Name: iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 iCLIP 기법으로 RNA 결합 단백질의 전사체 전체 결합 부위를 개별 염기 해상도로 매핑하는 방법을. UV 교차결합과 면역침전을 활용하여 RNA 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 토론과 실험 도움 Ule, 루스콤 및 Zupan 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 높은 처리량 시퀀싱을위한 제임스 해드와 닉 매튜 주셔서 감사합니다. 우리는 iCLIP 방법은 주, 여기 로버트 다넬의 연구실에서 커크 젠슨과 JU에 의해 개발된 원래의 클립 프로토콜로 여러 단계를 설명 것을 지적하고 싶다. 이 작품은 유럽 연구위원회 부여 JU와 JK에 대한 장기적인 인간 프론티어 과학 프로그램 교제로 206726 - CLIP에 의해 지원되었다

1. UV 교차 연결 조직 문화의 세포 <ol><li> 미디어를 제거하고 10cm 접시 (충분한 세 실험)에 성장 세포 6 ML 얼음처럼 차가운 PBS를 추가합니다. </li><li> 얼음 뚜껑과 장소를 제거합니다. 150 254 NM에서 MJ / cm 2 번 비추다. </li><li> 휴대 리프터와 스크레이핑하여 세포를 수확. </li><li> 세 microtubes 각각 2 ML 세포 현탁액을 전송합니다. 4 10 초에 대한 최고 속도로 회전은 ° C 펠릿 세포에 다음 뜨는 제거합니다. </li><li> 스냅 - 냉동 -80에서 드라이 아이스와 저장소에 셀 알약을 ° C까지 사용. </li></ol> 2. 비드 준비 <ol><li> 100 μl의 단백질 새로운 microtube로 실험을 당 Dynabeads (Dynal, 100.02) (마우스 또는 염소 항체에 대한 단백질 G의 Dynabeads를 사용). 추가 </li><li> . 용해 완충액 (; 100 MM NaCl, 1퍼센트 NP - 40, 0.1 % SDS, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate, 1백분의 1 프로 테아제 억제제 칵테일 III, Calbiochem 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 2 배 구슬 와시 </li><li> 20-10 μg 항체 100 μl 용해 버퍼에 구슬을 Resuspend. </li><li> 30-60 분 실온에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 900 μl 용해 버퍼 배 세척하고 4.1 단계로 진행 준비가 될 때까지 마지막으로 씻어 둡니다. </li></ol> 3. 세포 용해 및 일부 RNA의 소화 <ol><li> 1 ML의 용해 버퍼와 1.5 ML의 microtubes로 전송에서 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> RNase I (앰비온, AM2295)의 500분의 1 희석을 준비합니다. 10 μl RNase I 희석뿐만 아니라 세포 lysate 2 μl 터보 DNase 추가 (500분의 1 RNase I의 dilutions [낮은 RNase] 도서관 준비에 사용되며 50분의 1 dilutions [높은 RNase] 항체 특이성에 대한 제어하는​​ 데 필요한) . </li><li> 37 정확히 3 분 ° C, 1100 rpm으로 흔들어에 대한 샘플을 품어. 즉시 얼음으로 전송할 수 있습니다. </li><li> 4 스핀 ° C 및 lysate를 지우 20 분 2만2천그램. 조심스럽게 (펠렛과 함께 약 50 μl lysate를 떠나) 표면에 뜨는를 수집합니다. </li></ol> 4. Immunoprecipitation <ol><li> 비즈 (단계 2.5에서)에서 씻어 버퍼를 제거 후 세포 lysate를 (단계 3.4에서) 추가합니다. </li><li> 4 2 H에 대한 샘플을 회전 ° C. </li><li> 뜨는을 취소하고 900 μl 높은 소금 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4, 1 M NaCl, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1% NP - 40, 0.1 % SDS, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate)로 2 배 비즈 씻으십시오. </li><li> . 900 μl 세척 버퍼 (; 10 MM MgCl 2; 0.2 % 트윈 - 20 20 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 2 배 씻으십시오 </li></ol> 5. RNA 3'ends의 Dephosphorylation <ol><li> 뜨는을 취소하고 (15 μl 물, 4 μl 배 PNK의 산도 6.5 버퍼 [350mMTris - HCL, pH를 6.5; 50mMMgCl이 25mMdithiothreitol]; 0.5 μl PNK 효소, 0.5 μl RNasin [Promega]) 20 μl PNK 믹스의 구슬을 resuspend. </li><li> 37 20 분 품어 ° C. </li><li> 500 μl 세척 버퍼를 추가하고 높은 소금 버퍼 1X 씻는다. </li><li> 세척 버퍼와 2X 씻으십시오. </li></ol> 6. 3 '끝을 RNA에 결합 링커 <ol><li> 조심스럽게 뜨는을 제거하고 (9 μl 물을 20 μl 내고 믹스의 구슬을 resuspend, 4 μl 4X 내고 버퍼 [200 mMTris - HCL, 40m의 MM gCl 2; 40 MM의 dithiothreitol], 1 μl RNA ligase [코]; 0.5 μl RNasin [Promega]; 1.5 μl 사전 adenylated 링커 L3 [20 μm의], 4 μl PEG400 [81170, 시그마]). </li><li> 16 밤새 품어 ° C. </li><li> 500 μl 세척 버퍼를 추가하고 다음 1 ML 높은 소금 버퍼 2X 씻으십시오. </li><li> 두 번째 세척 1 ML 1 ML 세척 버퍼와 2X하고 떠나 씻으십시오. </li></ol> 7. RNA 5 '끝 라벨 <ol><li> 뜨는를 제거하고 뜨거운 PNK 믹스 8 μl의 구슬을 resuspend (0.4 μl PNK [코]; 0.8 μl 32 P - γ - ATP, 0.8 μl 10X PNK 버퍼 [코]; 6 μl 물). </li><li> 37 5 분 품어 ° C. </li><li> 핫 PNK 믹스를 제거하고 20 μl의 1X Nupage 로딩 버퍼 (Invitrogen)에있는 구슬을 resuspend. </li><li> ° C 10 분 70시 thermomixer에 품어. </li><li> 즉시 (8 단계 참조) 빈 구슬을 촉진하고 겔에 뜨는를 로드할 자석에 놓으십시오. </li></ol> 8. SDS - PAGE와 막 전송 <ol><li> 4~12%의 NuPAGE 제조 업체의 지시에 따라 BIS - 트리스 젤 (Invitrogen)에 샘플을로드합니다. 버퍼 (Invitrogen)를 실행 1X 맙스 0.5 리터를 사용합니다. 또한 사전에 묻은 단백질의 크기 표시 (예 : 페이지의 통치자 또한, Fermentas, SM1811) 5 μl를로드합니다. </li><li> 180 50 분 겔을 실행 V. </li><li> 겔 전면을 제거하고 고체 폐기물 (무료 방사성 ATP를 포함)로 폐기. </li><li> 젤의 제조 업체의 지침 (Invitrogen, 30 V에서 환승 1 H)에 따라 Novex 서부 유럽 표준시 전송 장치를 사용하여 nitrocellulose 막에 단백질 RNA의 단지를 전송합니다. </li><li> 전송 후, PBS 버퍼에 막을 린스, 다음 사란 포장에 포장하여 -80 ° C (장소 나중에 T를 정렬하기 위해 막 옆에 형광 스티커를에서 후지 필름에 노출그는 영화와 막이;) 30 분, 1 시간 및 밤 동안에 대한 노출을 수행합니다. </li></ol> 9. RNA 분리 <ol><li> 마스크로 단계 8.5에서 autoradiograph를 사용하여 낮은 RNase 실험에서 단백질 RNA의 단지를 분리. 여러 개의 작은 조각으로 막 조각을 잘라 1.5 ML의 microtube에 그들을 놓으십시오. </li><li> 막 조각을 10 μl proteinase K (로체, 03,115,828,001) 200 μl PK 버퍼를 (10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산),, 50 MM 100 MM NaCl 트리스 - HCL의 산도 7.4) 추가합니다. 37 20 분 1,100 rpm으로 흔들어 품어 ° C. </li><li> PKurea 버퍼 (; 50 MM NaCl, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 100 MM 트리스 - HCL pH는 7.4 7 M 우레아) 200 μl를 추가하고 37에서 20 분 품어 ° C. </li><li> 솔루션을 수집하고 2 ML 단계 잠금 젤 중공업 튜브 (713-2536, VWR)에 클로로포름 (앰비온, 9722) / 페놀 RNA 400 μl와 함께 추가합니다. </li><li> 1,100 RPM에 떨고, 30 5 분 ° C에 대해 품어. 실온에서 13,000 rpm으로 5 분 회전으로 ​​단계를 구분한다. </li><li> (피펫로 젤을 만지지 않도록주의) 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다. 0.5 μl glycoblue (앰비온, 9510) 40 μl 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.5와 혼합을 추가합니다. 다음 1 ML 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스 및 촉진 </li></ol> 10. 역방향 전사 <ol><li> 15,000 RPM 4 20 분 스핀 ° C. 뜨는을 제거하고 0.5 ML 80 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> . 7.25 μl RNA / 프라이머 믹스 (; 0.5 μl Rclip 프라이머 [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP 혼합 [10mM] 6.25 μl 물)의 펠릿을 Resuspend 각각의 실험이나 복제를위한 개별 바코드 시퀀스 (14 참조) 포함된 다른 Rclip의 프라이머를 사용합니다. </li><li> 70 5 분 품어 ° C 25 ° C.으로 냉각하기 전에 </li><li> 2.75 μl RT 혼합 (; 0.5 μl 0.1M DTT, 0.25 μl 윗첨자 III 반전 transcriptase [Invitrogen] 2 μl RT 배 버퍼)를 추가합니다. </li><li> 25 5 분 품어 ° C, 42시 20 분 ° C, 50 ° C 40 분 80시 5 분 ° C 4 냉각하기 전에 ° C. </li><li> 90 μl TE 버퍼, 0.5 μl glycoblue 10 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5와 혼합을 추가합니다. 그렇다면 250 μl 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스와 촉진 </li></ol> 11. cDNA의 젤 정화 <ol><li> 스핀 다운 및 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후, 물 6 μl의 알약을 resuspend. </li><li> 6 μl 2X TBE - 요소 로딩 버퍼 (Invitrogen)를 추가합니다. 열 샘플 80 ° C 직접적으로로드하기 전에 3 분. </li><li> 프리 캐스트 6% TBE - 요소 젤 (Invitrogen)에 샘플을로드하고 같은 제조 업체에서 설명한 180 V에서 40 분 동안 실행. 또한 이후의 절단 (아래 참조)에 대한 낮은 분자량 마커를로드합니다. </li><li> 120-200 NT (높이), 85-120 NT (중간)와 70-85 NT (낮은) 세 밴드 컷. (그림 3 참조) 절단을 안내 theupper 염료 및 플라스틱 겔 지원 부호를 사용하십시오. 참고 클립 순서의 52 NT 용 Rclip 프라이머와 함께 L3 순서 계정입니다. </li><li> 400 μl TE를 추가하고 1 ML의 주사기의 플런저를 사용하여 작은 조각으로 겔 슬라이스를 부술. 37 2 H 위해 1,100 rpm으로 흔들어 품어 ° C. </li><li> 플레이스 코스타 SpinX 칼럼 (코닝 설립, 8161)에이 1cm 유리 사전 필터 (왓먼, 1823010). 그 결과 해당 컬럼에 대한 샘플의 액체 부분을 전송합니다. 1.5 ML 튜브에 13,000 RPM에서 1 분 스핀. </li><li> 0.5 μl glycoblue 40 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5를 추가 후 샘플을 섞는다. 1 ML 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스 및 촉진 </li></ol> 12. cDNA의 5'end에 뇌관을 내고 <ol><li> 그리고 부화 스핀 다운과 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후 8 μl 내고 믹스 (; 0.8 μl 10X CircLigase 버퍼 II, 0.4 μl 50 MM MnCl 2;, 0.3 μl Circligase II [Epicentre] 6.5 μl 물)의 알약을 resuspend 60 ° C. 1 H에 대한 </li><li> 30 μl oligo 소둔 혼합 추가 (26 μl 물, 3 μl FastDigest 버퍼 ​​[Fermentas], 1 μl cut_oligo [10 μm의]). 95에서 1 분 품어 ° C. 그렇다면 1 매 20 초 온도를 감소 ° C 25 ° C까지 도달하고 있습니다. </li><li> 37 2 μl BamHI (고속 Fermentas) 30 분 품어 ° C. 추가 </li><li> 50 μl TE 및 0.5 μl glycoblue 및 혼합을 추가합니다. 10 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5 믹스를 추가한 다음 250 μl 100 % 에탄올을 추가합니다. -20 ° C. 밤 반복 및 석출물 믹스 </li></ol> 13. PCR 증폭 <ol><li> 스핀 다운 및 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후, 19 μl 물에 펠렛을 resuspend. </li><li> (, 1 μl 입문서 믹스 P5/P3 solexa, 10 μm의 각, 20 μl Accuprime Supermix 한 효소 [Invitrogen] 19 μl cDNA)를 PCR 믹스를 준비합니다. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 실행 25-35 사이클, 68 ° 3 분위한 C, 4 [30 초에 대한 94 ° C 15 초, 65 ° C를위한 30 초, 68 ° C] 94 ° C 2 분을 ° C 영원히. </li><li> 프리 캐스트 6% TBE 젤에 배 TBE 로딩 버퍼와 부하 2 μl (Invit 8 μl PCR 제품 믹스로겐). Sybrgreen I (Invitrogen)로 겔 스테인과 젤 영상기와 함께 분석합니다. </li><li> Rclip의 primers의 바코드는 높은 처리량 시퀀싱을 위해 제출하기 전에 다른 멀티 플렉스 샘플 수 있습니다. 시퀀싱을위한 라이브러리 15 μl를 제출하고 나머지를 저장합니다. </li></ol> 14. 링커 및 프라이머 시퀀스 사전 adenylated 3 '링커 DNA : [우리는 20μM의 aliquots을 다음 IDT의 DNA 어댑터를 주문합니다.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="DNA"> 15. 대표 결과 : 전에 iCLIP 라이브러리의 순서로 실험의 성공은 두 단계에서 모니터할 수 있습니다 : 멤브레인 전송 후 단백질 RNA 복합 (단계 8.5) 및 PCR 제품의 겔 이미지 (단계 13.4)의 autoradiograph합니다. 낮은 RNase 샘플 autoradiograph에서 확산 방사능은 단백질 (그림 2, 샘플 4)의 분자량 위에 볼 수 있습니다. 높은 RNase 샘플의 경우,이 방사능은 가까운 단백질의 분자량 (그림 2, 샘플 3) 초점을 맞추고 있습니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation에 사용하지 않은 경우, 어떤 신호는 (그림 2 샘플 1과 2) 감지되지 않을 것입니다. immunoprecipitation의 특이성에 대한 더 중요한 컨트롤 UV 방사선이나 관심 14 단백질을 표현하지 사용 세포를 생략하거나. PCR 제품 (13.4 단계)의 겔 이미지는 단계 11.4 (그림 4 차선 4-6)에 정화 cDNA 분율 (높은, 중간 또는 낮은)에 해당하는 크기 범위를 표시합니다. PCR primers P3Solexa과 P5Solexa은 cDNA의 크기에 추가 76 NT를 소개합니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation 동안 사용하지 않으면, 해당하는 PCR 제품은 (그림 4 차선 1-3) 감지되지 않을 것입니다. 프리머 이합체 제품은 약 140 NT에서 나타날 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 및 후속 bioinformatic 분석의 대표적인 결과를 얻으려면 14을 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. iCLIP 프로토콜의 도식 표현. 단백질 RNA의 단지는 자외선 조사 (1 단계)를 사용하여 생체내에 covalently을 상호 연결되어 있습니다. 관심의 단백질은 바운드 RNA (단계 2-5)와 함께 정화됩니다. 최종 radioactively (6 단계와 7 단계)로 표시됩니다 반대로 전사의 순서를 특정 마중물 수 있도록, RNA 어댑터 '는 5 반면, RNA의 끝'가 3 출혈도 잡았입니다. 교차 연결된 단백질 RNA의 단지는 SDS - PAGE와 멤브레인 전송 (8 단계)를 사용하여 무료로 RNA의 정화입니다. RNA는 proteinase K는 염기 상호 링크 (9 단계)에 남아있는 polypeptide를 떠나있는 단백질을 소화하여 멤브레인에서 발견한 것입니다. 역방향 전사 (RT)는 남아있는 polypeptide로 잘라 두 cleavable 어댑터 지역 및 바코드 시퀀스 (10 단계)을 소개합니다. 크기 선택 circularization 전에 무료 RT의 뇌관을 제거합니다. 다음 선형화은 PCR의 증폭에 적합 템플릿 (11-15 단계)를 생성합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱은 바코드 시퀀스 즉시 (단계 16) cDNA의 마지막 염기 뒤에있는 읽기를 생성합니다. 교차 연결된 뉴클레오 티드의 상류이 뉴클레오 티드 찾아 한 위치 때문에, 바인딩 사이트는 고해상도로 유추하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 교차 연결된 hnRNP C - RNA의 단지의 Autoradiograph은 denaturing 겔 전기 영동과 막 전송을 사용합니다. hnRNP C - RNA의 단지가 hnRNP C에 대한 항체를 사용하여 세포 추출물에서 단백질 정화되었습니다 (α hnRNP C, 샘플 3, 4). RNA가 부분적으로 낮은 (+) 또는 높은를 사용하여 소화했다 (+ +) RNase의 농도. 단백질의 크기 (40 KDA)에서 이상 이동 단지는 (예제 4) 볼 수 있습니다. RNase의 높은 농도가 (예제 3) 사용했을 때 변화가 덜 발음됩니다. 어떤 항체가 (예제 1과 2) immunoprecipitation에서 사용하지 때 방사성 신호가 사라집니다. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 도식 6% TBE - 요소 젤 (Invitrogen)는 iCLIP cDNA 제품의 절단 안내합니다. 겔은 겔에 cDNAs 및 염료 (파란색 조명과 어두운)의 재현성 마이 그 레이션 패턴 최고 180 V에서 40 분 동안 실행됩니다. (빨간색 선) 고 (H), 중간 (M), 낮은 (L) cDNA 분수를 잘라 면도날을 사용합니다. 플라스틱 겔 카세트에 하늘색 염료의 중간에 즉시 마르크 이상 절단하여 시작하십시오. 매체 낮은 분수를 분할하고 하늘색 염료 위 1cm에 대한 높은 분수를 좀 잘라. 다른 차선을 (이 예제 1-4)를 별도로 주머니와 염색으로 보이는 수직 상처를 사용하십시오. 마커 레인 (m)는 스테인드하고 제어하는​​ 데 몇 군데 있습니다절단 후 크기. 조각 크기는 오른쪽에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 겔 전기 영동을 사용하여 PCR - 증폭된 cDNA 라이브러리 iCLIP 분석. RNA는 반대로 베꼈는데 및 크기 정화가 denaturing 겔 전기 영동 (그림 2)를 사용했던 멤브레인 (그림 1)에서 복구. 세 크기 분수 cDNA (높은 [H] : 120-200 NT, 매체는 [M] : 85-120 NT와 낮은 [L] : 70-85 NT) 복구되었습니다, circularized, 다시 선형 및 PCR - 증폭. 다양한 크기의 배포판의 PCR 제품은 입력 분수의 다양한 크기의 결과로 볼 수 있습니다. PCR 프라이머의 cDNA 76 NT를 도입 이래, 크기는 중간 및 낮은 크기의 분수에 대한 146-161 NT 높은, 161-196 NT 용 196-276 NT 사이의 범위해야합니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation (1-3 차선)에 대한 사용되지 때 PCR 제품은 결석합니다.

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<li>König, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

iCLIP 프로토콜 효소 반응과 정화 ​​단계의 다양한 범위를 포함하고 있기 때문에, 그것은 실험이 실패 문제를 식별하는 데 항상 쉬운 일이 아닙니다. 확인 RNA 상호 링크 사이트의 특이성에 대한 제어하기 위해서는 하나 이상의 부정적인 컨트롤이 전체 실험 이후 전산 분석을 통해 유지되어야합니다. 이러한 컨트롤은 노 항체 샘플, 비 교차 연결된 셀 또는 녹아웃 세포 또는 조직에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 이상적으로, 이러한 제어 실험은 단백질의 RNA 단지를 정화하지 말아야하고, 따라서 SDS - PAGE 젤에 아무런 신호, 및 PCR 증폭 후 노 감지 제품을주지해야합니다. 이러한 컨트롤 라이브러리의 높은 처리량 시퀀싱는 거의 고유의 시퀀스를 반환해야합니다. 결과 시퀀스는 여전히 작은 양이 분해 전지에서 정화되는 것과 동일한 단백질의 상호 링크 사이트에 해당하는 이후 최저 세포는 시퀀싱 제어로 권장하지 않습니다. 주의는 또한 이전의 실험에서 PCR 제품과 오염을 피하기 위해 이동해야합니다. 이 문제를 최소화하는 가장 좋은 방법은 공간 사전 및 사후 PCR 단계를 구분하는 것입니다. 이상적으로, PCR 제품 및 모든 후속 단계의 분석은 별도의 방에서 수행하여야한다. 또한, 실험실의 각 회원은 버퍼와 다른 시약의 자신의 세트를 사용해야합니다. 이러한 방법으로 오염 물질의 출처는 쉽게 확인할 수 있습니다.

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

겔 전기 영동과 막 전송을 위해 우리는 그가 XCell SureLock 사용 t 권장 ® 프로토콜을 통해 지정된 다른 프리 캐스트의 minigels의 사용과 호환 미니 셀 및 XCell II ™ 블롯 모듈 키트 CE 마크 (Invitrogen, EI0002) . 사용되는 모든 재료의 브랜드와 순서 번호는 프로토콜 중에 언급합니다. 프로토콜에 사용되는 효소의 목록은 아래 표에 표시되어 있습니다. <table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 단백질 Dynabeads을 </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> 마우스 또는 염소 항체에 대한 단백질 G를 사용하여 </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> 앰비온 </td><td> AM2295 </td><td> 활동 배치에서 배치로 변경할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> T4 RNA ligase I </td><td> 코 </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> 코 </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> 로체 </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> 윗첨자 III 반전 transcriptase </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> 이 PCR 혼합은 우리 손에 최상의 결과를 제공합니다 </td></tr></table>

iclip - 개인 염기 해상도와 단백질 rna 상호 작용의 transcriptome 전체 매핑

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

성적표에서 RNA 결합 단백질의 독특한 구성과 공간적 배열 (RBPs)는 포스트 transcriptional 규칙 1의 다양한 측면을 안내입니다. 따라서, 분자 수준에서 명시 규정을 이해 향한 필수적인 단계는 RBPs 2의 바인딩 사이트에 위치 정보를 얻을 수 있습니다. 단백질 RNA 상호 작용은 생화 학적 방법을 사용하여 공부 할 수 있지만, 이러한 방식은 원시 세포 문맥에 바인딩 RNA를 해결하지 않습니다. 자신의 세포 환경에서 단백질 RNA의 단지를 공부하는 초기 시도는 차동 디스플레이 또는 microarray 분석 (RIP 칩) 3-5와 결합 친화력 정화 또는 immunoprecipitation을 고용. 이러한 접근은 간접적 또는 비 생리 상호 작용 6 파악하는 경향이 있었다. 클립 (UV 교차 연결 및 immunoprecipitation) 7,8 도입되면서 특이성과 위치 해상도를 향상시키기 위해, 전략 언급. 클립 UV 가교 denaturing polyacrylamide 젤 전기 영동을 포함한 엄격한 정화 체계와 단백질과 RNA 분자의 결합. 높은 처리량 시퀀싱 기술와 함께, 클립 게놈 전체 규모의 단백질 RNA 상호 작용 (조회수 - 클립이나 CLIP - seq로 함) 9,10을 연구하는 강력한 도구로 입증되었습니다. 최근 PAR - 클립 11,12을 교차 연결을위한 photoreactive ribonucleoside의 analogs를 사용 도입되었습니다. 얻은 데이터의 높은 특이성에도 불구하고, 클립 실험은 종종 제한된 순서 복잡 cDNA 라이브러리를 생성합니다. 이것은 공동 정화 RNA의 제한 금액과 도서관 준비에 필요한 두 가지 비효율적인 RNA의 결합 반응에 일부 때문입니다. 또한, 뇌관 확장 assays 많은 cDNAs의 가교 뉴클레오 티드 13 성급하게 잘릴 것을 지적했다. 이러한 잘린 cDNAs는 표준 클립 라이브러리 준비 프로토콜 동안 손실됩니다. 우리는 최근에보다 효율적인 분자내 cDNA circularization (그림 1) 14과 비효율적인 분자간 RNA의 결합 단계 중 하나를 교체하여 잘린 cDNAs을 캡처 iCLIP을 (개인 - 염기 해상도 클립), 개발했습니다. 중요한 것은 잘린 cDNAs을 시퀀싱하는 뉴클레오 티드 해상도에서 상호 링크 사이트의 위치에 통찰력을 제공합니다. 우리는 성공적으로 게놈 전체의 규모에서 hnRNP C 입자 조직을 연구하고 splicing 규정 14의 역할을 평가할 수 iCLIP 적용.

성적표에서 RNA 결합 단백질의 공간적 배열이 포스트 transcriptional 규칙의 주요 결정자이다. 따라서, 우리는 RNA 결합 단백질의 바인딩 사이트의 정확한 게놈 차원의 매핑을 허용 개별 - 염기 해상도 자외선 crosslinking 및 immunoprecipitation (iCLIP)를 개발하였습니다.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

전사체 상의 RNA 결합 단백질(RBP)의 독특한 조성과 공간적 배치는 전사 후 조절의 다양한 측면을 안내합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 개별 뉴클레오타이드 해상도로 RNA 결합 단백질의 결합 부위에 대한 전사체 전체 맵을 얻는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 살아있는 세포에 UV 조사를 하여 생체 내(in vivo)에서 단백질과 RNA를 공유 결합으로 교차 결합시킴으로써 달성됩니다. 교차 결합된 RNA 단편을 회수하기 위해 RNA 결합 단백질을 엄격한 조건에서 면역 정제합니다.다음 역전사 과정에서 생성되는 cDNA는 대개 결합된 펩타이드에서 절단되며, 이를 통해 RNA 내의 교차 결합 위치에 대한 정보가 보존됩니다. cDNA 라이브러리의 고처리량 시퀀싱을 기반으로 전사체 내의 모든 결합 부위를 보여주는 결과가 도출됩니다. 이 방법은 서로 다른 RNA 결합 단백질의 상호작용이 RNA 프로세싱을 어떻게 조절하는지와 같은 RNA 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질-RNA 상호작용의 전사체 전반 지도에 대한 성능과 해상도를 모두 높일 수 있다는 점입니다. 이제 조직 배양 세포의 UV 교차 결합 절차를 시작해 보겠습니다.Healer cell이 배양된 10 centimeter 플레이트에서 배지를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 6 mL를 첨가하고 플레이트를 얼음에 둡니다. 플레이트 한 개로 세 번의 실험이 가능합니다.뚜껑을 제거하고 세포에 조사를 실시합니다. 254 nm에서 150 mJ/cm²로 조사한 후, 셀 리프터(cell lifter)를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내어 수확합니다. 세포 침전물을 만들기 위해 세포 현탁액 2 mL씩을 3개의 마이크로 튜브에 각각 옮깁니다. 4 °C에서 최고 속도로 10초 동안 원심분리합니다.그런 다음 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 드라이아이스로 급속 냉동하여 사용 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 새로운 마이크로 튜브에 실험당 100 µL의 protein A dyna beads를 넣습니다. 마우스 또는 염소 항체를 사용하는 경우, protein G dyna beads를 사용하십시오.동봉된 서면 프로토콜에 기재된 lysis buffer로 비즈를 두 번 세척합니다. 2~10 µg의 항체가 포함된 100 µL의 lysis Buffer에 비즈를 다시 현탁합니다. 튜브를 상온에서 30~60분 동안 회전시킵니다.그런 다음 900 µL의 용해 버퍼로 비드를 3회 세척하고, 다음 단계를 진행할 때까지 마지막 세척액에 비드를 그대로 둡니다. 면역침강을 위해 얼음 위에서 Thor 세포 펠렛을 준비합니다. 세포 펠렛을 1 mL의 용해 버퍼에 재현탁하여 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다.RNase One을 1:500으로 희석하여 준비합니다. 그다음 cell Lysate에 10 µL의 희석액과 2 µL의 Turbo DNase를 함께 첨가합니다. 시료를 37 °C에서 1,100 rpm으로 흔들어주며 정확히 3분 동안 반응시킨 후, 즉시 얼음에 옮겨 보관합니다.그 후, 용해물을 제거하기 위해 샘플을 4 °C, 22,000 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 비즈를 면역 침전시키기 위해 펠렛과 함께 약 50 µL의 용해물을 남겨두고 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 세척 버퍼를 제거한 다음, 준비된 세포 용해물을 첨가합니다. 샘플을 4 °C에서 2시간 동안 회전시킵니다.SUP 시약을 제거하고, 동봉된 서면 프로토콜에 명시된 high salt buffer 900 microliters로 비즈를 두 번 세척합니다. 마지막으로 wash buffer 900 microliters로 비즈를 두 번 세척합니다. 그 다음 RNA 3' 말단의 탈인산화 및 링커 결합 단계를 진행합니다.플렉시글라스 차단막 뒤에서 RNA 5' 말단을 표지합니다. 링커 결합 반응의 마지막 세척 단계에서 상층액을 제거하고, 8 µL의 hot PNK mix에 비드를 재현탁합니다. 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.가열된 PNK 믹스를 제거하고 재사용하십시오. 비드를 1× 새 페이지 로딩 버퍼 20 µL에 현탁합니다. 그런 다음 샘플을 서모 믹서(thermo mixer)에서 70 °C로 10분 동안 배양합니다.빈 비드를 침전시키기 위해 샘플을 즉시 자석 위에 놓으십시오. 제조사의 지침에 따라 샘플을 4~12%의 새 page. Biss gel에 로딩하십시오.또한, 5 µL의 미리 염색된 단백질 크기 마커를 로딩하십시오. 180 V에서 50분 동안 겔을 전기영동합니다. 제조사의 지침에 따라 NOVA wet transfer 장치를 사용하여 겔의 단백질-RNA 복합체를 니트로셀룰로스 막으로 전이시키십시오.트랜스퍼 후, membrane을 PBS 버퍼로 헹굽니다. 그런 다음 Saran wrap으로 감싸 -80 °C에서 필름에 노출시킵니다. 노출 시간은 30분, 1시간 및 overnight로 수행합니다.다음으로, 저분자 RNA(low RNAs)로부터 단백질-RNA 복합체에 해당하는 막 영역을 분리합니다. 이때 자동 방사선 사진(auto radiograph)을 마스크로 사용하여 실험하십시오. Proteinase K 소화와 페놀-클로로포름 추출을 통해 막에서 RNA를 회수합니다.AYP 프라이머 중 하나를 사용하여 RNA를 역전사한 후 cDNA를 젤 정제합니다. cDNA 샘플 6 µL를 2배 TBE urea 로딩 버퍼 6 µL와 혼합합니다. 샘플을 젤에 로딩하기 직전에 수행합니다.시료를 80°C에서 3분 동안 가열합니다. 그다음 저분자량 마커와 함께 시료를 precast 6% TBE urea gel에 로딩합니다. 제조사의 지침에 따라 180V에서 40분 동안 전기영동을 수행하며, 상단 염색약과 플라스틱 젤 지지대의 표시선을 기준으로 절단 부위를 안내합니다.120~200 뉴클레오타이드, 85~120 뉴클레오타이드 및 70~85 뉴클레오타이드 크기의 밴드 세 개를 절단합니다. arc lip 프라이머와 L three 서열을 합하면 clip 서열의 52 뉴클레오타이드에 해당한다는 점에 유의하십시오. 400 µL의 te를 추가하고 겔 조각을 작게 부숩니다.1 mL 시린지 플런저를 사용하여 겔 조각을 37 °C에서 1,100 rpm으로 2시간 동안 흔들어 배양합니다. 1 cm 유리 프리필터 2개를 CoStar spinx 컬럼에 넣습니다. 샘플의 액체 부분을 컬럼로 옮긴 후, 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 1.5 mL 튜브에 수집합니다.0.5 µL의 glyco blue와 pH 5.5의 sodium acetate 40 µL를 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 혼합합니다. 100% ethanol 1 mL를 첨가합니다.다시 혼합하고 -20 °C에서 하룻밤 동안 샘플을 침전시킵니다. 마지막으로, CD NA 분자를 원형화하여 5' 말단에 어댑터 영역을 부착합니다. 다음으로, 아이클립(eye clip) 라이브러리 시퀀싱 전의 동봉된 서면 프로토콜에 따라 다시 선형화하고 PCR 증폭을 수행하며, 실험의 성공 여부는 두 단계에서 모니터링할 수 있습니다.막 전이 후 단백질-RNA 복합체의 자동 방사선 사진과 PCR 생성물의 겔 이미지에서, RNA 함량이 낮은 샘플의 자동 방사선 사진에서는 단백질 분자량 위쪽으로 확산된 방사능이 관찰되어야 하며, RNA 함량이 높은 샘플의 경우 이 방사능이 단백질 분자량에 더 가깝게 집중되어 나타납니다. 면역침전 시 항체를 사용하지 않으면 신호가 검출되지 않아야 합니다.면역침전의 특이성을 확인하기 위한 추가적인 중요 대조군으로는 UV 조사를 생략하거나 표적 단백질을 발현하지 않는 세포를 사용하는 방법이 있습니다. PCR 산물의 겔 이미지는 CD NA 분획에 해당하는 크기 범위가 나타나야 합니다. PCR 프라이머인 P three Celexa와 P five Celexa가 CD NA의 크기에 76개 뉴클레오타이드를 추가한다는 점에 유의하십시오. 면역침전 과정에서 항체를 사용하지 않은 경우, 그에 해당하는 PCR 산물이 검출되지 않아야 합니다.이 절차를 수행할 때, 64가지의 각 단계가 매우 중요하며 100% 정확하게 수행되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. ICL 데이터는 전사체 전반의 기능 분석과 계산적으로 통합될 수 있습니다. 이를 통해 예를 들어, RNA 프로세싱의 위치 의존적 조절에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.전산 데이터 분석에 대해서는 Nicholas KA European Bioinformatics Institute 및 Liana 대학의 bla zupan과 공동으로 진행한 최근 논문들을 참고하시기 바랍니다. 이제 직접 실험을 시작하실 차례입니다. 즐겁게 실험하시길 바랍니다.

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iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

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