Name: Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 배우세요 E18 랫 두피 뉴런 분리 및 마이크로플루이딕 장치 적재 방법을. 트립신 소화와 화염광택 피펫을 활용한 세포 분리 기술로 신경과학 연구의 정확한 실험 결과를 얻으세요.

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Compartmentalization에 대한 E18 태아 쥐 두피 뉴런 준비 밖으로 시작하기 전에, 그것은 37 ° C.에 필요한 모든 미디어 및 시약을 따뜻하게하는 것이 중요합니다 70 % 에탄올로 닦고으로 후드에 배치하는 세포 (예, 고무 전구, 튜브 랙, 미디어 병 등), 그 준비에 사용되는 모든 소독하는 것도 중요하다. <ol><li> 1 ML 얼음처럼 차가운 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼를 포함하는 15 ML 튜브에 넣어 E18 태아 쥐의 피질의 두 가지 (한 두뇌 이전 해부)를. </li><li> 2 ML 및 0.125 %로 최종 트립신 농도에 최종 볼륨을 가져, 해부 버퍼에있는 피질로 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML을 추가합니다. </li><li> 팔분에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 15 ML 튜브를 놓습니다. </li><li> 이 기간 동안, 화재 폴란드어 3 유리 파스퇴르 pipets은 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 연속 작은 구멍을 형성. </li><li> 피질의 8 분 부화 후 DMEM는 트립신 반응을 멈출 수 있도록 도와줘 피질 10 % FBS를 포함한 10 ML를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 2,500 rpm으로 피질과 DMEM/10 % FBS를 포함한 15 ML 튜브를 원심 분리기. </li><li> biosafety 캐비닛에서 진공 흡입 붙어있는 유리 파스퇴르 pipet을 사용하여 피질에서 뜨는을 제거하십시오. 방해 또는 펠렛을 이동시키다하지 않도록주의하십시오. </li><li> 피질 펠렛 부드럽게 pipet 위아래로 NMB 1 ML을 추가합니다. 이것은 공기 거품이 산화하여 세포를 손상시킬 수 있으므로, 아래 pipeting 및하면서 공기 방울을 만드는 피하기 위해 매우 중요합니다. </li><li> 끝까지 멸균 고무 벌브를 장착하고 5 번하고 아래로 pipeting하여 피질을 씹다 수있는 넓은 개방과 함께 불을 광택 파스퇴르 pipet을 사용하여 다시 신중하면 공기 방울을 소개하지 않습니다. 감소 오프닝 크기 각각 다른 두 유리 pipets이 과정을 계속합니다. </li><li> 분쇄 후 2 분 동안 2,500 rpm으로 다시 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 다시 뜨는을 제거하고 NBM 2 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 45 음 셀 스트레이너를 통해 resuspended 세포 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 계산하고, 장치에 로드된 Trypan 블루와 세포를 얼룩. 우리는 일반적으로 장치마다 세포의 20 UL을로드합니다. </li></ol> 참고 : 세포의 최종 농도는 일반적으로 2,500,000 세포 / ML 및 8,000,000 세포 / ML 사이 세포를 로딩 세포가 계산되고 나면, 그것은 장치에있는 세포를 로드할 시간 : <ol><li> 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 NBM를 포함하는 이전에 준비 장치를 가져와. </li><li> 진공 흡입하여 우물에서 여분의 미디어를 제거합니다. 그러나 미디어를 모두 제거하지 않도록주의 - 메인 채널의 일부 언론이 있어야합니다. </li><li> (그림 필요한 경우 참조) 장치의 상단 왼쪽 저수지로 세포의 20 UL을 적용합니다. 세포의 장치에 흐름과 PLL 처리 표면에 첨부합니다. </li><li> 로딩 후, 세포 부착 수 있도록 10 분 동안 인큐베이터에 다시 세포를 포함하는 장치를 놓으십시오. </li><li> 십분 후에 다시 인큐베이터 미디어과 장소 장비와 저수지를 입력합니다. </li></ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

세포 밀도가 응용 프로그램에 따라 다양한하실 수 있습니다. 그러나 밀도가 너무 낮아에서 기본 뉴런을 심는 것은 일반적으로 세포 사망에 이르게한다. 인큐베이터와 습도의 수준에 따라, 미디어 장치마다 2~3일 변화해야 할 수 있습니다. 미디어를 변경하면, 그것은 주요 채널에서 미디어를 제거하지 않는다는, 저수지에서 미디어를 제거한 후에 중요합니다. 더 나아가, 그것은 최고 우물에 신선한 미디어를 장소와 신선한 미디어의 모든 저수지를 작성하기 전에 장치를 통해 주요 채널로 흘러 수 있도록하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>NBM</td><td>배지</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Neural Basal Media는 Invitrogen의 Gibco 세포 배양 시약 라인을 통해 제공됩니다.</td></tr><tr><td>E18 쥐 배아</td><td>동물</td><td></td><td></td><td>임신한 Sprague Dawley Rat으로부터 얻습니다. 임신한 쥐를 희생시키고 E18 태아 쥐를 박리하여 E18 태아 쥐의 대뇌피질을 얻습니다.</td></tr><tr><td>CMFM 박리 버퍼 HBSS</td><td>버퍼</td><td></td><td></td><td>얼음처럼 차가운 칼슘 및 마그네슘이 제거된 HBSS 기반 박리 버퍼입니다.</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Fisher Scientific 카탈로그 번호 14-959-70C를 통해 구매 가능합니다</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#730;C 항온수조</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>유리 재질</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>배지</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>혈청, DMEM에 10% 농도로 사용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td><td>2500 rpm으로 설정</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td>생사 세포 수 측정용</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer 40 um</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon cat# 352340</td><td>Fisher Scientific을 통해 구매 가능합니다. Fisher 카탈로그 번호 08-771-1</td></tr><tr><td>B27</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27은 Invitrogen의 Gibco 세포 배양 시약 라인을 통해 제공되는 독점 보충제입니다.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax는 Invitrogen의 Gibco 세포 배양 시약 라인을 통해 제공됩니다.</td></tr></tbody></table>

microfluidic 장치에서 compartmentalization에 대한 e18 두피 랫 뉴런 준비

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

이 비디오에서는, 우리는 대뇌 피질 E18 쥐 뉴런의 준비를 보여줍니다. E18 피질 쥐의 뉴런는 이전에 다음 ID로 해부하고 준비 E18 태아 쥐의 대뇌 피질에서 얻을 수 있습니다. E18의 피질 개별 뉴런에 즉시 dissociated, 절개시입니다. 그것은 해리가 수행되기 전에 최대 일주일까지 4 B27를 포함하는 최대 절전 E 버퍼 ° C에서 E18 피질을 저장할 수 있습니다. 그러나, 세포 생존에 드롭있을 것입니다. 일반적으로 우리 E18 접속 신선한를 구하십시오. 그것은 차가운 얼음 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼 (CMFM)에있는 실험실로 이송됩니다. 도착하자마자, 트립신은 0.125 %의 최종 농도 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 팔분에 대해 37 ° C에서 incubated입니다. 10% FBS를 포함한 DMEM는 반응을 막기 위해 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 제거하고 신경 기저 미디어 2 ML (NBM)는 2퍼센트 B27 (권 / 권)와 Glutamax (권 / 권)이 다음과 위아래로 pipetting하여 다시 중단되는 피질에 추가됩니다 0.25 %를 포함합니다. 다음 피질은 연속된 작은 오프닝과 함께 이전에 화재 광택 유리 pipettes, 각 triturated 있습니다. triturating 후, 피질은 다시 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 그런 다음 제거 피질 펠렛은 B27와 Glutamax을 포함 NBM 2 ML로 다시 일시 중지되었습니다. 세포 현탁액은 다음 40 음 나일론 셀 스트레이너를 통해 전달됩니다. 다음 세포가 계산됩니다. 뉴런은 이제 신경 microfluidic 장치에 로딩을위한 준비가되어 있습니다.

이 비디오에서는 E18 두피 랫 뉴런의 준비를 보여줍니다.

Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비

이 영상에서는 E18 쥐 피질 뉴런의 준비 과정을 시연합니다. E18 쥐 피질 뉴런은 이전에 ...한 E18 쥐 태아의 피질에서 얻습니다.

안녕하세요, Newly John 박사의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 이전 영상에서 저희는 연구자가 뉴런의 세포체와 순수 축삭 분획을 분리할 수 있게 해주는 플랫폼인 뉴런 디바이스의 제작 방법을 시연하였습니다. 디바이스 제작에는 소프트 리소그래피 기술이 사용되며, 이는 포토리소그래피를 통해 미리 제작된 디바이스 설계가 포함된 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS를 캐스팅하고 경화시키는 과정으로 구성됩니다.본 영상에서는 spro dolly E 18 피질 쥐 뉴런의 준비 과정과 뉴런 장치에 뉴런을 로딩하는 방법을 시연하겠습니다. 오늘 시연을 진행할 Kiana Lee를 소개합니다.실험을 시작하기 전, 필요한 모든 배지와 시약을 항온 수조에서 37 °C로 데워두는 것이 중요합니다. 여기에는 Neurobasal 배지, 0.25% trypsin 및 10% FBS가 포함된 DMEM이 있습니다. 세포 배양을 위해 후드 내에 배치하는 모든 물품은 반드시 멸균 처리하고 70% ethanol로 닦아내어야 합니다.먼저, 조직 배양 후드를 70% ethanol로 닦아냅니다. 다음으로, 튜브 고정용 플라스틱 랙에 ethanol을 분무합니다. 이어서, 3분할 도말 과정에 사용되는 고무 볼을 ethanol로 세척합니다.충분히 건조될 수 있도록 이 과정을 조기에 수행하는 것이 중요합니다. 다음으로, 필요한 시약들을 에탄올로 닦아내고 후드로 옮깁니다. 이전에 해부한 뇌 하나를 대표하는 E 18 태아 쥐 피질 조각 두 개를 1 ml의 차가운 칼슘 및 마그네슘 제거 해부 완충액이 들어 있는 15 ml 튜브에 넣습니다. 해부 완충액이 들어 있는 피질에 0.25% trypsin EDTA 1 ml를 추가하여 최종 부피를 2 ml로, 최종 trypsin 농도를 0.125%로 맞춥니다. trypsin이 추가된 피질이 담긴 15 ml 튜브를 37 °C 항온수조에 8분 동안 넣어 태아 피질을 37 °C에서 trypsin으로 처리하며 배양합니다.3개의 페이스트 피펫을 화염 연마합니다. 유리 피펫의 끝부분을 불꽃의 푸른 부분 근처에 살짝 접촉시키고, 개구부가 주황색으로 변할 때까지 천천히 회전시킵니다. 주황색으로 변했을 때.유리 피펫이 찌그러지지 않도록 계속해서 회전시키는 것이 중요합니다. 유리 피펫의 개구부 크기가 점차 작아진다는 점에 유의하십시오. 또한, 개구부를 너무 작게 만들지 않는 것이 중요한데, 이는 37°C에서 트립신과 함께 8분 동안 배양한 후 세포 용해를 유발할 수 있기 때문입니다. 트립신 반응을 중단시키기 위해 10% FBS가 포함된 DMEM 10 mL를 피질에 첨가합니다.피질과 10% FBS가 포함된 DMEM이 들어 있는 15 ml 튜브를 2, 500 RPM에서 2분 동안 원심분리합니다. 생물안전작업대 내에서 유리 피펫에 연결된 진공 흡입기를 사용하여 피질 위의 상층액을 제거합니다. 이때 펠렛이 흐트러지거나 떨어지지 않도록 주의하십시오.B 27 및 글루타메이트가 함유된 신경 기저 배지 1 ml를 피질 펠렛에 추가하고 파이펫으로 조심스럽게 상하로 섞어줍니다. 상하로 파이펫팅할 때 기포가 생기지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 이는 기포가 산화 작용을 통해 세포를 손상시킬 수 있기 때문입니다. 다음으로, 멸균된 고무 벌브를 파이펫 끝에 부착한 후, 입구가 가장 넓은 화염 연마된 후방 파이펫을 사용하여 피질을 약 5회 정도 상하로 파이펫팅하여 분쇄합니다.공기 방울이 유입되지 않도록 주의하십시오. 좋습니다. 개구부 크기가 각각 더 작은 나머지 두 개의 유리 피펫에 대해서도 동일한 과정을 진행하였습니다. 앞서 언급했듯이, 삼중 선조(tri-striation) 과정 중에 기포가 유입되지 않도록 하는 것이 중요합니다.더 이상 눈에 보이는 덩어리가 보이지 않는다는 점을 확인해야 합니다. 배지에서 피질의 덩어리가 더 이상 보이지 않을 때까지 trituration을 계속하는 것이 중요합니다. 처리 후, 세포를 다시 2,500 RPM에서 2분 동안 원심 분리합니다.이는 피질 조각 두 개에서 예상되는 펠릿의 대략적인 크기입니다. 원심분리 후, 세포 펠릿에서 상층액을 다시 제거합니다. 상층액을 제거한 후, B 27과 glutamate가 포함된 neurobasal 배지 1 ml를 피질에 첨가하여 피질을 재현탁하는 데 사용합니다.기포가 생기지 않도록 주의하며 세포 펠릿을 다시 한번 피펫팅하여 세포 펠릿이 고르게 분산되고 풀리도록 합니다. 세포 현탁액에 neuro basal media 1 mL를 더 추가하여 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다. 그다음, 재현탁된 세포 용액을 BD biosciences 40 µm 세포 스트레이너로 여과하여 세포 수를 측정하고 생존율을 평가합니다.멸균된 마이크로 원심분리 튜브에 신선한 neural basal media 60 µL를 넣습니다. 그다지 60 µL의 neuro basal media가 담긴 튜브에 세포 20 µL를 추가하고, 마지막으로 neuro basal media 내의 세포에 trypan blue 20 µL를 추가합니다. trypan blue로 세포를 염색하고 나면, 더 이상 살아있지 않은 세포들이 염색됩니다.헤모사이토미터(hemo cytometer)에 20 µL를 피펫팅하고 현미경으로 관찰합니다. 생존 세포는 투명하고 반투명하게 보이며, 세포막이 손상된 세포는 트라이판 블루(trian blue)로 인해 파랗게 염색됩니다. 일반적으로 피질 하나당 약 250만 개에서 800만 개의 세포를 얻습니다.일반적으로 뇌 하나에서 두 조각의 피질을 얻어 최종 부피 2 mL로 세포를 재현탁합니다. 따라서 세포의 최종 농도는 보통 mL당 2.5 million cells에서 8 million cells 사이입니다. 통상적으로 장치당 약 20 µL의 세포를 로딩합니다.이를 통해 장치당 50,000개에서 160,000개 사이의 세포 범위를 얻을 수 있습니다. 세포 밀도는 응용 분야에 따라 다양하게 조정할 수 있습니다. 하지만 일차 신경세포를 너무 낮은 밀도로 파종하면 일반적으로 세포 사멸로 이어집니다. 멸균 상태를 유지하기 위해 신경 기저 배지가 포함되어 미리 준비된 장치들을 생물안전 작업대로 가져옵니다.진공 섹션을 사용하여 웰의 과잉 배지를 제거합니다. 이때 모든 배지가 제거되지 않도록 주의해야 합니다. 메인 채널에는 배지가 어느 정도 남아 있어야 하며, 리저버의 배지만 흡입하십시오.장치의 왼쪽 상단 리저버에 20 µL의 세포를 주입합니다. 세포는 장치 내부로 흘러 들어가 PLL 처리된 표면에 부착됩니다. 여기서는 세포가 메인 채널을 통해 아래로 흘러가는 모습을 볼 수 있으며, 일부 세포가 실제로 유리에 부착되기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다.로딩 후, 세포가 포함된 장치들을 약 10분 동안 배양기에 다시 넣어 세포가 부착되도록 합니다. 배양기에서 10분이 지난 후, 장치들을 다시 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 리저버(reservoir)에 배지를 채운 다음, 장치들을 다시 배양기에 넣습니다. 배양기와 배지에 필요한 습도 수준에 따라, 장치 내의 배지를 2~3일마다 교체해야 할 수도 있다는 점에 유의하십시오.상단 웰에 신선한 배지를 넣고, 모든 저장조를 채우기 전에 일부 신선한 배지가 장치를 통해 메인 채널로 흐르게 하는 것이 좋습니다. 여기서는 살아있는 세포를 염색하는 세포 투과성 염료인 calcium am을 사용하여 뉴런을 시각화하였습니다. 여기서 세포체, 축삭 및 수지상 돌기가 포함된 장치의 soma 구획 또는 세포 측면을 확인할 수 있습니다.장치를 훑어보면, 축삭이 장치의 반대편인 축삭 측으로 도달하기 위해 성장하는 마이크로 홈을 볼 수 있으며, 이 구역에는 순수 축삭 분획이 포함되어 있습니다. 시연을 위해, 이 형광 표지된 세포들이 축삭 절단(axotomy) 과정을 설명하는 데 사용될 것입니다.뉴런 장치의 특성 중 하나는 연구자가 장치의 순수 축삭 분획에서 축삭을 절단하는 axotomy를 수행할 수 있다는 점입니다. 이는 축삭 재생 연구와 같은 조사를 수행하기 위해 필요합니다. 이제 Keano가 뉴런 장치에서 axotomy를 수행하는 방법을 시연하겠습니다. axotomy는 진공 장치를 이용하여 수행됩니다.멸균된 유리 피펫을 액슨(axonal) 쪽의 웰 하단 개구부에 배치하고, 진공 장치를 이용해 배지를 흡입하여 제거합니다. 메인 채널 내의 배지를 포함하여 장치의 액슨 쪽에서 모든 배지를 완전히 제거합니다. 배지 제거 후 이 과정을 반복하려면, 피펫 팁을 메인 채널의 개구부에 배치하고 피펫을 강하게 눌러 150 µL의 배지를 메인 채널 안으로 강제로 주입합니다.다음으로, 메인 채널의 입구와 장치의 축삭측 상단 웰에 진공을 적용합니다. 다시 한번 진공을 이용하여 메인 채널을 포함한 축삭측의 모든 배지를 제거합니다. 그 다음, 피펫 팁을 메인 채널 입구에 대고 강하게 눌러 150 µL의 배지를 메인 채널 내부로 강제로 주입합니다.이 시점에서 연구자는 현미경으로 장치를 관찰하여 축삭 절단의 효율성을 확인할 수 있습니다. 축삭이 충분히 절단되지 않은 경우, 필요에 따라 이 과정을 다시 반복할 수 있습니다. 본 영상에서는 E 18 태아 래트 피질 뉴런을 준비하고 이를 뉴런 장치에 로딩하는 방법을 보여드렸습니다.이 장치들의 주요 장점은 장치의 한쪽에 있는 뉴런 세포체의 배양과 반대쪽의 순수 축삭 분획을 분리하여 구획화할 수 있다는 점입니다. 이 영상이 유익하고 도움이 되었기를 바랍니다. 이것으로 John Lab의 설명을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다.

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연구

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생물학

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신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

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Differentiation of Neural Stem Cells to Neurons Using a Compartmentalized Microfluidic Device

출처: Struzyna, LA 외, 신경계 재건, 변조 및 모델링을 위한 해부학적으로 영감을 받은 3차원 미세 조직 공학 신경망. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 세포외 기질 코어가 있는 하이드로겔 마이크로 컬럼을 사용하여 미세 조직 공학 신경망의 개발을 보여줍니다. 시드된 신경 응집체는 부착하고, 투영을 확장하며, 구조화된 신경망을 형성하여 신경 발달 및 신경치료 연구의 발전에 기여합니다.

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사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

본 프로토콜은 미세유체 챔버에서 뉴런 미토콘드리아의 파종 및 염색을 기술한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 축삭에서 미토콘드리아를 선택적으로 처리하여 세포체 구획에 영향을 미치지 않고 약리학적 문제에 대응하여 특성을 분석할 수 있도록 합니다.

축삭 미토콘드리아의 미세 유체 보조 선택적 탈분극

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축삭 손상 모델 구성 및 다중 오믹스 분석 가능을 위한 미세유체 칩

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Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비

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