iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

다음 실험의 전반적인 목표는 개별 뉴클레오티드 분해능에서 RNA 결합 단백질의 결합 부위에 대한 전사체 와이드 맵을 얻는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 생체 내에서 단백질과 RNA를 공유 가교 결합하기 위해 살아있는 세포의 UV 조사에 의해 달성됩니다. RNA 결합 단백질은 가교 결합된 RNA 단편을 회수하기 위해 엄격한 조건에서 면역 정제됩니다.

다음으로 역전사는 부착된 펩타이드에서 종종 절단되는 CDNA를 생성하며, 이는 RNA 내 교차 링크 위치에 대한 정보를 보존합니다.cDNA 라이브러리의 고처리량 염기서열분석을 기반으로 전사체 내의 모든 결합 부위를 보여주는 결과를 얻습니다. 이 방법은 서로 다른 RNA onic 단백질의 상호 작용이 RNA 처리를 조절하는 방법과 같은 RNA 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 RNA 상호 작용의 전사체 와이드 맵의 성능과 해상도를 모두 증가시켜 조직 배양 세포를 UV 가교 결합시키는 절차를 시작하는 것입니다.

10cm 플레이트의 치료자 세포에서 배지를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 6ml를 넣고 얼음 위에 접시를 놓습니다. 한 접시로 세 가지 실험을 할 수 있습니다.

뚜껑을 열고 세포를 조사합니다. 254 나노미터에서 150 밀리줄/센티미터 제곱으로 한 번 세포 리프터로 플레이트에서 세포를 긁어내어 세포를 수확하고 2ml의 세포 현탁액을 3개의 마이크로 튜브 각각에 전달하여 세포를 펠릿화합니다. 섭씨 4도에서 10초 동안 최고 속도로 돌립니다.

그런 다음 supinate 스냅을 제거하고 세포 펠릿을 드라이 아이스에 얼린 다음 사용할 때까지 섭씨 영하 80도까지 보관하십시오. 실험당 100마이크로리터의 단백질, 다이나 비드를 새로운 마이크로 튜브에 추가합니다. 마우스 또는 염소 항체로 작업하는 경우 단백질 G dyna 비드를 사용하십시오.

lysis buffer로 비드를 두 번 세척하며, 이는 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 100마이크로리터의 용해 버퍼에 2-10마이크로그램의 항체와 함께 비드를 재현탁합니다. 튜브를 실온에서 30-60분 동안 회전시킵니다.

그런 다음 900마이크로리터의 용해 완충액으로 비드를 세 번 세척하고 계속 진행할 준비가 될 때까지 마지막 세척 상태로 둡니다. 얼음 위의 면역 침전수 토르 세포 궁전. Resus는 1ml의 용해 완충액에 현탁하여 1.5ml 마이크로 튜브로 전달합니다.

RNAs 1의 1 내지 500 희석을 준비합니다. 그런 다음 10마이크로리터와 2마이크로리터의 터보 DNA를 세포에 추가합니다. 용해물. 섭씨 37도에서 정확히 3분 동안 샘플을 배양하고 분당 1, 100회 회전으로 흔든 다음 즉시 얼음으로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 4도 및 22, 20분 동안 중력을 000배 중력으로 회전시켜 용해물을 맑게 하고 구슬을 면역으로 침전시키기 위해 펠릿과 함께 약 50마이크로리터의 용해물을 남겨두는 SUP natant를 조심스럽게 수집합니다. 세척 버퍼를 제거한 다음 준비된 세포 용해물을 추가합니다. 섭씨 4도에서 2시간 동안 샘플을 회전시킵니다.

SUP 에이전트를 폐기하고 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 찾을 수 있는 900마이크로리터의 고염 버퍼로 비드를 두 번 세척합니다. 마지막으로 900마이크로리터의 세척 버퍼로 비드를 두 번 세척합니다. 그런 다음 탈인산화를 진행하고 RNA 3개의 프라임 말단에 링커를 추가합니다.

RNA를 라벨링하려면 플렉시 글라스 실드 뒤에서 작동하는 5 개의 프라임 말단. 링커 결찰 반응의 마지막 세척에서 supinate를 제거하고 8마이크로리터의 뜨거운 PNK 혼합물에 비드를 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

뜨거운 PNK 믹스와 reus를 제거합니다. 20마이크로리터의 1회 새 페이지 로딩 버퍼에 비드를 매달아 놓습니다. 그런 다음 섭씨 70도의 온도 혼합기에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.

즉시 샘플을 자석에 올려 빈 비드를 침전시킵니다. 샘플을 4-12%새 페이지에 로드합니다. 제조업체의 지침에 따라 Biss 젤.

또한 미리 염색된 단백질 크기 마커 5마이크로리터를 로드합니다. 젤을 180볼트에서 50분 동안 실행합니다. 제조업체의 지침에 따라 NOVA 습식 전달 장치를 사용하여 단백질 RNA 복합체를 겔에서 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달합니다.

이식 후 PBS 완충액에서 멤브레인을 헹굽니다. 그런 다음 사란 랩으로 싸서 섭씨 영하 80도의 필름에 노출시킵니다. 30분, 1시간, 하룻밤 동안 노출을 수행합니다.

다음으로, 단백질 RNA 복합체에 따라 막 영역을 낮은 RNA에서 분리합니다. 자동 방사선 사진을 마스크로 사용하여 실험해 보십시오. proteinase K 분해 및 페놀 클로로포름 추출로 멤브레인에서 RNA를 회수합니다.

AYP 프라이머 중 하나를 사용하여 RNA를 역전사하여 CDNA를 겔화합니다. 6마이크로리터의 CDNA 샘플과 6마이크로리터의 2배 TBE 요소 로딩 버퍼를 혼합합니다. 샘플을 젤에 넣기 직전.

샘플을 섭씨 80도에서 3분 동안 가열합니다. 그런 다음 저분자량 마커와 함께 프리캐스트 6% TBE 요소 겔에 샘플을 로드합니다. 제조업체가 설명한 대로 젤이 180볼트에서 40분 동안 작동하도록 합니다. 상단 염료와 플라스틱 젤 지지대의 표시를 사용하여 절제를 안내합니다.

120-200개의 뉴클레오티드, 85-120개의 뉴클레오티드, 70-85개의 뉴클레오티드에서 3개의 밴드를 절단합니다. 아크 립 프라이머와 L 3 염기서열은 함께 클립 염기서열의 52개 뉴클레오티드를 설명합니다. 400 마이크로 리터의 te를 넣고 젤 조각을 작은 조각으로 으깬다.

1 밀리리터 주사기 플런저를 사용하여 1, 37 섭씨 온도에서 2 시간 동안 분당 100 회 회전으로 흔들림으로 젤 조각을 배양합니다. 1cm 유리 프리 필터 2개를 CoStar spinx 컬럼에 놓습니다. 샘플의 액체 부분을 1.5 밀리리터 튜브로 분당 13, 000 회전으로 1분 동안 컬럼 스핀으로 옮깁니다.

0.5마이크로리터의 글리코 블루와 40마이크로리터의 pH 5.5용 아세트산나트륨을 추가합니다. 그런 다음 샘플을 혼합합니다. 100% 에탄올 1밀리리터를 첨가합니다.

다시 혼합하고 섭씨 영하 20도에서 밤새 샘플을 침전시킵니다. 마지막으로, CD NA 분자를 원형화하여 어댑터 영역을 5개의 프라임 말단에 부착합니다. 다음으로 안구 클립 라이브러리의 염기서열분석 전에 수반되는 서면 프로토콜에 따라 재선형화 및 PCR 증폭을 통해 실험의 성공 여부를 두 단계로 모니터링할 수 있습니다.

막이식 후 단백질 RNA 복합체의 autoradio 그래프와 낮은 RNA 샘플의 자동 방사선 사진에서 PCR 산물의 겔 이미지, 확산 방사능은 높은 RNA 샘플에 대한 단백질의 분자량 이상으로 보여야 합니다. 이 방사능은 단백질의 분자량에 더 가깝게 집중됩니다. 면역침전에 항체가 사용되지 않는 경우 신호를 감지해서는 안 됩니다.

면역침전의 특이성에 대한 또 다른 중요한 대조군은 UVE 방사선을 방출하거나 관심 단백질을 발현하지 않는 세포를 사용합니다. PCR 산물의 겔 이미지는 CD NA 분획에 해당하는 크기 범위를 보여주어야 합니다. PCR 프라이머, P three Celexa 및 P five Celexa는 CD NA 크기에 추가로 76개의 뉴클레오티드를 도입합니다. 면역침전 중에 항체가 사용되지 않으면 해당 PCR 산물이 검출되어서는 안 됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 64개 단계 각각이 중요하며 100% 정확도로 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. ICL 데이터는 전사 전반의 기능 분석과 전산적으로 통합될 수 있습니다. 예를 들어, 이를 통해 RNA 처리의 위치 의존적 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

컴퓨터 데이터 분석에 대해서는 Nicholas KA European Bioinformatics Institute 및 Liana 대학의 bla zupan과 공동으로 진행한 최근 간행물을 참조하고자 합니다. 이제 자신만의 실험을 시작할 때입니다. 즐거운 시간 보내세요.