Name: Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 병아리 배아 추출물(CEE)을 이용한 쥐 신경 크레스트 줄기 세포 배양법. 11일령 배아에서 고품질 추출물을 분리, 균질화, 원심분리 및 여과하여 생산하는 표준화된 기술을 통해 재현 가능한 실험 결과를 얻을 수 있습니다.

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마커스 Pajtler과 로버트 Bohrer의 지원과 조언이 프로토콜의 시각화를위한 귀중한되었습니다.

동물 실험 기관에 의해 규정된 동물 실험 절차와 규정에 대한 동물의 보호 및 사용에 관한 NIH의 지침에 따라, 유럽 커뮤니티 이사회 지침 (86/609/EEC)에 따라 수행다고 저자 상태 관리 및 뒤스부르크 - 에센 대학 (독일)에서위원회 (IACUC)를 사용합니다. 1 부 : (비디오에 표시되지 않음) 설정 (인큐베이터 밖으로 알을 복용하기 전에) 자료 및 솔루션 준비 <ul><li> 계란은 37 11일위한 humidified 인큐베이터에 incubated해야 ° C (100 ° F). </li><li> 70 % 에탄올 스프레이, 깨끗한 접시, 정밀 청소 집게, 4 ° C (40 ° F) 추운 살균 얼음 DMEM 60 ML 무균 주사기 </li><li> 50 ML 무균 코닝 튜브 ° C 감기 DMEM가 1시 1분의 비율 (DMEM 분해 질량)에서 분해 배아를 섞어 4 반 가득해야합니다. 즉시 계란이 여자는 태아의 인큐베이터의 해부 밖으로 가져옵니다 같은 것은 시작되어야한다. </li><li> 압력솥이나 해부 당일 해부 도구를 소독, 20 분 70 %의 에탄올에있는 도구를 잠그다. </li></ul> 2 부 : 칙 태아의 해부 (비디오에서 보여준) <ol><li> 최소한 30 초 동안 70 % 에탄올 스프레이로 incubated 알을 습식 및 과도하게 계란을 흔들림없는 동안 깨끗하고 부드러운 종이 타올로 신중하게 건조. 참고 : 우리는 동시에 60 개 이상의 여자는 배아를 해부하지 권장합니다. </li><li> 날카로운 모서리로부터적으로하여 신중하게 계란을 열고 노른자의 자루 또는 여자는 배아 자체를 파괴하지주의와 배아를 꺼내. </li><li> 빨리 탯줄의 시작에 대한 검색 및 노른자의 자루 또는 작은 혈관을 파괴하지 않고 맑은 포장을 엽니다. 그런 다음 정확한 깨끗한 포셉과 탯줄을 해부하다. </li><li> 난황 자루의 배아를 꺼내주세요. 참고 : 태아가 (비디오에 표시되지 않음) 신속하게 참수해야합니다. </li><li> 4 최소한의 필수적인 매체 배아를 수집 ° C. </li></ol> 파트 3 : 칙 태아의 물에 담가서 부드럽게 함 <ol><li> 60 ML 멸균 주사기 밖으로 플런저를 가져가라. </li><li> 한 60 ML 주사기로 약 10 배아를 전송합니다. </li><li> 분해 물질을 잃을 위험하지 위해 신중하게 다시 주사기로 플런저를 넣어. </li><li> 플런저를 밀어 물에 담가서 부드럽게. </li><li> 준비 코닝 튜브 1시 1분 (DMEM 분해 질량)의 비율로 DMEM과 절반 채워진에서 분해 덩어리를 수집합니다. 10 배아에게 약 25 ML의 볼륨을 사용하는 것은 생산이다. </li><li> 4 45 분 ° C. 위해 쉐이크에 혼합 플레이스 </li></ol> 파트 4 : 칙 배의 원심 분리 - DMEM 서스펜션 <ol><li> 여자의 배아를 전송 - DMEM 서스펜션을 원심 분리 튜브에. </li><li> 배아의 25 MG 당 1 밀리그램의 농도에서 살균 hyaluronidase를 추가합니다. </li><li> 매우 정확하게 테어 원심 분리 튜브. 참고 : 원심 분리가 매우 높은 G - 포스 및 재료 또는 불균형 튜브를 사용하는 경우 원심 분리기가 발생할 수의 손상에서 실행되는이 단계는주의해서 수행해야합니다. 모든 튜브에 대한 소수점은 DMEM으로 누락된 금액을 조정하여 접수해야 다음 세 위치에 대한 기계에 따라 무게 높은 정확도. </li><li> 4 원심 분리기의 온도를 줄이기 ° C. 참고 : 또한 원심 분리의 회전자는 밤 동안 냉각 챔버 또는 냉장고에 보관해야합니다. </li><li> 적어도 180.000 xgx H. 6 시간 원심 분리기 참고 : 단일 단계의 분리에 관한 뛰어난 결과를 얻으려면이 266.000 xgx H.를 사용하여 가능하면 진공 조정을 사용합니다. </li></ol> 5 부 : 칙의 배아 추출의 여과 원심 분리 후, 세 단계가 발견하실 수 있습니다 지방산 조각, 중간에 투명 액상 및 원심 분리 관의 하단에있는 펠렛과 함께 상위 거무죽죽한 액상 참고 사항 :. 떨려 또는 활발한 centrifuged 혼합물의 이동하면되어야합니다 이것은 명확한 중앙 액체 단계를 잃는하여 원심 분리 단계의 결과를 파괴처럼 엄격히 피해야. 참고 : 모든 다음 단계는 층류 공기 흐름 벤치를 사용하여 무균 조건 하에서 수행되어야 : <ol><li> 0.45 μm의의 모공과 필터 시스템에 투명한 액체 단계를 피펫. 다음 연결된 진공 펌프 스위치. 참고 : 하단에있는 펠렛를 만지지 마십시오. 이것은 추출하고 필터 시스템의 차단의 오염으로 이어질 것입니다. </li><li> 0.22 μm의와 연결된 진공 펌프의 스위치를 다시의 모공과 필터 시스템에 사전 추출물을 전송합니다. </li><li> 나누어지는 획득 여자는 배아 추출물에게무균 15 ML 코닝 튜브 인치 </li><li> 신속 -80에서 aliquots를 저장할 ° C (-62 ° F). 참고 : -80에 저장된 경우 최대 2 년 동안 마지막시 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
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<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
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<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 과거 10,11에서 설명했습니다 절차의 변경에 따라 달라집니다. 전 출판물 이외에도 우리는 여기 개별 서로 다른 프로세스의 단계 더 확장을 보여줍니다. 이것은 올바른 절차와 신뢰할 수있는 결과를 확보 중요한 세부 실험자을 지원합니다. 해부 과정시 추출의 필수적인 부분이므로 나아가, 우리는 모든 세부 사항에 노른자의 자루의 배아를 복용의 절차를 설명합니다. 아래의 논의로 참고하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 부화가 끝난 후 여자는 태아의 해부는 가능한 빨리 시작되어야합니다. 이전 해부 죽은되고 태아도 부정적인 결과에 영향을 미칠 수 효소 활성화 및 단백질 저하로이 프로토콜의 모든 단계를 사용하지 않아야합니다. 시작하기 전에 몇 가지 수작업에 대한 교육 신속하고 정확하게 실시해야 해부 프로세스의 모든 단계로 수행되어야합니다.을 그것은 부정적인 간섭 단백질의 주목할만한 양의 동행했다 ...

<table><tbody><tr><td>11일간 배양한 닭 달걀</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>알코올 소독 스프레이</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 튜브 (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 팁</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase typeIV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milipore stericups 멸균 필터 (0.45; 0.22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 L5-50</td><td>로터 유형 Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

신경 능선은 embryogenesis 동안 신경 ectoderm에서 발생에만 일시적으로 지속. 초기 실험은 이미 신경 문장 하나의 불가분의 일부로 pluripotent 전구 세포를 침대. Phenotypically, 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)는 동시에 신경 문장 2,3,4,5으로부터 마이 그 레이션하는 동안 p75 (낮은 affine 신경 성장 인자 수용체, LNGFR)와 SOX10 표현에 의해 정의됩니다. 이러한 전구 세포는 평활근 세포, chromaffin 세포, 뉴런과 glial 세포뿐만 아니라, melanocytes, 연골과 뼈 6,7,8,9로 구별하실 수 있습니다. 시험 관내, 특별한 신경 크레스트 줄기 세포 매체 (NCSCM)에 NCSC를 육성하기 위해서는 10 필요합니다. NCSCM의 가장 복잡한 부분은 NCSC뿐만 아니라 신경 explants 다른 유형의 성장 요인의 필수 소스를 대표하는 여자는 배아 추출물 (시)의 준비입니다. 시 옆에 다른 NCSCM 재료는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그것은 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정으로 도전하는 세부 사항에 대해 알고 높은 중요 CCE 사용하여 실험실 표준 장비를 생산. 이 프로토콜에서는 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.

체외에서 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)을 육성하기 위해 특수 매체 (NCSCM)가 필요합니다. NCSCM의 필수적인 부분은 여자의 배아 추출물 (시)입니다. 우리는 여기서 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정과 같은 세부 사항을 포함하여 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.

Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

신경능(neural crest)은 배아 발생 과정 중 신경 외배엽(neuro-ectoderm)에서 유래하며 일시적으로만 존재합니다. 초기 실험들은 이미 다분화능(pluripotent)을 입증했으며...

안녕하세요, 저는 독일 에센에 위치한 대학 어린이 병원 소아 종양학과의 Ika Egar 교수님 연구실의 Annaa입니다. 오늘은 11일 된 태아 닭 배아의 추출물을 준비하는 과정을 보여드리겠습니다. DMEM을 얼음 위에 올려 최소 4°C까지 냉각시키십시오.GIB co에서 준비한 멸균 튜브에 DMEM glutamate를 절반 정도 채워 사용합니다. 가습 배양기에서 100°F로 11일 동안 배양한 알을 70% ethanol과 MEM을 사용하여 세척합니다. 에탄올이 최소 30초 동안 흡수되도록 하십시오.용액을 도포한 후 부드러운 종이 타월로 알을 조심스럽게 닦아냅니다. 에탄올로 플라스틱 또는 유리 플레이트를 세척합니다. 알을 개봉합니다.배아를 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. EC 또는 작은 혈관들이 손상되지 않도록 주의하십시오. 깨끗하고 날카로운 정밀 핀 세트를 사용하여 배아를 박리합니다.먼저, 탯줄을 찾으십시오. 다시 한번, 탯줄을 찾는 동안 난황낭이나 작은 혈관들을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 탯줄을 찾았다면, 시작 지점까지 따라가며 박리하십시오.배아 위의 투명 래핑을 개봉한 후, 배아가 손상되지 않도록 EC에서 조심스럽게 꺼냅니다. 배아를 얼음 위에 놓인 멸균된 최소 필수 배지에 넣습니다. 본 실험에서는 gyp Co.의 DMEM glutamate를 사용하였습니다. 멸균된 60 mL 시린지에서 플런저를 제거합니다.한 번에 약 10개의 배아를 사이렌(siren)에 넣습니다. 사이렌에 플런저를 삽입합니다. 플런저를 아래로 눌러 배아를 성숙시킵니다.압력을 너무 강하게 가하면 성숙된 재료를 손실할 수 있으므로 주의하십시오. 성숙된 배아를 준비된 튜브에 배아 1개당 MEM 10개 비율로 수집하십시오. 부피는 약 25 milliliters가 되어야 합니다.배아와 EMEM을 1:1 비율로 혼합하여 4°C에서 45분 동안 흔들어 섞어줍니다. 혼합물을 원심분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. hyaluronidase를 첨가합니다.Sigma 사의 Boin 고환 유래 R Hay days를 사용합니다. 특수 AC 정밀 저울을 사용하여 원심분리 튜브의 무게를 잽니다. 소수점 셋째 자리까지 정확하게 측정하는 것이 매우 중요합니다.이들은 서로 동일해야 합니다. 그렇지 않으면 혼합물을 원심분리하는 데 필요한 고속 회전으로 인해 원심분리기에 문제가 발생할 위험이 있습니다. 필요한 경우, 부족한 양의 MEM을 피펫팅하여 불균형을 조정하십시오. 로터는 4 °C까지 냉각시키기 위해 하룻밤 동안 냉장고나 냉각 챔버 안에 보관되어 있어야 합니다.원심분리 튜브는 매우 단단히 닫아야 합니다. 그렇지 않으면 로터에서 튜브를 꺼낼 때 문제가 발생할 위험이 있습니다. 원심분리 후, 로터에 튜브를 채우고 미리 매우 단단히 닫아 두십시오.원심분리기를 4 °C로 냉각하십시오. 모든 경우에 진공 상태를 유지하십시오. 로터가 최종 속도에 도달할 때까지 기다리십시오.이상 현상이 발생하면 즉시 원심분리기를 중단하십시오. 브레이크 버튼을 눌러 원심분리를 멈춥니다. 이는 TI I 45 로터가 45, 000 rpm의 속도로 6시간 동안 작동한 후의 상황입니다.튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 튜브 내부의 상층부 탁한 액체 층이 증가할 수 있으므로 전혀 흔들지 마십시오. 세 가지 층이 형성된 것을 확인합니다.상단에는 지방 조각이 섞인 탁한 액체가 있습니다. 중간에는 투명한 액체가 있으며, 하단에는 펠렛(pellet)을 확인할 수 있습니다. 튜브 중간의 투명한 층만 매우 주의해서 취하십시오.펠렛을 전혀 건드리지 마십시오. 펠렛을 건드리면 추출물이 오염될 뿐만 아니라 필터 시스템이 막힐 수 있습니다. 먼저, 진공 펌프에 연결된 0.45 µm 필터를 사용하십시오. 두 번째 단계로, 얻어진 액체를 진공 펌프에 연결된 0.22 µm 필터로 여과하십시오. 그 후 추출물을 튜브에 넣으십시오.마지막으로 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오.

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신경과학

이 동영상은 배아 생쥐의 개발​​ 피질에서 neuroprecursors의 절연에 사용되는 방법을 설명합니다. , 자궁에서 태아를 제거하는 대뇌 피질의 조직을 해부하고, 고립 대뇌 피질을 소화에 대한 절차는 표시됩니다.

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칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

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신경 능선 세포 배양을 위해 병아리 배아에서 두개골 신경 주름 분리

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