생물발광을 사용한 마우스의 박테리아 감염 역학 추적

병원성 박테리아의 약독화 균주의 현탁액으로 시작하십시오.

약독화된 균주는 독성 유전자의 표적 결실로 인해 병원성 감소를 나타냅니다.

박테리아는 자율적인 빛 생산을 가능하게 하는 생물발광 오페론으로 염색체적으로 표지됩니다.

박테리아는 생물발광 오페론을 발현하여 루시페라아제 효소와 루시페라아제 기질을 합성하는 효소 복합체를 생성합니다.

루시페라제는 기질을 산화시켜 가시광선을 생성합니다.

현탁액을 원심분리하고 상청액을 버립니다.

완충액으로 세포를 세척하고 다시 원심분리한 다음 상청액을 버려 잔류 비세포 성분을 제거합니다.

최적의 박테리아 농도를 달성하기 위해 완충액에 세포를 재현탁하고 현탁액을 주사기에 끌어당깁니다.

현탁액을 마우스에 복강 내 주입한 다음 케이지로 옮깁니다.

일정한 간격으로 생물발광 신호를 시각화합니다.

약독화된 균주는 국소적으로 유지되고 생물발광은 점차 감소하여 감염이 제거되었음을 나타냅니다.

주사 당일 아침에 박테리아 세포의 냉동 바이알을 섭씨 4도에서 3-4시간 동안 해동합니다. 해동 후 바이알을 얼음 위에 보관하고 2시간 이내에 마우스를 주사합니다. 각 냉동 튜브의 내용물을 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기고 4,500배 G에서 10분 동안 원심분리합니다.

상청액을 버리고 세포 펠릿을 PBS 1밀리리터에 다시 현탁합니다. 원심분리를 반복하고 PBS에서 세포를 밀리리터당 9번째 콜로니 형성 단위의 2.5배 10의 최종 농도로 재현탁합니다. 각 균주의 최종 현탁액에서 3개의 샘플을 채취하여 농도, 유전자형 및 표현형을 검증합니다.

각 균주에 대해 세포 현탁액 1.5밀리리터를 2밀리리터 튜브에 분취하고 대조군 주입을 위해 PBS를 준비합니다. 주사에 필요한 쥐와 재료를 무균 동물 수술실에 모으고 시작하기 전에 소독 물티슈로 모든 표면을 닦으십시오. 물렸을 경우 펑크의 위험을 제한하기 위해 라텍스 장갑 두 켤레와 실험실 가운, 보안경 및 안면 마스크를 착용하십시오.

케이지에서 마우스를 꺼내 무게를 측정하고 주사 후 추적을 위해 유성 마커로 꼬리를 표시합니다. 새 1밀리리터 주사기를 27게이지 바늘로 열고 200마이크로리터의 멸균 PBS를 끌어올립니다. 엄지와 검지를 사용하여 마우스의 귀 뒤를 잡고 꼬집어 목덜미에 피부 주름을 만듭니다.

그런 다음 새끼손가락을 사용하여 꼬리를 손바닥에 고정하여 마우스를 평평하게 고정하고 움직이지 않도록 합니다. 정중선의 왼쪽 또는 오른쪽에 있는 복막강에 바늘을 30도 각도로 삽입합니다. 바늘이 장기에 삽입되지 않았는지 확인하기 위해 바늘을 살짝 들어 올립니다.

그런 다음 PBS를 천천히 주입하고 바늘을 빼냅니다. 주사 부위의 볼루스가 일반적입니다. 바늘을 지정된 날카로운 물건 처리 용기에 넣고 마우스를 별도의 케이지로 옮깁니다.

다음 마우스로 절차를 반복하고 한 케이지의 모든 마우스를 주입한 후 원래 케이지로 다시 이동합니다. 대조군을 주입한 후 동일한 절차로 시험군을 주입합니다. 모든 주사가 완료되면 마우스를 주거실로 돌려보내고 소독용 물티슈로 작업 공간을 청소합니다.

산소 유량을 분당 1.5리터로, 이소플루란을 3.5%로 설정하고 마우스를 마취실로 이동시킨 다음 마취 후 온도 안정화 단계로 이동합니다. 팔을 쭉 뻗은 상태에서 마우스를 등을 대고 이미징 중에 2.5% 이소플루란을 투여하기 위해 노즈 콘을 끼웁니다.

문을 닫고 생쥐의 생물 발광 이미지와 엑스레이를 촬영합니다. 이미징이 완료되면 마우스를 케이지로 되돌려 모니터링합니다. 3-5분 이내에 의식을 되찾을 것입니다.