세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

본 절차의 전반적인 목표는 세포 수축을 조절하고 정량화하기 위한 순응성 매트릭스를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 커버슬립을 활성화하여 매트릭스가 고정될 수 있도록 함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 활성화된 커버슬립 위에 폴리아크릴아마이드 겔을 중합시키는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 겔 위에 세포를 도말하여 부착시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 겔을 이미지화하여 견인력 현미경(traction force microscopy) 프로토콜로 분석할 데이터를 생성하는 것입니다. 궁극적으로, 견인력 현미경을 통해 세포가 기질에 견인력을 가하는 것을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 시카고 대학교 물리학과 및 생물물리학 역학 연구소의 Margaret ELL 연구실 소속 Yvonne Eons입니다. 저는 같은 연구실의 Steven Winter입니다. 오늘은 세포 수축 측정을 위한 유연한 매트릭스를 제작하는 절차를 보여드리고자 합니다.

저희 연구실에서는 수축성 액틴-미오신 네트워크를 연구하기 위해 이 절차들을 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 커버슬립 활성화 전에, 이전에 22 by 40 millimeter 1.5번 커버슬립 여러 장을 배치했습니다.

커버슬립이 서로 닿지 않도록 간격을 둔 상태로 스테인리스 스틸 랙에 넣고 70% ethanol로 헹굽니다. 화학 흄 후드 내에서 사각 유리 접시에 isopropanol로 희석한 2% three or minor profile trimeth 용액을 준비합니다. 유리 파스 pipette을 사용하여 three or minoro profile을 첨가합니다.

플라스틱과의 반응성 때문에 Trimethoxy 용액에 커버슬립을 완전히 담그고, 흄 후드 내의 교반기 위에서 교반하며 10분 동안 배양합니다. 커버슬립을 적신 후, 2회 증류수에 담가 세척합니다. 마지막 교체 후 총 4번 물을 갈아줍니다.

교반하며 10분 동안 담가 둡니다. 그 다음, 약 37 °C의 인큐베이터에서 커버 슬립을 10분 동안 건조합니다. 건조가 완료되면 실온으로 식힙니다.

커버슬립을 2회 증류수로 제조한 1% Glutaraldehyde 용액에 담급니다. 교반기 위의 유리 사각 접시에서 30분 동안 처리하십시오. 깨끗한 접시를 사용해야 합니다.

그렇지 않으면 이후에 용액이 탁하게 보일 수 있습니다. 교반하면서 2중 증류수로 3회 세척하며, 각 세척 단계마다 10분 동안 진행합니다. 다음으로, 먼지가 유입되지 않도록 커버 슬립을 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 건조합니다.

건조가 완료되면 커버슬립을 먼지가 없는 건조한 곳에 최대 2개월 동안 보관하십시오. 폴리아크릴아미드 또는 PAA 겔을 준비하려면, 먼저 RI 프로토콜에 기술된 대로 40% acrylamide와 2% bis acrylamide를 사용하여 Acrylamide bis. Acrylamide Mix의 스탁 용액을 만듭니다.

진공 챔버에서 아크릴아마이드 용액을 20분 동안 탈기(DGA)합니다. 이는 겔 내부의 산소를 제거하여 중합 반응이 억제되는 것을 방지하기 위함입니다. 그동안 10% 과황산암모늄 또는 APS 용액을 준비합니다.

그런 다음 Rain X 와이프로 1x3인치 현미경 유리 슬라이드를 닦아 유리 슬라이드 표면을 소수성으로 만듭니다. 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 먼지를 제거함으로써 겔 표면이 매끄럽게 유지되도록 합니다. 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮어 둡니다.

그다음 진공 챔버에서 아크릴아마이드 용액을 꺼내고 형광 비즈를 추가합니다. 겔 중합을 시작하려면 TM E 0.75 µL와 10%a PS 2.5 µL를 첨가합니다. 피펫팅으로 용액을 가볍게 섞어줍니다. 다음으로, 미리 준비한 소수성 현미경 슬라이드에 아크릴아마이드 용액 10~12 µL를 도포합니다.

활성화된 22 by 40 밀리미터 커버슬립을 액적 위에 놓습니다. 겔 용액이 커버슬립 전체를 덮어야 합니다. 용액 내에 기포가 생겼다면 이를 매끄럽게 제거합니다.

겔 용액을 실온에서 약 10분 동안 중합시킵니다. 중합이 완료되면 겔이 커버 슬립의 가장자리에서 떨어집니다. 핀셋의 얇은 끝부분을 사용하여 겔이 부착된 커버 슬립을 현미경 슬라이드 표면에서 조심스럽게 제거합니다.

엑스트라셀룰러 매트릭스(extracellular matrix) 또는 ECM 단백질을 겔에 가교시키기 위해, 겔 표면의 수분 상태를 유지할 수 있도록 2중 증류수가 담긴 페트리 접시에 겔을 담급니다. 먼저, SULF san par 분말을 무수 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulf oxide) 또는 DMSO에 녹여 40 µL의 sulfur san par 작업 용액 분주액을 준비합니다. 다음으로, 커버슬립 스피너를 짧게 사용하여 겔 표면의 2중 증류수를 제거합니다.

사용 직전에 겔이 마르지 않도록 주의하십시오. DMSO에 희석된 sulfur sampa 분주액을 2회 증류수로 희석하고, 겔 표면의 중앙에 약 200 µL를 도포합니다. 그런 다음 UV 가교결합기(crosslinker) 오븐에서 겔 표면에 UV 광선을 조사합니다.

UV 노출 후, 커버슬립을 신선한 2중 증류수가 담긴 비커에 담급니다. 커버슬립 스피너를 사용하여 겔 표면의 용액을 제거합니다. 그 후 param을 페트리 접시에 넣고, 차가운 fibronectin 50 µL를 param 위에 떨어뜨립니다.

커버슬립을 뒤집어 겔 면이 피브로넥틴 위에 닿도록 놓습니다. 커버슬립을 실온에서 1~2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 이후 멸균된 조직 배양 환기 후드 내에서 배양합니다.

커버 슬립을 코팅하기 위해 PBS가 담긴 6cm 조직 배양 접시에 넣습니다. 세척 후, 멸균 상태에서 PBS를 여러 번 교체하여 커버 슬립을 충분히 세척합니다. 30분 동안 UV 처리를 하여 커버 슬립을 멸균합니다.

그 후, 세포를 도말하기 전 30~45분 동안 커버슬립을 세포 배양액에서 배양합니다. 다음으로, 진공 그리스를 사용하여 커버슬립을 고정한 상태로 22 x 30 mm 커버슬립을 Warner Instruments 공초점 이미징 챔버의 상단 커버슬립 홀더에 장착합니다. 커버슬립 위에 챔버 형성용 고무 가스켓을 배치하여 입구 및 출구 폴리에틸렌 튜브에 접근할 수 있도록 합니다.

사용하는 가스켓의 크기에 따라 상단 커버 슬립과 젤이 코팅된 22 by 40 millimeter 커버 슬립 사이의 간격을 150에서 1000 microns로 조절할 수 있습니다. 그다음, 커넥터 키트를 통해 따뜻한 세포 배지가 담긴 시린지를 유입 튜브에 연결하고, 배지가 튜브를 통해 상단 커버 슬립으로 잘 흐르는지 확인하십시오. 챔버 바닥에 진공 그리스를 도포하고, 젤이 코팅된 22 by 40 millimeter 커버 슬립의 세포 쪽이 위로 향하게 하여 장착하십시오.

세포에 따뜻한 배지를 처리합니다. 챔버 가스켓이 젤 코팅된 커버슬립과 분리된 상태에서 상단 커버슬립 홀더를 챔버 베이스 위에 놓습니다. 챔버 베이스 내의 위치 고정 핀이 상단 커버슬립의 위치 고정 구멍에 정확히 들어맞는지 확인하십시오.

압력판을 챔버 베이스에 대고 압력판 렌치를 사용하여 압력판을 돌려 고정합니다. 튜브와 챔버를 통해 배지의 흐름을 확인하여 챔버 내에 잠재적인 누출이 있는지 모니터링하십시오. 또한 세포 표면에 배지가 닿지 않는 영역이 생기지 않도록 합니다.

공초점 형광 현미경으로 겔 기질 내에 내장된 형광 표지 단백질과 형광 비드를 촬영하기 위해, 현미경 홀더 내의 스테이지 어댑터에 공초점 이미징 챔버를 장착하여 겔 관류 내 비드의 변형 전 위치 이미지를 얻습니다. 겔에서 세포 부착물을 분리한 후, 세포가 위치했던 동일한 이미징 영역에서 형광 비드의 이미지를 촬영합니다. 프로토콜을 정확하게 수행하면 겔 표면은 비교적 평평하고 매끄러우며, 형광 비드가 전체적으로 균일하게 내장된 상태가 됩니다.

ECM은 피브로넥틴 면역형광법으로도 시각화할 수 있습니다. 국소 접착 부위에서 겔 수축을 측정하는 경우, 겔과 세포의 이미징은 국소 접착 부위의 공초점 광학 평면에서 수행해야 합니다. 여기서는 GFP pxi로 표지된 인간 골육종 또는 U2 OS 세포를 이용한 인력 실험에서 국소 접착 부위를 시각화하였습니다.

겔의 수축은 초점 접착(focal adhesion) 아래에 매몰된 형광 비드의 변위로 시각화할 수 있습니다. 녹색으로 표시된 변형된 비드와 빨간색으로 표시된 변형되지 않은 비드 위치를 비교함으로써 수축 시 겔 기질의 변위를 정량화할 수 있습니다. 여기 trypsin에 의해 겔 표면에서 분리된 부착 세포의 대표적인 결과가 제시되어 있습니다. 또한 변형된 비드 위치와 변형되지 않은 비드 위치를 비교한 대표적인 결과가 제시되어 있습니다.

정교한 계산 알고리즘을 사용하면 비드 변위 및 겔의 탄성 계수와 관련된 견인 응력을 산출할 수 있습니다. 이러한 응력은 여기서 히트 스케일 맵과 벡터로 시각화되며, 히트 맵의 더 따뜻한 색상과 더 큰 화살표는 더 강한 힘을 나타냅니다. 앞서 이 절차를 수행할 때 세포 수축을 측정하기 위한 순응성 매트릭스를 만드는 방법을 보여드렸습니다.

시간에 민감한 단계들을 신속하게 수행할 수 있도록 미리 계획을 세우는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.