바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA 바이러스는 바이러스에 의해 인코딩된 RNA 폴리머라제를 사용하여 게놈을 복제합니다. 이러한 폴리머라제는 본질적으로 오류율이 더 높으며, 이는 바이러스가 빠르게 적응하고 진화할 수 있게 합니다. 이 영상에서는 복제 과정 중 오류율이나 충실도에 영향을 주는 RNA 폴리머라제 돌연변이를 가진 바이러스를 스크리닝하고 식별하는 최적화된 방법을 제시합니다.

먼저 바이러스 숙주 세포에 돌연변이 유발 물질을 처리하여, 세포를 사멸시키거나 바이러스를 억제하지 않으면서 사용할 수 있는 최대 농도를 결정합니다. 최적 조건이 결정되면, RNA 돌연변이 유발 물질의 선택압 하에서 바이러스를 계대 배양합니다. 이후 돌연변이 내성 집단을 시퀀싱하여 원인이 되는 돌연변이를 식별합니다.

다음으로, 돌연변이 유발제 내성 변이주를 분리합니다. 복제 역학을 모니터링하며, 그 결과 폴리머라제 충실도가 증가하거나 감소함을 확인합니다. 이는 RNA 돌연변이 유발제에 대한 광범위한 내성 및 바이러스 집단의 돌연변이 빈도 변화와 동시에 나타납니다.

정제된 폴리머라제를 사용하는 생화학적 충실도 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 조직 배양에서 배양이 가능한 모든 RNA 바이러스에 대해 적용 가능하다는 점입니다. 이 방법은 바이러스의 적응 및 진화에서 폴리머라제 오작동의 역할과 같은 바이러스학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 선택 압력을 너무 강하거나 약하게 설정하거나, 통계적 검정력을 확보하기 위한 분석 부위의 서열 샘플 크기와 클론 수가 최적화되지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다.

세포 사멸을 일으키지 않으면서 다음 실험들에 사용할 수 있는 돌연변이 유발제의 농도 범위를 결정함으로써 이 실험을 시작하십시오. hilar 세포의 sub confluent 단층이 포함된 6-웰 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 돌연변이 유발제가 첨가된 배지 2mL를 추가합니다. 여기에서는 돌연변이 유발제로 ribovirin, 5-fluorouracil, 5-azacitidine, magnesium chloride 및 manganese chloride를 사용합니다.

세포를 37°C 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양합니다. 이후 2일부터 7일까지 24시간마다 세포 플레이트 하나를 사용하여 trypan blue 배제법으로 생존력을 확인합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여, 감염 종료 시점까지 세포 사멸률이 50% 미만이 되는 비처리 대조군 조건을 포함하여 각 돌연변이원 농도별 생존 세포 백분율을 계산합니다.

최대 타이터에 도달하여 이상적인 상태가 되면, 다음 단계로 모집단에 과도한 돌연변이를 유발하지 않으면서 최적의 선택 압력을 가할 수 있는 돌연변이원 농도를 결정합니다. 모든 게놈의 최소 한두 군데 위치에 돌연변이가 발생하도록 하며, 이를 통해 돌연변이원은 저항성 돌연변이를 생성하고, 이는 이후 계대 배양 과정을 통해 선택됩니다.

너무 많은 돌연변이가 도입되면, 저항성 돌연변이를 가진 돌연변이체 자체가 치사 상태가 될 수 있습니다. 돌연변이원은 세포가 파종된 6-웰 플레이트에서 이들의 분리를 방해합니다. 2 mL의 돌연변이원 보충 배지를 사용하여, 50% 이상의 세포 사멸을 초래한 농도를 제외하고 이전과 동일한 농도 범위를 사용합니다.

배양 후 돌연변이 유발 물질의 흡수를 위해 2시간 동안 배양합니다. 배지를 흡입 제거하고 200 µL의 낮은 감염 다중도로 바이러스를 감염시킨 뒤, 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있도록 15분에서 60분 동안 배양하며, 접종액이 세포 단층을 충분히 덮을 수 있도록 주기적으로 플레이트를 흔들어 줍니다. 접종된 바이러스를 흡입 제거하고 2 mL의 PBS로 두 번 세척하여 접종액을 최대한 제거합니다.

그 다음 각 웰에 돌연변이 유발 물질이 포함된 배지를 추가하고, 보통 2~7일 동안 3~6회 복제 주기에 해당하는 시간 동안 세포를 배양합니다. 각 웰에서 바이러스를 수확하고 표준 플라크 분석법(plaque assay) 또는 한계 희석법(limiting dilution)을 수행하여 계산된 역가로부터 바이러스 역가에 미치는 항바이러스 효과를 결정합니다. 처리하지 않은 대조군 감염과 비교하여 바이러스 역가를 0.5~2 log 감소시키면서 세포에 대해 독성이 높지 않은 돌연변이 유발 물질의 농도를 확인합니다.

돌연변이 내성 변이주를 분리하기 위해서는 독성이 이상적으로 50% 미만이어야 하며, 각 돌연변이 유발제의 최적 농도로 HeLa 세포에서 바이러스를 계대 배양하는 것부터 시작하십시오. 바이러스는 각 단계에서 최대 30회까지 계대 배양해야 할 수 있으며, 바이러스 역가를 측정하고 여기에 표시된 대로 돌연변이 유발제를 이용한 감염 및 배양을 반복하십시오. 돌연변이 유발제로 처리된 샘플의 바이러스 역가는 초기 바이러스 역가 및 처리되지 않은 대조군 바이러스 역가와 비교하여 초기 몇 차례의 계대 배양 동안 감소해야 합니다. 특정 계열의 바이러스 역가가 처리되지 않은 대조군 역가와 동일한 수준에 도달하면 내성이 생긴 것으로 간주합니다.

관심 바이러스의 폴리머라아제(polymerase) 또는 복제 유전자를 증폭하는 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 위한 바이러스 RNA를 추출합니다. RT-PCR을 통해 바이러스 게놈의 cDNA를 생성한 후, 해당 DNA의 서열을 분석합니다. 서열 정보가 확보되면.

정렬 소프트웨어를 사용하여 결과 시퀀스를 참조 컨센서스와 정렬하고 새로운 점 돌연변이를 식별하십시오. 또한, 정렬 소프트웨어가 놓쳤을 수 있는 소수 피크가 있는지 크로마토그램을 확인하십시오. 전체 집단의 20~30%를 차지하는 돌연변이는 여전히 피크로 나타나지만, 표준 시퀀스 분석으로는 혼합 뉴클레오타이드로 식별하기에는 너무 작을 수 있습니다. 관심 돌연변이를 식별하려면, 여기에 표시된 것처럼 동일한 계대 배양의 처리되지 않은 대조군과 비교하여 돌연변이원 처리 집단에서만 독점적으로 나타나는 단일 뉴클레오타이드 다형성을 찾으십시오. 돌연변이가 식별되면, 감염성 cDNA로부터 저항성 변이체를 재생성하거나 조직 배양에서 분리하여 저항성 표현형을 확인해야 합니다.

여기서는 확인된 돌연변이체를 분리하기 위해 플라크 분석법을 사용합니다. 질소 내성 샘플을 단계 희석하여 준비하고, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양한 후 6-웰 플레이트의 세포 단일층에 첨가하여 플라크 분석을 수행합니다. 감염 2~5일 후에 아가로스 오버레이를 추가합니다.

플라크가 명확하게 보여야 합니다. 이상적으로는, 플레이트 중 하나에서 10~50개의 잘 분리된 플라크가 생성되어야 합니다. 마커를 사용하여 플레이트 위 플라크의 위치를 점으로 표시하되, 오버레이의 위치가 밀리거나 이동하지 않도록 주의하며 P 200 필터 팁을 아가로스 오버레이에 살며시 찌릅니다.

플라크에 도달하려면 팁을 오버레이에서 조심스럽게 들어 올린 후, aros 플러그를 250 µL의 배지가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. aros 플러그가 팁에서 분리되었는지 여부와 관계없이 충분한 양의 바이러스가 전이될 것이며, 튜브를 vortex 하여 처리당 최대 10배까지 회수합니다. 이후 살아있는 바이러스를 증폭시키기 위해 샘플의 일부를 보관하십시오.

그런 다음 샘플의 나머지 부분에서 RNA를 추출하고 R-T-P-C-R을 수행하여 원하는 돌연변이가 포함된 플라크 샘플을 확인합니다. cDNA를 시퀀싱하여 추가 돌연변이가 없는지 확인하십시오.

그 후, 모든 후속 연구를 위해 이 바이러스의 대용량 스톡을 제작합니다. 다음으로, 확인된 돌연변이에 의해 부여된 내성을 확인합니다. 여러 돌연변이 유발 조건을 사용하여 돌연변이 유발 분석을 반복합니다.

변이체가 여러 돌연변이 유발 물질에 저항성을 보인다면, 이는 충실도(fidelity)가 증가했을 가능성이 큽니다. 충실도를 변화시키는 돌연변이는 중합효소(polymerase)에 매핑되므로, 복제 역학(replication kinetics)이 유의미하게 변화하지 않았음을 확인하는 것이 중요합니다. 돌연변이 빈도를 결정하기 전에, 최소 두 가지의 상보적인 접근 방식을 통해 복제 과정을 검토하십시오.

예를 들어, 정량적 R-T-P-C-R 또는 northern blot과 같이 RNA 합성을 조사하는 방법과 더불어 plaque assay 또는 TCID 50과 같이 바이러스 생성을 조사하는 방법을 추가로 수행할 수 있습니다. 다음으로, 돌연변이에 대한 내성을 부여하는 것으로 확인된 중합효소 변화가 복제를 변화시키는지 확인하기 위해 충실도 돌연변이 빈도를 측정합니다. 이는 생존 바이러스 집단 또는 전체 바이러스 집단 모두에서 수행할 수 있습니다.

생존 가능한 변이체와 생존 불가능한 변이체를 모두 포함하는 전체 바이러스 집단의 돌연변이 빈도를 결정하기 위해, RNA를 추출하고 구조 단백질을 코딩하는 영역과 같이 유전적 변이가 있는 것으로 알려진 코딩 서열에서 800 내지 1,200 뉴클레오타이드 영역을 R-T-P-C-R로 증폭합니다. 다음으로, 연구 대상이 되는 각 바이러스 집단의 정제된 산물을 topo TA 클로닝합니다. X-gal 도말 플레이트에서 블루-화이트 스크리닝을 통해 삽입물 양성으로 확인된 96개의 콜로니를 선택합니다.

청백색 스크리닝(blue white screening)의 유효성을 확인하기 위해 단일 콜로니 PCR을 수행합니다. 위의 단편 크기와 조건을 사용하면 콜로니의 약 90%가 양성으로 나타나야 합니다. 양성인 각 흰색 콜로니에 대해, 이쑤시개를 사용하여 각 콜로니를 96웰 플레이트의 1 mL LB 배지로 옮깁니다.

박테리아 배양 플레이트를 37°C에서 지속적으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 96-웰 포맷으로 미니 프렙(mini prep)을 준비하여 DNA를 분리하고, 클로닝된 세그먼트의 최대 커버리지를 얻을 수 있도록 각 플레이트를 충분한 프라이머로 시퀀싱합니다.

600 base 커버리지의 프라이머 2개면 충분할 것입니다. 각 집단에 대한 참조 서열 또는 합의 서열과 단일 염기 다형성을 쉽게 식별할 수 있는 적절한 정렬 소프트웨어를 사용하여 서열 분석을 수행하십시오. DNA star laser의 소프트웨어를 활용하시기 바랍니다.

먼저 염기 서열 판독값이 좋지 않은 말단 부위가 많거나 길이가 너무 짧은 것과 같이 품질이 낮은 서열들을 제거하는 데 Gene을 사용합니다. 남은 서열들을 정렬합니다. 분석에 포함된 모든 서열이 공통으로 포함하는 뉴클레오티드 범위를 확인합니다.

해당 영역 전체가 커버되지 않은 클론은 폐기하십시오. 비교 분석을 위해 동일한 영역이 완전히 커버되는 것이 필수적입니다. 참조 균주와 다른 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)을 식별하고 그 수를 세십시오.

전체 단일 뉴클레오타이드 다형체(single nucleotide polymorphism)의 수를 시퀀싱된 전체 뉴클레오타이드 수로 나누어 돌연변이 빈도를 계산하십시오. 이 수치를 시퀀싱된 10,000 뉴클레오타이드당 평균 돌연변이 수로 나타내십시오. 만약 동일한 단일 뉴클레오타이드 다형체가 다수의 클론에서 나타나는 경우, 이러한 반복된 돌연변이를 포함한 값과 제외한 값의 두 가지 수치를 제시하십시오.

돌연변이 분포를 결정하십시오. 각 집단에서 0, 1, 2, 3개 등의 돌연변이를 나타내는 클론 수의 순위 목록을 작성하십시오. 선택적으로 시퀀싱된 영역의 돌연변이를 확인하십시오.

편집된 서열을 사용하여 샘플 내에서 가능한 모든 쌍별 비교를 계산함으로써 집단 다양성의 평균값을 구합니다. 여기에는 여러 정렬 프로그램이 제공됩니다. MEGA라고도 불리는 분자 진화 유전학 분석 프로그램은 RNA 돌연변이 저항성 힐을 선택하기 위한 최적 조건을 결정하는 데 사용됩니다.

세포에 리보비린(ribovirin)의 농도를 점진적으로 높여 처리한 후, 감염 다중도(multiplicity of infection) 0.01로 야생형 Cox AKI B 바이러스를 감염시켰으며, 감염 48시간 후에 분석하였습니다. 증식된 바이러스를 수확하여 TCID₅₀로 역가를 측정하였습니다. 본 수치는 감염 48시간 후 트라이판 블루(trypan blue) 염색으로 측정한 x축 기준 처리 후 생존 세포의 백분율을 나타냅니다.

결과에 따르면 100 및 200 µM 농도에서 세포 생존능에 영향을 주지 않고 바이러스 역가가 1~2 log 감소했습니다. 돌연변이 유발제 내성 집단을 선별하기 위해, CHI ganga 바이러스를 50 µM ribovirin이 존재하는 조건(회색 막대) 또는 존재하지 않는 조건(검은색 막대)에서 hilar 세포에 감염시켰으며, 매 계대 후 바이러스 자손을 이곳에서 보는 바와 같이 BHK 세포를 이용한 전형적인 플라크 분석법으로 정량화했습니다. 돌연변이 유발 효과는 처리된 바이러스 역가가 2 log 감소한 초기 계대 과정에서 뚜렷하게 나타납니다.

Titus는 점차 처리 전의 정상 수준으로 회복되었습니다. 다섯 가지 돌연변이 유발 물질을 처리한 군과 처리하지 않은 군 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 내성 변이체가 선택되었음을 시사합니다. 실제로 시퀀싱을 통해 리보비린(ribovirin) 처리를 거친 바이러스 집단에서 고유한 돌연변이를 확인하여 서로 다른 구조의 RNA 돌연변이 유발 물질에 대한 광범위한 내성을 입증하였습니다. 초기 스크리닝에서 분리된 COA 바이러스 B three의 고충실도 A 3 72 V 변이체를 대상으로 RIBOVIRIN, 5-fluoro uracil, 5-azacitidine 등 다양한 농도의 RNA 돌연변이 유발 물질에 대한 감수성 감소 여부를 테스트하였습니다.

HeC cells를 표시된 농도의 ribovirin으로 처리한 후, 감염 다중도(MOI) 0.01로 wild type Cox AKI virus B 3에 감염시켰으며, 감염 48시간 후에 자손 바이러스를 수확하여 TCID₅₀로 역가를 측정하였습니다. 여기에는 돌연변이 농도에 따른 wild type과 A 3 72 변이체의 역가가 나타나 있습니다. A 3 72 V는 일관되게 wild type보다 높은 역가를 보였습니다.

바이러스 생성의 단일 단계 성장 kinetics를 결정하기 위해 테스트한 모든 조건에서, 세포에 야생형, 고충실도 변이체 A372V 또는 복제 결핍 변이체 CX64 Cox AKI 바이러스 B3를 10의 감염 다중도로 감염시켰습니다. 표시된 시점에 세포 및 상층액에서 동결-해동법으로 후손 바이러스를 수확하고 TCID₅₀로 역가를 측정했습니다. A372V의 충실도 증가는 조직 배양에서 관찰 가능한 복제 결함과 일치하지 않았습니다. CX64 변이체는 복제 kinetics에서 상당한 지연을 보였으며, 야생형 바이러스보다 1,000배 낮은 최대 역가에 도달했습니다.

본 비디오에서 설명한 방법을 사용하면, 시퀀싱되는 각 클론은 전체 바이러스 집단 내의 고유한 게놈에서 유래하며 따라서 고유한 변이를 보유하게 됩니다. 이 그림은 저품질 시퀀스를 정제하고 단일 염기 다형성을 시각화한 후의 전형적인 정렬 상태를 보여줍니다. 집단 내의 전체 단일 염기 다형성을 산출하고, 각 클론에 나타나는 단일 염기 다형성의 수를 기록하였습니다.

예를 들어, 바(bar)로 밑줄이 그어진 클론은 두 개의 고유한 돌연변이를 포함하고 있는 반면, 다른 8개의 클론은 단일 고유 돌연변이를 포함하고 있습니다. 이 데이터는 여기에 표시된 표와 같은 표를 작성하는 데 사용됩니다. 이 표는 돌연변이 수에 따른 서열 분석된 클론의 순위 분포를 보여줍니다.

순위 값의 통계적 비교를 통해 한 분포가 다른 분포와 유의미하게 다른지 판단할 수 있습니다. 더 쉬운 해석을 위해, 서열 및 통계 분석에서 얻은 수치 데이터는 차트나 히스토그램으로 나타낼 수 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, A 3 72 V 바이러스는 야생형보다 돌연변이를 적게 생성하며, P 값이 0.01 미만으로 유의미하게 낮은 돌연변이 빈도를 보입니다.

동일한 닭 ganga 바이러스 집단은 바이러스 스톡을 사용하든 10⁵배 희석액을 사용하여 RNA를 추출하든 유사한 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 따라서 이 절차를 따라, 이 중합효소 변이체의 정확성에 대한 기전적 및 구조적 기초를 더 잘 이해하기 위해 인 비트로(in vitro) 생화학적 분석이나 결정화 연구를 수행할 수 있습니다.

이러한 발전 이후, 이 기술은 생물학 분야의 연구자들이 생체 내(in vivo)에서 유전적 다양성과 바이러스 적합성 사이의 상관관계를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, RNA 바이러스의 충실도 변이체(fidelity variants)를 분리할 가능성을 높이는 방법과 돌연변이 빈도를 이용하여 이러한 충실도 차이를 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.