쥐 폐내피 세포의 세균 감염 후 세포독성 아밀로이드 획득

쥐 폐 내피 세포의 단층을 취하십시오.

완충액으로 세포를 세척하십시오. 녹농균 현탁액을 첨가하고 배양합니다.

배양하는 동안 박테리아는 세포와 접촉하여 세포질에 이펙터 단백질을 주입합니다.

이러한 이펙터 단백질은 미세소관 분해 및 세포골격 파괴를 유도합니다.

세포골격 파괴는 세포 스트레스 반응을 활성화하여 잘못 접힌 세포독성 단백질 응집체인 아밀로이드 올리고머의 형성을 초래합니다.

이펙터 단백질은 또한 세포막에 기공을 만들어 아밀로이드 올리고머가 세포외 공간으로 방출되도록 합니다.

또한, 세포골격 파괴는 세포 형태를 변화시켜 내피 단층에 세포간 간격을 생성합니다.

다음으로 광학 현미경으로 단층을 관찰합니다. 세포간 간격이 분명해지면 배양을 종료합니다.

그런 다음 세포독성 아밀로이드를 함유한 상청액을 수집하고 원심분리하여 파편을 펠릿화합니다.

상청액을 모으고 여과하여 남아 있는 박테리아를 제거합니다.

세포독성 아밀로이드를 함유한 채취된 상청액은 추가 분석을 위해 준비됩니다.

세포독성 상청액을 생성하려면 내피 세포의 150cm 접시를 HBSS로 세척하고 P. aeruginosa 콜로니를 540나노미터에서 0.25의 흡광도로 희석합니다. 박테리아 세포를 추가로 희석하여 HBSS 20밀리리터 중 1밀리리터의 감염 다양성을 허용하고 박테리아를 내피 세포 플레이트에 파종합니다. 그런 다음 감염된 세포를 섭씨 37도 및 5% CO₂ 인큐베이터에 4-5시간 동안 넣습니다.

박테리아와 내피 세포의 배양이 적절한 시간 동안 일어나는 것이 중요합니다. 배양 시간이 너무 짧으면 아밀로이드가 상청액으로 방출되지 않습니다. 배양이 너무 길면 세포는 실제로 모든 내용물을 용해하여 상청액으로 방출합니다. 적절한 배양 기간 동안 사용하는 지표는 내피 단층의 틈 형성입니다.

광학 현미경으로 세포 단층에서 틈이 관찰될 수 있는 경우, 원심분리를 위해 상청액을 수확하여 세포 파편을 제거합니다. 상청액을 0.2미크론 필터가 장착된 주사기에 디캔팅하고 상청액을 필터에 통과시켜 오염 박테리아를 제거합니다.

그런 다음 세포독성 테스트를 위해 멸균 상청액 1.5밀리리터를 따로 보관하고 나머지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다.