한다면 기질이 가수분해되어 유리 에틸 룸비온(ethyl lum beone)이 생성됩니다. 이는 365 nanometers에서 여기시킨 후 450 nanometers에서 형광 방출을 나타내며, 기질 첨가 2분 후에 측정합니다.

이 형광 이미지에서는 세포 주변에 sase 활성이 나타나지 않습니다. 다음 이미지는 양성 대조군 SASE 분석 결과로, 유리 슬라이드에 부착된 살아있는 세포를 마운팅 배지, substrate 4 및 TLR 4 리간드인 LPS의 혼합물 반점과 직접 접촉시킨 결과입니다. substrate는 sase 효소에 의해 가수분해되어 유리 ethyl lum beone을 생성하였으며, substrate와 LPS를 첨가한 2분 후에 촬영한 형광 이미지는 세포 주변에 높은 수준의 sase 활성이 있음을 나타냅니다.

그러나 살아있는 세포를 마운팅 배지, 나노 기질 TLR4 리간드 LPS, 그리고 뉴라미니데이스 억제제인 Tamiflu의 스팟 혼합물과 직접 접촉시킨 결과, 억제제의 농도에 따라 sase 활성이 크게 감소하거나 더 이상 검출되지 않았습니다. 마지막으로, 이 그래프는 약제 농도의 로그 값에 따른 sase 활성의 감소량을 플로팅하여 결정한 Tamiflu와 Oseltamivir carboxylate의 50% 억제 농도를 보여줍니다. 각 그룹의 세포 주변 평균 형광은 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다. 이 절차를 수행할 때, Sade 분석을 시작하기 24시간 전에 24-웰 조직 배양 플레이트의 원형 유리 커버 슬립 위에서 세포를 배양해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.

또한, 본 분석에 사용되는 모든 시약은 분석을 시작하기 전에 미리 준비해야 합니다.