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국물에 녹 농균 Pseudomonas aeruginosa 를 배양하십시오.
배양액을 분리 한천에 접시하고 배양하여 박테리아 성장과 우론산으로 구성된 외다당류인 알긴산염의 생산을 촉진합니다.
박테리아 잔디에 등장성 식염수를 넣고 긁어서 알지네이트와 함께 박테리아 세포를 수집합니다.
현탁액을 튜브에 옮기고 소용돌이치게 하여 내용물을 분산시킨 다음 얼음 위에 올려 효소 분해를 방지합니다.
박테리아 밀도를 결정하기 위해 광학 밀도 또는 OD를 측정합니다.
박테리아 현탁액을 산-붕산염 용액에 첨가하고 혼합하여 알긴산염을 우론산 단량체로 가수분해합니다.
발색 시약인 카르바졸을 첨가하고 배양합니다. 산성 조건에서 시약은 우론산과 반응하여 착색 복합체를 형성합니다.
흡광도를 측정하여 알지네이트 농도를 반영하는 우론산 수치를 정량화합니다.
표준 곡선을 사용하여 알지네이트 농도를 결정한 다음 이를 측정된 박테리아 세포 밀도로 나누어 바이오매스 단위당 알지네이트 생산량을 계산합니다.
우론산 카르바졸 분석을 시작하려면 테스트할 원하는 균주의 순수 배양에서 단일 콜로니를 식별하고 멸균 이쑤시개를 사용하여 콜로니를 선택합니다.
이쑤시개를 5밀리리터의 PIB가 들어 있는 배양 시험관에 넣습니다. 섭씨 37도의 셰이커 인큐베이터에서 24시간 동안 성장시킵니다. 배양 후, 배양된 PIB 국물의 분취량을 예열된 PIA 플레이트에 추가합니다.
멸균 세포 스프레더를 사용하여 국물을 접시 위에 펴고 섭씨 37도에서 24시간 동안 성장시킵니다. 피펫 컨트롤러와 멸균 50밀리리터 피펫을 사용하여 성인용 잔디밭에 0.85% 염화나트륨을 첨가하고 세포 스프레더를 사용하여 플레이트를 긁어 샘플을 수집합니다. 신선한 50밀리리터 피펫을 사용하여 샘플을 흡인하고 50밀리리터 수집 튜브로 옮깁니다.
샘플을 높은 높이에서 소용돌이치어 혼합하고 얼음 위에 놓습니다. 샘플의 OD 600을 측정하려면 먼저 0.85% 염화나트륨 1밀리리터를 사용하여 분광 광도계를 블랭킹합니다. 그런 다음 샘플 1밀리리터를 새 일회용 큐벳에 넣고 OD를 읽습니다. 이 단계를 두 번 반복하여 각 샘플에 대한 판독값을 세 번 얻습니다.
이제 황산 붕산염 용액 3밀리리터를 배양 튜브에 넣고 얼음 위에 그대로 둡니다. 수집된 샘플 350마이크로리터를 시험관의 산 혼합물에 천천히 첨가합니다. 낮은 온도에서 잠시 소용돌이를 일으킨 후 0.1% 카바졸 및 에탄올 용액 100마이크로리터를 산성 시료 혼합물에 첨가합니다.
튜브의 뚜껑을 덮고 중간 설정에서 5초 동안 소용돌이치십시오. 그런 다음 섭씨 55도의 건욕조에 30분 동안 넣습니다. 배양 후 튜브를 높은 온도에서 잠시 소용돌이치고 5분 동안 식힙니다.
0.85% 염화나트륨이 포함된 튜브를 분광 광도계의 블랭크로 사용하십시오. 그런 다음 혼합물 1밀리리터를 깨끗한 큐벳에 넣고 분광 광도계에서 530나노미터에서 샘플의 OD를 읽습니다. 알려진 농도의 d-만누론산의 연속 희석액의 OD 530을 측정하여 표준 곡선을 준비합니다.
두 번 반복하고 이 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 알지네이트 농도를 계산하고 선형 방정식의 알지네이트 농도를 OD 600으로 나누어 OD 600당 알지네이트의 총량을 구합니다.