Name: 세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 학습하세요 세포 수축 정량화를 위한 유연한 세포외 기질 기판 제작 방법을 배우세요. 폴리아크릴아마이드 겔과 견인력 현미경을 활용하여 세포-기질 상호작용을 연구하는 기술입니다.

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우리는 셀룰러 견인 세력 (Sabass 외., 2008)의 부량에 사용되는 전산 추적 소프트웨어 울리히 슈바르츠의 실험실을 감사드립니다. 이 작품은 버로우즈 웰컴 경력 수상과 ML Gardel 의료 과학 국립 연구소 서비스 어워드 (5 T32 GM07281) SP 겨울에하는 NIH 원장의 파이 오니아 수상 (DP10D00354)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

절차는 전산 추적 루틴 (Sabass 외., 2008)의 구현과 함께, 견인 힘 현미경 (TFM) 실험의 설정을 위해 여기에서 설명한, 마이크론 규모의 공간 해상도 세포 세력의 부량 수 있도록합니다. 실험 프로토콜을 최적화하기 위해서는 ECM의 리간드의 균일한 코팅을 가진 순수하고 균일한 겔 기판을 형성하는 것이 중요합니다. 우리는 아래의 잠재적인 함정을 논의 : 비 균일한 겔 표면 또는 눈물 : 우리의 경험에서, 멋진 유니폼 젤을 형성하는 중요한 나타나는 몇 가지 단계가 있습니다. 귀하의 겔 표면 안에 어두운 구멍을 가지고 나타나는 경우에 대한 중합에 젤에 대한 고르지 소수성 표면을 형성 초과 비 - X의 방울이 완전히 유리 슬라이드에서 제거되지 않은 가능성이 높습니다. 또한, 우리는 매우 부드러운 젤에 대한 (&lt;100 PA), 겔 표면으로 인해 제약 coverslip 표면에 점착 성의 PAA 젤의 팽창에 ...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아마이드(Acrylamide)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% 비스-아크릴아마이드(Bis-acrylamide)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(Ammonium persulfate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>40nm 형광 미세구체(fluorescent micro-spheres)</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>공초점 이미징 챔버(Confocal imaging chamber, RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 스피너(Coverslip spinner)</td><td>자체 제작</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>자외선 램프 CL1000(Ultraviolet lamp CL1000)</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 랙(Stainless steel rack)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>하이드라진 하이드레이트(Hydrazine hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>메타-과요오드산나트륨(Sodium meta-periodate)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올(Isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴(Fibronectin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐(Collagen)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립(Coverslips, #1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데하이드(Glutaraldehyde)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>아세트산(Acetic Acid)</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 수축을 quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

세포외 매트릭스 (ECM)에 세포 부착의 조절은 세포 마이 그 레이션 및 ECM의 리모델링을 위해 필수적입니다. 초점 adhesions은 macromolecular 어셈블리 그 부부 ECM에 수축성 F - 굴지의 cytoskeleton을하고 있습니다. 이 연결은 세포막에 걸쳐 기본 기판에 세포 기계 병력의 전송을 허용합니다. 최근 작품은 ECM의 기계적 성질은 초점 접착력 및 F - 굴지의 형태뿐만 아니라, 세포 분화, 분열, 증식 및 마이 그 레이션 등 다양한 생리 과정을 조절 표시하고 있습니다. 따라서, 세포 배양 기판의 사용이 정확하게 제어 및 ECM 기계적 특성을 조절하기 위해 점점 더 널리 사용 방법이되었습니다. 자기편 세포에 초점 adhesions의 견인 세력을 계량하기 위해 준수 기판은 고해상도 이미지와 방법 칭했다 견인 힘 현미경 (TFM)에서 전산 기술과 함께 사용됩니다. 이 기술은 세포의 수축에 의해 유도 기판 deformations의 로컬 크기와 방향의 측정에 의존하고 있습니다. 찬란 태그 단백질의 고해상도 형광 현미경와 함께, 그것은 견인 세력과 cytoskeletal 조직 및 개조를 상호 연관시킬 수 있습니다. 여기 우리는 세포 수축 측정에 적합합니다 잘 특징, 조정할 수있는 기계 강성과 세포 배양 기판을 만들 목적으로 2 차원, 호환 매트릭스의 준비에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 polyacrylamide의 hydrogels의 제조 등 젤에서 ECM의 단백질 코팅, 젤에 도금 세포 및 재관류 챔버를 사용하여 고해상도 공촛점 현미경을 포함합니다. 또한, 우리는 인용 TFM 프로토콜을 사용하여 세포 세력의 위치와 크기를 보여주는 데이터의 대표 샘플을 제공합니다.

이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

세포외 기질(ECM)에 대한 세포 부착의 조절은 세포 이동 및 ECM 재구성에 필수적입니다. 국소 부착(Focal adhesions)은 ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 수축을 조절하고 정량화하기 위한 유연한 매트릭스를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 커버슬립을 활성화하여 매트릭스가 고정될 수 있도록 함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 활성화된 커버슬립 위에 폴리아크릴아마이드 겔을 중합시키는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 젤 위에 세포를 도말하고 부착되도록 하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 젤을 이미징하여 견인력 현미경(traction force microscopy) 프로토콜로 분석할 데이터를 생성하는 것입니다. 최종적으로 견인력 현미경을 통해 세포가 매트릭스에 견인력을 가하는 모습을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 시카고 대학교 물리학과 및 생물물리 역학 연구소의 Margaret ELL 실험실 소속 Yvonne Eons입니다. 저는 같은 실험실의 Steven Winter입니다. 오늘은 세포 수축력을 측정하기 위한 컴플라이언트 매트릭스(compliant matrices) 제작 절차를 보여드리고자 합니다.저희 실험실에서는 수축성 액틴 마이오신 네트워크를 연구하기 위해 이 절차들을 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 커버슬립 활성화 전에, 미리 준비한 22 by 40 millimeter 1.5번 커버슬립 여러 개를 배치하십시오.커버슬립들이 서로 닿지 않게 간격을 둔 스테인리스 스틸 랙에서 70% ethanol로 헹굽니다. 화학 흄후드 내에서 사각 유리 용기에 isopropanol을 사용하여 2% three or minor profile trimeth 용액을 준비합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 three or minoro profile을 첨가합니다.플라스틱과의 반응성 때문에 트라이메톡시(Trimeth oxy)를 사용하며, 커버슬립을 이 용액에 완전히 담근 후 흄 후드 내의 교반기 위에서 10분 동안 교반하며 배양합니다. 커버슬립을 담가둔 후, 이중 증류수에 담가 세척합니다. 마지막 교체 후 총 네 번 물을 갈아줍니다.교반하며 10분 동안 담가 둡니다. 그 다음, 약 37 °C의 인큐베이터에서 커버슬립을 10분 동안 건조시킵니다. 건조가 완료되면 상온으로 식힙니다.커버슬립을 이중 증류수로 제조한 1% Glutaraldehyde 용액에 담급니다. 교반기 위의 유리 사각 접시에서 30분 동안 처리하십시오. 반드시 깨끗한 접시를 사용해야 합니다.그렇지 않으면 나중에 용액이 탁해 보일 수 있습니다. 커버슬립을 2회 증류

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

이 동영상은 전기 세포-기질 임피던스 감지(ECIS)를 사용하여 대동맥 평활근 세포(SMC) 수축을 측정하는 방법을 설명합니다. ECIS는 세포의 이동을 측정하며 수축을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

체외 SMC 수축 측정: 전기 세포 기질 임피던스 감지를 사용하여 평활근 세포 수축을 평가하는 비침습적 방법

이 프로토콜은 시험 관내에서 근육 세포의 수축력을 측정하기위한 유연한 배양 표면과 같은 실리콘 마이크로 캔틸레버의 사용을 설명한다. 셀룰러 수축 측정 기록하고, 시험 관내에서 수축력을 측정하는 비 침습적이고 확장 가능한 시스템을 제공하고, 힘의 판독 값으로 변환 할 수 외팔보 굽힘을 야기.

마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해 체외

여기에서는 상피-중간엽 전이를 거친 중간엽 세포에서 수축 기능을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발 및 적용에 대해 설명합니다.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

우리는 토끼 심근 세포에서 GtACR1 활성화의 전기 기계적 효과를 평가하기위한 프로토콜을 제시한다. 당사는 세포 격리, 배양 및 아데노바이러스 전이, 패치 클램프 및 탄소 섬유 기술로 기능적 실험에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가

이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.

마이크로 패턴화된 엘라스토머를 이용한 단일 세포 수축성의 단순화된 고처리량 분석

인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축 기능 및 세포 무결성의 변화 분석은 비임상 약물 개발에 매우 중요합니다. 하이브리드 96웰 세포 분석 시스템은 임상 단계로의 안전한 전환에 필요한 신뢰할 수 있는 인간 관련 결과를 위해 실시간 및 생리학적 방식으로 두 파라미터를 모두 처리합니다.

전임상 심장 위험 평가를 위해 인간 iPSC 유래 심근 세포의 구조적 및 수축성 변화를 평가하기위한 하이브리드 세포 분석 시스템

이 프로토콜은 전임상 개발 중 약물에 의한 수축성 변화를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼인 MyoBLAZER 시스템을 사용하여 기증자 심장에서 성인 인간 원발성 심근세포의 수축성을 측정하는 방법을 설명합니다.

고립된 성인 인간 원발성 심근세포의 심장 수축성 측정

학습하세요 세포 수축 정량화를 위한 유연한 세포외 기질 기판 제작 방법을 배우세요. 폴리아크릴아마이드 겔과 견인력 현미경을 활용하여 세포-기질 상호작용을 연구하는 기술입니다.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

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