Name: 바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: 배우세요 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 피델리티 변종을 분리하고 특성화하는 최적화된 방법을. 돌연변이 빈도 데이터를 활용하여 복제 중 피델리티 변화를 확인하고 바이러스 적응 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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이 작품은 파리의 도시, 아니 프랑스 국립 부여 ANR - 09 - JCJC - 0118-1, 그리고 ERC 시작 부여 RNAvirusPopDivNVax 프로젝트에서 의료 및 건강 연구 부여에서 기금에 의해 지원되었다. 242719.

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포주의 선택. RNA mutagens과 같은 기본 analogs의 효능은 다른 세포 유형 11 그들의 상대적인 이해와 연결합니다. 일반적으로 바이러스 통로에 사용되는 셀 라인이 이해하거나 너무 민감한 (높은 세포 독성)을 mutagen에 내화물로 증명한다면, 이러한 요구 사항을 충족하면서 바이러스 복제 허용하는 다른 세포주를 사용해야 할 수도 있습니다. mutagen 저항 변형이 고립되면 특성의 나머지 부분은 원래, 선호하는 세포주에서 수행할 수 있습니다. 우리의 경험에서 헬라 세포는 쉽게 mutagen을 차지, BHK 세포는 mutagen의 이해에 내화물 아르 10 배 높은 농도와 베로 세포까지 필요합니다. mutagen 이상의 한 종류를 사용하는 경우 mutagen.의 선택은 mutagen 처리, 성공의 가능성에 의해 충실도 변종을 분리하려고 증가합니다. 잘못 복제하는 동안 genomes에 통합됩니다 다양한 구조의 기본 아날로그 mutagens은 주로 후속 복제주기의 변이의 특정 하위 집합의 결과를 유도합니다 ribavirin 치료는 GtoA 및 CtoU 전환 변이 12 호의, 5 azacytidine는 비슷한 편견을 가지고, 함께 CtoG 및 GtoC transversions 13 또한, 5 fluorouracil 우선적으로 AtoG 및 UtoC 전환 유도 14. 또는, MG 2 + 또는 MN이 높은 농도는 + 12 위에서 설명한 바이어스없이 RNA 바이러스의 전반적인 돌연변이의 빈도를 증가시키기 위해 매체를 보충하실 수 있습니다. 바이러스 &#39;코돈 시퀀스에 따라, 그리고 충실도 변종을 생성하는 데 필요한 코돈의 변화, 이러한 조건 중 일부는 다른 이상이 변종의 출현을 선호합니다. 코돈 사이트에서 필요한 AtoG 전이는 주로이 ribavirin에 의해 생성되는 돌연변이로 통신을하기 때문에 높은 충실도 poliovirus G64S 및 콕새키 바이러스 A372V 들어, ribavirin 치료는 가장 쉽게 변종을 위해 선택했습니다. 뫄 대 인구의 크기. 바이러스학에서 조직 문화 감염에 대한 프로토콜을 위해 (높은 뫄) 결함이 방해 입자 (낮은 뫄)의 축적을 방지하거나 바이러스 사이의 재조합을 촉진하기 위해, 감염의 다중성 (뫄)에 특히주의 예. passaging 시리얼 이상 출현 이벤트에 대한 선택하려면, 바이러스 인구 크기를 고려하는 것도 중요합니다. 내성 돌연변이 처음 낮은 주파수에 존재하므로, 각 통로에서 이러한 새로운 변종을 잃지 않도록 다음 (10 5 -10 6 바이러스, 예) 한 구절에서와 같은 대규모 인구 크기 최대한을 전송하는 것이 좋습니다. 물론이나 플라스크의 크기 (감염된 세포의 수를) 최대 배율 것은이 우려하는 경우 뫄의 증가를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 반면에, mutagen에 대한 바이러스의 감도가 테스트되고있는 실험을 위해, 낮은 뫄 감염을 통해 높은 피트니스 genomes에 의해 실험에서 발생하는 복제 사이클의 수를 증가하고 mutagenized genomes의 구조를 방지하기 위해 수행됩니다 공동 감염 세포 complementation. 복제의 첫 라운드 동안 자손의 genomes에서 발생하는 돌연변이가 즉시 감지되지 않습니다 때문에 이것은 중요합니다. 이러한 mutagenized RNAS의 대부분은 여전히​​ virion로 포장됩니다. 그것이 genomes에있는 치명적인 돌연변이가 중단 복제주기의 결과, 및 바이러스 titer 감소됩니다 감염의 다음 라운드에 있습니다. 그것은 치명적인 돌연변이 유발에 큰 영향을 관찰하기 전에 변이의 축적 여러 라운드를 허용해야 할 수도 있습니다. 마지막으로, mutagen의 존재에있는 통로 시리즈 이상, 바이러스 titers가 멸종 때까지 드롭 계속하면, 연구자는 점차 mutagen (매우 낮은 농도에서 시작)의 양의 증가에 바이러스를 passaging 시도해야합니다. 절연 및 RNA mutagen 모성 인구에서 RNA mutagen 저항력 클론을 생성. RNA의 mutagens는 각 염색체에 여러 무작위 변이를 소개하지만, 저항에 대한 선택은 저항 변이를 풍성하게 (그리고 합의 순서로 수정)합니다. 이 변이를 확인하기 위해, 우리 시퀀스 mutagen 모성 인구 (인구의 합의)이 아닌 개별 바이러스. 따라서 mutagen에 의해 만들어진 하나의 무작위 돌연변이가 순서대로 발견되지 않고 다음과 같은 선정 합의의 변화에​​ 결과가 발견되는 유일한 변이. 우리의 경험에서 우리는 하나 또는 두 개의 같은 합의 순서 변경을 식별합니다. mutagen 모성 인구가 취득되고 저항 변이가 확인되면,이 변종보다 순수한 주식을 생성하는 것이 필요합니다. 위, 우리는 상패 정화 절차를 설명했다. 또는 관심있는 바이러스가 쉽게 식별할 수 plaques를 생성하지 않는 경우, 원하는 변종 purif 수 있습니다희석을 제한함으로써 지휘를 맡는​​. 이러한 접근 방식은 기본적으로 바이러스 재고가 우물의 50 % 미만이 감염되는 등 희석 수 있습니다 96 - 웰 형식의 TCID 50입니다. 이 희석을 사용하여, 상기와 같은 방법 10 개인 변종까지 분리하고 그들의 순서를 확인한에 찍은 것입니다. 언급했듯이, 가장 좋은 경우에, 바이러스 스트레인의 감염성 cDNA 클론이 가능합니다. 변종의 격리 따라서 필요 없을 것입니다. 우리의 경험에서 충실도 변종은 하나의 아미노산 대체의 결과이며, 따라서 같은 Quikchange (애질런트)와 같은 간단한 상용 돌연변이 유발 키트를 사용하여 생성할 수 있습니다. 이차 옵션은 밀접하게 관련 변형의 cDNA 클론을 사용하는 것입니다. 관련 변형을 사용하는 경우에는, 우리는 강력하게 우리가 두 밀접한 관련이 바이러스에 동일한 성실 변경 돌연변이 반드시 동일한 효과를 가지고되지 않습니다 찾을 수 있기 때문에 이러한 접근 방식 및 바이러스 분리 (예 : 상패 정화)를 모두 사용하는 것이 좋습니다. 성심과 RNA mutagen 강한 변종의 복제. 선택은 그들의 야생 유형 매쉬 4,12,15과 유사한 성장 특성 모두 높은 낮은 충실도 변종의 격리 결과있다. 현재, 효소 활동 속도와 성실 사이의 링크는 완전히 이해되지 않습니다. 낮은 충실도 변종 빠르게 처리 1-3,12을하는 경향이있는 동안 체외에서 정화 RNA 효소를 사용하여 생화학 연구, 높은 충실도 변종 느린 처리 속도를 가지고 것으로 나타났습니다. 조직 문화에서 이러한 차이는 속도 - 제한 단계, 그 자원의 가용성,보다 본질적인 효소 활동 속도론을 제안, 보통 분명하지 않습니다. 충실도 변종이 야생 유형에서 크게 다르지 않아, 속도론과 복제한다면, 자신의 돌연변이 주파수의 비교 직접 만들 수 있습니다. 복제 속도론에 매우 중요한 변경이있는 경우 다음 데이터 복제 사이클의 동일한 숫자를받은 바이러스를 비교하여 예를 들어 운동의 차이에 대한 계정을 정상화해야합니다. 한 단계 성장 속도론에 큰 차이가 야생 유형과 높은 충실도 변종 사이에 관찰된도했지만 우리의 경험에서, (안에 우리는 높은 충실도의 변종이 지속적으로 야생 유형에 비해 (1 로그 이내) 높은 titer 것을 관찰 그러나 그들은 약간 덜 RNA를 크기의 순서대로)은 더 이상 그들이 생산 genomes 적은 수의 변이를 포함하는보다 전염성 따라서는 것을 몰랐다. 샘플 준비 및 시퀀싱이. 이러한 프로토콜의 모든 단계를 위해, 그것은 그들이 생물학 관련 돌연변이 구별되지 않을 수 있기 때문에 높은 충실도, 증명 - 독서 효소가 추가 변이를 도입 제한 PCR 및 RT - PCR에 사용되는 필수적입니다. 그것은 비교하는 바이러스 인구가 충분한부터 자료가 있다고 확인하는 것도 중요합니다 같은 조건 (통과 기록, 조직 문화 매체, 온도, RNA 추출 방법, RT - PCR 프로토콜 등)에 준비되었습니다 것이 중요합니다 강한 밴드가 RT - PCR에 의해 생성된 이러한 RNA 추출에서 얻은. RNA 샘플의 100분의 1 희석도 샘플 (반복적으로 동일한 게놈을 확장) 표현의 선입견을 피하기 위해 RNA 분자의 충분한 숫자를 포함되었음을 나타내는 감지 RT - PCR 밴드를 제공한다. 돌연변이 주파수 분포이기 때문에, 하나는 유사한 값이 상기 바이어스가 발생하지 않습니다 제공에 관계없이 인구의 크기를 얻을 수있을 것으로 기대합니다. 그림 6 보여주는 마찬가지로 바이러스 주식의 10 5 배 희석은 부모의 혈통이 크게 다르지 않다 돌연변이 주파수를 제공합니다. TopoTA 복제를위한 최적의 조건이 발견되기 전까지는, 시퀀싱 전에 식민지 PCR에 의해, 백색 / 블루 심사 후 삽입의 존재를 확인합니다. mutational 소음 (RT - PCR 및 시퀀싱에 의해 도입 돌연변이)에 대한 제어로서, (가 바이러스 게놈에 해당하는 체외 베꼈는데 RNA의 플라스미드 베어링 같은 바이러스 시퀀스 및 / 또는 복제 및 시퀀스 RT - PCR 제품에서 PCR 제품을 복제 시험 관내 전사 효소에서 다른 것을 알고)는 다른 오류 요금을하고 프로 시저에서 실제 배경 오류와 같은 유용한 정보를 제공하지 않을 수 있습니다. 일부 바이러스 시퀀스는 박테리아에 독성 수 있으므로 그것은 돌연변이 주파수에 대해 합성되는 바이러스 게놈의 지역에 결정하기 전에 이것을 확인하는 것이 중요합니다. TopoTA 얻은 시퀀스를 분석, 각 클론 단 하나의 삽입 / 순서를 포함해야합니다. 더블 피크가 혼합 인구를 제안, 관찰 경우, 두 개의 인접한 박테리아 식민지가 선택되었습니다 수도 있습니다. 정말 어처구니가 돌연변이 박테리아 문화에 플라스미드의 증폭 동안 도입된 것을, 박테리아 복제의 낮은 돌연변이 주파수를 제공하지만 그것은 또한 가능합니다. 플라크의 P에서인구 urified, 더블 피크는 새로운 돌연변을 획득하거나 상패 개발 중에 돌연변을 되돌린 것입니다 중복 plaques, 또는 바이러스를 나타내는 수 있습니다. 일치와 카운트 없거나 이러한 변이를 계산할지 여부를 결정합니다. 마지막으로, 여기에 사용되는 변이의 주파수는 상대적인 가치는 것을 명심하십시오. 그들은 동일한 조건 하에서 재배 바이러스 인구를 비교에 유효하고, 같은 지역을 통해 합성 있습니다! 그들은 돌연변이 속도, 또는 전체 게놈의 돌연변이 빈도의 절대 가치로 이동해서는 안됩니다. 단, 조건이 통제하는 경우, 그들은 돌연변이 분포 및 주파수의 차이의 재현성, 양적 비교를 허용 않습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> ribavirin </td><td> 시그마 </td><td> R9644 - 10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5 - fluorouracil </td><td> 시그마 </td><td> F6627 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> 5 azacytidine </td><td> 시그마 </td><td> A2385 - 100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> M1028 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan 파랑 </td><td> 시그마 </td><td> T8154 - 20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA 복제 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange 돌연변이 유발 키트 </td><td> 애질런트 </td><td> 200516 </td><td> cDNA 전염성 복제 사용할 경우 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 miniprep 키트 </td><td> Macherey - 나겔 </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, 진 코드 주식 회사 </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> 또는 기타 정렬 소프트웨어 </td></tr></tbody></table>

바이러스 변이 주파수의 rna 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA 바이러스들은 genomes을 복제하는 RNA 의존 RNA의 polymerases를 사용합니다. 이 효소의 본질적으로 높은 오류 비율은 바이러스 적응과 진화를 용이하게 극단적인 인구 다양성의 생성에 큰 기여입니다. 증거를 증가하면 고유 오차 속도와 RNA 바이러스의 돌연변이 결과로 주파수가 바이러스 효소에 미묘한 아미노산의 변화에​​ 의해 변조된 수있다는 것을 보여줍니다. 생화학 assays는 법인 성실의 양적 측정을 허용 몇 가지 바이러스성 RNA의 polymerases을 위해 존재하지만, 우리가 충실도 변경 변이를 식별 생화 학적 접근처럼 정확하게 입증되었습니다 RNA 바이러스의 돌연변이 주파수를 측정하는 간단한 방법을 설명합니다. 접근 방식은 대부분의 생물 실험실에서 수행할 수 있습니다 종래의 virological 및 시퀀싱 기술을 사용합니다. 다른 바이러스의 번호와 경험을 바탕으로, 우리는 충실도 변종을 분리하고 통계적 의미의 데이터를 생성 가능성을 높이기 위해 최적화할 수 있어야합니다 핵심 단계를 확인합니다. 성실 변경 변이의 분리 및 특성은 효소의 구조와 기능 1-3에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, 이러한 충실도 변종 바이러스 적응과 진화 4-7의 메커니즘을 특성화에 유용한 도구가 될 수 있습니다.

현재 문서는 RNA 바이러스 및 조직 문화의 충실도 변경 사항을 확인하는 돌연변이 주파수 데이터를 사용하는의 RNA 중합 효소의 충실도 변종을 분리하고 특징하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA 바이러스는 게놈을 복제하기 위해 RNA 의존성 RNA 중합효소를 사용합니다. 이 효소들의 본질적으로 높은 오류율은 ...의 주요 원인이 됩니다.

RNA 바이러스는 바이러스에 의해 인코딩된 RNA 폴리머라제를 사용하여 게놈을 복제합니다. 이러한 폴리머라제는 본질적으로 오류율이 더 높으며, 이는 바이러스가 빠르게 적응하고 진화할 수 있게 합니다. 이 영상에서는 복제 과정 중 오류율이나 충실도에 영향을 주는 RNA 폴리머라제 돌연변이를 가진 바이러스를 스크리닝하고 식별하는 최적화된 방법을 제시합니다.먼저 바이러스 숙주 세포에 돌연변이 유발 물질을 처리하여, 세포를 사멸시키거나 바이러스를 억제하지 않으면서 사용할 수 있는 최대 농도를 결정합니다. 최적 조건이 결정되면, RNA 돌연변이 유발 물질의 선택압 하에서 바이러스를 계대 배양합니다. 이후 돌연변이 내성 집단을 시퀀싱하여 원인이 되는 돌연변이를 식별합니다.다음으로, 돌연변이 유발제 내성 변이주를 분리합니다. 복제 역학을 모니터링하며, 그 결과 폴리머라제 충실도가 증가하거나 감소함을 확인합니다. 이는 RNA 돌연변이 유발제에 대한 광범위한 내성 및 바이러스 집단의 돌연변이 빈도 변화와 동시에 나타납니다.정제된 폴리머라제를 사용하는 생화학적 충실도 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 조직 배양에서 배양이 가능한 모든 RNA 바이러스에 대해 적용 가능하다는 점입니다. 이 방법은 바이러스의 적응 및 진화에서 폴리머라제 오작동의 역할과 같은 바이러스학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 선택 압력을 너무 강하거나 약하게 설정하거나, 통계적 검정력을 확보하기 위한 분석 부위의 서열 샘플 크기와 클론 수가 최적화되지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다.세포 사멸을 일으키지 않으면서 다음 실험들에 사용할 수 있는 돌연변이 유발제의 농도 범위를 결정함으로써 이 실험을 시작하십시오. hilar 세포의 sub confluent 단층이 포함된 6-웰 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 돌연변이 유발제가 첨가된 배지 2mL를 추가합니다. 여기에서는 돌연변이 유발제로 ribovirin, 5-fluorouracil, 5-azacitidine, magnesium chloride 및 manganese chloride를 사용합니다.세포를 37°C 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양합니다. 이후 2일부터 7일까지 24시간마다 세포 플레이트 하나를 사용하여 trypan blue 배제법으로 생존력을 확인합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여, 감염 종료 시점까지 세포 사멸률이 50% 미만이 되는 비처리 대조군 조건을 포함하여 각 돌연변이원 농도별 생존 세포 백분율을 계산합니다.최대 타이터에 도달하여 이상적인 상태가 되면, 다음 단계로 모집단에 과도한 돌연변이를 유발하지 않으면서 최적의 선택 압력을 가할 수 있는 돌연변이원 농도를 결정합니다. 모든 게놈의 최소 한두 군데 위치에 돌연변이가 발생하도록 하며, 이를 통해 돌연변이원은 저항성 돌연변이를 생성하고, 이는 이후 계대 배양 과정을 통해 선택됩니다.너무 많은 돌연변이가 도입되면, 저항성 돌연변이를 가진 돌연변이체 자체가 치사 상태가 될 수 있습니다. 돌연변이원은 세포가 파종된 6-웰 플레이트에서 이들의 분리를 방해합니다. 2 mL의 돌연변이원 보충 배지를 사용하여, 50% 이상의 세포 사멸을 초래한 농도를 제외하고 이전과 동일한 농도 범위를 사용합니다.배양 후 돌연변이 유발 물질의 흡수를 위해 2시간 동안 배양합니다. 배지를 흡입 제거하고 200 µL의 낮은 감염 다중도로 바이러스를 감염시킨 뒤, 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있도록 15분에서 60분 동안 배양하며, 접종액이 세포 단층을 충분히 덮을 수 있도록 주기적으로 플레이트를 흔들어 줍니다. 접종된 바이러스를 흡입 제거하고 2 mL의 PBS로 두 번 세척하여 접종액을 최대한 제거합니다.그 다음 각 웰에 돌연변이 유발 물질이 포함된 배지를 추가하고, 보통 2~7일 동안 3~6회 복제 주기에 해당하는 시간 동안 세포를 배양합니다. 각 웰에서 바이러스를 수확하고 표준 플라크 분석법(plaque assay) 또는 한계 희석법(limiting dilution)을 수행하여 계산된 역가로부터 바이러스 역가에 미치는 항바이러스 효과를 결정합니다. 처리하지 않은 대조군 감염과 비교하여 바이러스 역가를 0.5~2 log 감소시키면서 세포에 대해 독성이 높지 않은 돌연변이 유발 물질의 농도를 확인합니다.돌연변이 내성 변이주를 분리하기 위해서는 독성이 이상적으로 50% 미만이어야 하며, 각 돌연변이 유발제의 최적 농도로 HeLa 세포에서 바이러스를 계대 배양하는 것부터 시작하십시오. 바이러스는 각 단계에서 최대 30회까지 계대 배양해야 할 수 있으며, 바이러스 역가를 측정하고 여기에 표시된 대로 돌연변이 유발제를 이용한 감염 및 배양을 반복하십시오. 돌연변이 유발제로 처리된 샘플의 바이러스 역가는 초기 바이러스 역가 및 처리되지 않은 대조군 바이러스 역가와 비교하여 초기 몇 차례의 계대 배양 동안 감소해야 합니다. 특정 계열의 바이러스 역가가 처리되지 않은 대조군 역가와 동일한 수준에 도달하면 내성이 생긴 것으로 간주합니다.관심 바이러스의 폴리머라아제(polymerase) 또는 복제 유전자를 증폭하는 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 위한 바이러스 RNA를 추출합니다. RT-PCR을 통해 바이러스 게놈의 cDNA를 생성한 후, 해당 DNA의 서열을 분석합니다. 서열 정보가 확보되면.정렬 소프트웨어를 사용하여 결과 시퀀스를 참조 컨센서스와 정렬하고 새로운 점 돌연변이를 식별하십시오. 또한, 정렬 소프트웨어가 놓쳤을 수 있는 소수 피크가 있는지 크로마토그램을 확인하십시오. 전체 집단의 20~30%를 차지하는 돌연변이는 여전히 피크로 나타나지만, 표준 시퀀스 분석으로는 혼합 뉴클레오타이드로 식별하기에는 너무 작을 수 있습니다. 관심 돌연변이를 식별하려면, 여기에 표시된 것처럼 동일한 계대 배양의 처리되지 않은 대조군과 비교하여 돌연변이원 처리 집단에서만 독점적으로 나타나는 단일 뉴클레오타이드 다형성을 찾으십시오. 돌연변이가 식별되면, 감염성 cDNA로부터 저항성 변이체를 재생성하거나 조직 배양에서 분리하여 저항성 표현형을 확인해야 합니다.여기서는 확인된 돌연변이체를 분리하기 위해 플라크 분석법을 사용합니다. 질소 내성 샘플을 단계 희석하여 준비하고, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양한 후 6-웰 플레이트의 세포 단일층에 첨가하여 플라크 분석을 수행합니다. 감염 2~5일 후에 아가로스 오버레이를 추가합니다.플라크가 명확하게 보여야 합니다. 이상적으로는, 플레이트 중 하나에서 10~50개의 잘 분리된 플라크가 생성되어야 합니다. 마커를 사용하여 플레이트 위 플라크의 위치를 점으로 표시하되, 오버레이의 위치가 밀리거나 이동하지 않도록 주의하며 P 200 필터 팁을 아가로스 오버레이에 살며시 찌릅니다.플라크에 도달하려면 팁을 오버레이에서 조심스럽게 들어 올린 후, aros 플러그를 250 µL의 배지가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. aros 플러그가 팁에서 분리되었는지 여부와 관계없이 충분한 양의 바이러스가 전이될 것이며, 튜브를 vortex 하여 처리당 최대 10배까지 회수합니다. 이후 살아있는 바이러스를 증폭시키기 위해 샘플의 일부를 보관하십시오.그런 다음 샘플의 나머지 부분에서 RNA를 추출하고 R-T-P-C-R을 수행하여 원하는 돌연변이가 포함된 플라크 샘플을 확인합니다. cDNA를 시퀀싱하여 추가 돌연변이가 없는지 확인하십시오.그 후, 모든 후속 연구를 위해 이 바이러스의 대용량 스톡을 제작합니다. 다음으로, 확인된 돌연변이에 의해 부여된 내성을 확인합니다. 여러 돌연변이 유발 조건을 사용하여 돌연변이 유발 분석을 반복합니다.변이체가 여러 돌연변이 유발 물질에 저항성을 보인다면, 이는 충실도(fidelity)가 증가했을 가능성이 큽니다. 충실도를 변화시키는 돌연변이는 중합효소(polymerase)에 매핑되므로, 복제 역학(replication kinetics)이 유의미하게 변화하지 않았음을 확인하는 것이 중요합니다. 돌연변이 빈도를 결정하기 전에, 최소 두 가지의 상보적인 접근 방식을 통해 복제 과정을 검토하십시오.예를 들어, 정량적 R-T-P-C-R 또는 northern blot과 같이 RNA 합성을 조사하는 방법과 더불어 plaque assay 또는 TCID 50과 같이 바이러스 생성을 조사하는 방법을 추가로 수행할 수 있습니다. 다음으로, 돌연변이에 대한 내성을 부여하는 것으로 확인된 중합효소 변화가 복제를 변화시키는지 확인하기 위해 충실도 돌연변이 빈도를 측정합니다. 이는 생존 바이러스 집단 또는 전체 바이러스 집단 모두에서 수행할 수 있습니다.생존 가능한 변이체와 생존 불가능한 변이체를 모두 포함하는 전체 바이러스 집단의 돌연변이 빈도를 결정하기 위해, RNA를 추출하고 구조 단백질을 코딩하는 영역과 같이 유전적 변이가 있는 것으로 알려진 코딩 서열에서 800 내지 1,200 뉴클레오타이드 영역을 R-T-P-C-R로 증폭합니다. 다음으로, 연구 대상이 되는 각 바이러스 집단의 정제된 산물을 topo TA 클로닝합니다. X-gal 도말 플레이트에서 블루-화이트 스크리닝을 통해 삽입물 양성으로 확인된 96개의 콜로니를 선택합니다.청백색 스크리닝(blue white screening)의 유효성을 확인하기 위해 단일 콜로니 PCR을 수행합니다. 위의 단편 크기와 조건을 사용하면 콜로니의 약 90%가 양성으로 나타나야 합니다. 양성인 각 흰색 콜로니에 대해, 이쑤시개를 사용하여 각 콜로니를 96웰 플레이트의 1 mL LB 배지로 옮깁니다.박테리아 배양 플레이트를 37°C에서 지속적으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 96-웰 포맷으로 미니 프렙(mini prep)을 준비하여 DNA를 분리하고, 클로닝된 세그먼트의 최대 커버리지를 얻을 수 있도록 각 플레이트를 충분한 프라이머로 시퀀싱합니다.600 base 커버리지의 프라이머 2개면 충분할 것입니다. 각 집단에 대한 참조 서열 또는 합의 서열과 단일 염기 다형성을 쉽게 식별할 수 있는 적절한 정렬 소프트웨어를 사용하여 서열 분석을 수행하십시오. DNA star laser의 소프트웨어를 활용하시기 바랍니다.먼저 염기 서열 판독값이 좋지 않은 말단 부위가 많거나 길이가 너무 짧은 것과 같이 품질이 낮은 서열들을 제거하는 데 Gene을 사용합니다. 남은 서열들을 정렬합니다. 분석에 포함된 모든 서열이 공통으로 포함하는 뉴클레오티드 범위를 확인합니다.해당 영역 전체가 커버되지 않은 클론은 폐기하십시오. 비교 분석을 위해 동일한 영역이 완전히 커버되는 것이 필수적입니다. 참조 균주와 다른 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)을 식별하고 그 수를 세십시오.전체 단일 뉴클레오타이드 다형체(single nucleotide polymorphism)의 수를 시퀀싱된 전체 뉴클레오타이드 수로 나누어 돌연변이 빈도를 계산하십시오. 이 수치를 시퀀싱된 10,000 뉴클레오타이드당 평균 돌연변이 수로 나타내십시오. 만약 동일한 단일 뉴클레오타이드 다형체가 다수의 클론에서 나타나는 경우, 이러한 반복된 돌연변이를 포함한 값과 제외한 값의 두 가지 수치를 제시하십시오.돌연변이 분포를 결정하십시오. 각 집단에서 0, 1, 2, 3개 등의 돌연변이를 나타내는 클론 수의 순위 목록을 작성하십시오. 선택적으로 시퀀싱된 영역의 돌연변이를 확인하십시오.편집된 서열을 사용하여 샘플 내에서 가능한 모든 쌍별 비교를 계산함으로써 집단 다양성의 평균값을 구합니다. 여기에는 여러 정렬 프로그램이 제공됩니다. MEGA라고도 불리는 분자 진화 유전학 분석 프로그램은 RNA 돌연변이 저항성 힐을 선택하기 위한 최적 조건을 결정하는 데 사용됩니다.세포에 리보비린(ribovirin)의 농도를 점진적으로 높여 처리한 후, 감염 다중도(multiplicity of infection) 0.01로 야생형 Cox AKI B 바이러스를 감염시켰으며, 감염 48시간 후에 분석하였습니다. 증식된 바이러스를 수확하여 TCID₅₀로 역가를 측정하였습니다. 본 수치는 감염 48시간 후 트라이판 블루(trypan blue) 염색으로 측정한 x축 기준 처리 후 생존 세포의 백분율을 나타냅니다.결과에 따르면 100 및 200 µM 농도에서 세포 생존능에 영향을 주지 않고 바이러스 역가가 1~2 log 감소했습니다. 돌연변이 유발제 내성 집단을 선별하기 위해, CHI ganga 바이러스를 50 µM ribovirin이 존재하는 조건(회색 막대) 또는 존재하지 않는 조건(검은색 막대)에서 hilar 세포에 감염시켰으며, 매 계대 후 바이러스 자손을 이곳에서 보는 바와 같이 BHK 세포를 이용한 전형적인 플라크 분석법으로 정량화했습니다. 돌연변이 유발 효과는 처리된 바이러스 역가가 2 log 감소한 초기 계대 과정에서 뚜렷하게 나타납니다.Titus는 점차 처리 전의 정상 수준으로 회복되었습니다. 다섯 가지 돌연변이 유발 물질을 처리한 군과 처리하지 않은 군 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 내성 변이체가 선택되었음을 시사합니다. 실제로 시퀀싱을 통해 리보비린(ribovirin) 처리를 거친 바이러스 집단에서 고유한 돌연변이를 확인하여 서로 다른 구조의 RNA 돌연변이 유발 물질에 대한 광범위한 내성을 입증하였습니다. 초기 스크리닝에서 분리된 COA 바이러스 B three의 고충실도 A 3 72 V 변이체를 대상으로 RIBOVIRIN, 5-fluoro uracil, 5-azacitidine 등 다양한 농도의 RNA 돌연변이 유발 물질에 대한 감수성 감소 여부를 테스트하였습니다.HeC cells를 표시된 농도의 ribovirin으로 처리한 후, 감염 다중도(MOI) 0.01로 wild type Cox AKI virus B 3에 감염시켰으며, 감염 48시간 후에 자손 바이러스를 수확하여 TCID₅₀로 역가를 측정하였습니다. 여기에는 돌연변이 농도에 따른 wild type과 A 3 72 변이체의 역가가 나타나 있습니다. A 3 72 V는 일관되게 wild type보다 높은 역가를 보였습니다.바이러스 생성의 단일 단계 성장 kinetics를 결정하기 위해 테스트한 모든 조건에서, 세포에 야생형, 고충실도 변이체 A372V 또는 복제 결핍 변이체 CX64 Cox AKI 바이러스 B3를 10의 감염 다중도로 감염시켰습니다. 표시된 시점에 세포 및 상층액에서 동결-해동법으로 후손 바이러스를 수확하고 TCID₅₀로 역가를 측정했습니다. A372V의 충실도 증가는 조직 배양에서 관찰 가능한 복제 결함과 일치하지 않았습니다. CX64 변이체는 복제 kinetics에서 상당한 지연을 보였으며, 야생형 바이러스보다 1,000배 낮은 최대 역가에 도달했습니다.본 비디오에서 설명한 방법을 사용하면, 시퀀싱되는 각 클론은 전체 바이러스 집단 내의 고유한 게놈에서 유래하며 따라서 고유한 변이를 보유하게 됩니다. 이 그림은 저품질 시퀀스를 정제하고 단일 염기 다형성을 시각화한 후의 전형적인 정렬 상태를 보여줍니다. 집단 내의 전체 단일 염기 다형성을 산출하고, 각 클론에 나타나는 단일 염기 다형성의 수를 기록하였습니다.예를 들어, 바(bar)로 밑줄이 그어진 클론은 두 개의 고유한 돌연변이를 포함하고 있는 반면, 다른 8개의 클론은 단일 고유 돌연변이를 포함하고 있습니다. 이 데이터는 여기에 표시된 표와 같은 표를 작성하는 데 사용됩니다. 이 표는 돌연변이 수에 따른 서열 분석된 클론의 순위 분포를 보여줍니다.순위 값의 통계적 비교를 통해 한 분포가 다른 분포와 유의미하게 다른지 판단할 수 있습니다. 더 쉬운 해석을 위해, 서열 및 통계 분석에서 얻은 수치 데이터는 차트나 히스토그램으로 나타낼 수 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, A 3 72 V 바이러스는 야생형보다 돌연변이를 적게 생성하며, P 값이 0.01 미만으로 유의미하게 낮은 돌연변이 빈도를 보입니다.동일한 닭 ganga 바이러스 집단은 바이러스 스톡을 사용하든 10⁵배 희석액을 사용하여 RNA를 추출하든 유사한 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 따라서 이 절차를 따라, 이 중합효소 변이체의 정확성에 대한 기전적 및 구조적 기초를 더 잘 이해하기 위해 인 비트로(in vitro) 생화학적 분석이나 결정화 연구를 수행할 수 있습니다.이러한 발전 이후, 이 기술은 생물학 분야의 연구자들이 생체 내(in vivo)에서 유전적 다양성과 바이러스 적합성 사이의 상관관계를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, RNA 바이러스의 충실도 변이체(fidelity variants)를 분리할 가능성을 높이는 방법과 돌연변이 빈도를 이용하여 이러한 충실도 차이를 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

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호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

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양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

배우세요 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 피델리티 변종을 분리하고 특성화하는 최적화된 방법을. 돌연변이 빈도 데이터를 활용하여 복제 중 피델리티 변화를 확인하고 바이러스 적응 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

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