Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비

안녕하세요, Newly John 박사의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 이전 영상에서 저희는 연구자가 뉴런의 세포체와 순수 축삭 분획을 분리할 수 있게 해주는 플랫폼인 뉴런 디바이스의 제작 방법을 시연하였습니다. 디바이스 제작에는 소프트 리소그래피 기술이 사용되며, 이는 포토리소그래피를 통해 미리 제작된 디바이스 설계가 포함된 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS를 캐스팅하고 경화시키는 과정으로 구성됩니다.

본 영상에서는 spro dolly E 18 피질 쥐 뉴런의 준비 과정과 뉴런 장치에 뉴런을 로딩하는 방법을 시연하겠습니다. 오늘 시연을 진행할 Kiana Lee를 소개합니다.

실험을 시작하기 전, 필요한 모든 배지와 시약을 항온 수조에서 37 °C로 데워두는 것이 중요합니다. 여기에는 Neurobasal 배지, 0.25% trypsin 및 10% FBS가 포함된 DMEM이 있습니다. 세포 배양을 위해 후드 내에 배치하는 모든 물품은 반드시 멸균 처리하고 70% ethanol로 닦아내어야 합니다.

먼저, 조직 배양 후드를 70% ethanol로 닦아냅니다. 다음으로, 튜브 고정용 플라스틱 랙에 ethanol을 분무합니다. 이어서, 3분할 도말 과정에 사용되는 고무 볼을 ethanol로 세척합니다.

충분히 건조될 수 있도록 이 과정을 조기에 수행하는 것이 중요합니다. 다음으로, 필요한 시약들을 에탄올로 닦아내고 후드로 옮깁니다. 이전에 해부한 뇌 하나를 대표하는 E 18 태아 쥐 피질 조각 두 개를 1 ml의 차가운 칼슘 및 마그네슘 제거 해부 완충액이 들어 있는 15 ml 튜브에 넣습니다. 해부 완충액이 들어 있는 피질에 0.25% trypsin EDTA 1 ml를 추가하여 최종 부피를 2 ml로, 최종 trypsin 농도를 0.125%로 맞춥니다. trypsin이 추가된 피질이 담긴 15 ml 튜브를 37 °C 항온수조에 8분 동안 넣어 태아 피질을 37 °C에서 trypsin으로 처리하며 배양합니다.

3개의 페이스트 피펫을 화염 연마합니다. 유리 피펫의 끝부분을 불꽃의 푸른 부분 근처에 살짝 접촉시키고, 개구부가 주황색으로 변할 때까지 천천히 회전시킵니다. 주황색으로 변했을 때.

유리 피펫이 찌그러지지 않도록 계속해서 회전시키는 것이 중요합니다. 유리 피펫의 개구부 크기가 점차 작아진다는 점에 유의하십시오. 또한, 개구부를 너무 작게 만들지 않는 것이 중요한데, 이는 37°C에서 트립신과 함께 8분 동안 배양한 후 세포 용해를 유발할 수 있기 때문입니다. 트립신 반응을 중단시키기 위해 10% FBS가 포함된 DMEM 10 mL를 피질에 첨가합니다.

피질과 10% FBS가 포함된 DMEM이 들어 있는 15 ml 튜브를 2, 500 RPM에서 2분 동안 원심분리합니다. 생물안전작업대 내에서 유리 피펫에 연결된 진공 흡입기를 사용하여 피질 위의 상층액을 제거합니다. 이때 펠렛이 흐트러지거나 떨어지지 않도록 주의하십시오.

B 27 및 글루타메이트가 함유된 신경 기저 배지 1 ml를 피질 펠렛에 추가하고 파이펫으로 조심스럽게 상하로 섞어줍니다. 상하로 파이펫팅할 때 기포가 생기지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 이는 기포가 산화 작용을 통해 세포를 손상시킬 수 있기 때문입니다. 다음으로, 멸균된 고무 벌브를 파이펫 끝에 부착한 후, 입구가 가장 넓은 화염 연마된 후방 파이펫을 사용하여 피질을 약 5회 정도 상하로 파이펫팅하여 분쇄합니다.

공기 방울이 유입되지 않도록 주의하십시오. 좋습니다. 개구부 크기가 각각 더 작은 나머지 두 개의 유리 피펫에 대해서도 동일한 과정을 진행하였습니다. 앞서 언급했듯이, 삼중 선조(tri-striation) 과정 중에 기포가 유입되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

더 이상 눈에 보이는 덩어리가 보이지 않는다는 점을 확인해야 합니다. 배지에서 피질의 덩어리가 더 이상 보이지 않을 때까지 trituration을 계속하는 것이 중요합니다. 처리 후, 세포를 다시 2,500 RPM에서 2분 동안 원심 분리합니다.

이는 피질 조각 두 개에서 예상되는 펠릿의 대략적인 크기입니다. 원심분리 후, 세포 펠릿에서 상층액을 다시 제거합니다. 상층액을 제거한 후, B 27과 glutamate가 포함된 neurobasal 배지 1 ml를 피질에 첨가하여 피질을 재현탁하는 데 사용합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하며 세포 펠릿을 다시 한번 피펫팅하여 세포 펠릿이 고르게 분산되고 풀리도록 합니다. 세포 현탁액에 neuro basal media 1 mL를 더 추가하여 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다. 그다음, 재현탁된 세포 용액을 BD biosciences 40 µm 세포 스트레이너로 여과하여 세포 수를 측정하고 생존율을 평가합니다.

멸균된 마이크로 원심분리 튜브에 신선한 neural basal media 60 µL를 넣습니다. 그다지 60 µL의 neuro basal media가 담긴 튜브에 세포 20 µL를 추가하고, 마지막으로 neuro basal media 내의 세포에 trypan blue 20 µL를 추가합니다. trypan blue로 세포를 염색하고 나면, 더 이상 살아있지 않은 세포들이 염색됩니다.

헤모사이토미터(hemo cytometer)에 20 µL를 피펫팅하고 현미경으로 관찰합니다. 생존 세포는 투명하고 반투명하게 보이며, 세포막이 손상된 세포는 트라이판 블루(trian blue)로 인해 파랗게 염색됩니다. 일반적으로 피질 하나당 약 250만 개에서 800만 개의 세포를 얻습니다.

일반적으로 뇌 하나에서 두 조각의 피질을 얻어 최종 부피 2 mL로 세포를 재현탁합니다. 따라서 세포의 최종 농도는 보통 mL당 2.5 million cells에서 8 million cells 사이입니다. 통상적으로 장치당 약 20 µL의 세포를 로딩합니다.

이를 통해 장치당 50,000개에서 160,000개 사이의 세포 범위를 얻을 수 있습니다. 세포 밀도는 응용 분야에 따라 다양하게 조정할 수 있습니다. 하지만 일차 신경세포를 너무 낮은 밀도로 파종하면 일반적으로 세포 사멸로 이어집니다. 멸균 상태를 유지하기 위해 신경 기저 배지가 포함되어 미리 준비된 장치들을 생물안전 작업대로 가져옵니다.

진공 섹션을 사용하여 웰의 과잉 배지를 제거합니다. 이때 모든 배지가 제거되지 않도록 주의해야 합니다. 메인 채널에는 배지가 어느 정도 남아 있어야 하며, 리저버의 배지만 흡입하십시오.

장치의 왼쪽 상단 리저버에 20 µL의 세포를 주입합니다. 세포는 장치 내부로 흘러 들어가 PLL 처리된 표면에 부착됩니다. 여기서는 세포가 메인 채널을 통해 아래로 흘러가는 모습을 볼 수 있으며, 일부 세포가 실제로 유리에 부착되기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다.

로딩 후, 세포가 포함된 장치들을 약 10분 동안 배양기에 다시 넣어 세포가 부착되도록 합니다. 배양기에서 10분이 지난 후, 장치들을 다시 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 리저버(reservoir)에 배지를 채운 다음, 장치들을 다시 배양기에 넣습니다. 배양기와 배지에 필요한 습도 수준에 따라, 장치 내의 배지를 2~3일마다 교체해야 할 수도 있다는 점에 유의하십시오.

상단 웰에 신선한 배지를 넣고, 모든 저장조를 채우기 전에 일부 신선한 배지가 장치를 통해 메인 채널로 흐르게 하는 것이 좋습니다. 여기서는 살아있는 세포를 염색하는 세포 투과성 염료인 calcium am을 사용하여 뉴런을 시각화하였습니다. 여기서 세포체, 축삭 및 수지상 돌기가 포함된 장치의 soma 구획 또는 세포 측면을 확인할 수 있습니다.

장치를 훑어보면, 축삭이 장치의 반대편인 축삭 측으로 도달하기 위해 성장하는 마이크로 홈을 볼 수 있으며, 이 구역에는 순수 축삭 분획이 포함되어 있습니다. 시연을 위해, 이 형광 표지된 세포들이 축삭 절단(axotomy) 과정을 설명하는 데 사용될 것입니다.

뉴런 장치의 특성 중 하나는 연구자가 장치의 순수 축삭 분획에서 축삭을 절단하는 axotomy를 수행할 수 있다는 점입니다. 이는 축삭 재생 연구와 같은 조사를 수행하기 위해 필요합니다. 이제 Keano가 뉴런 장치에서 axotomy를 수행하는 방법을 시연하겠습니다. axotomy는 진공 장치를 이용하여 수행됩니다.

멸균된 유리 피펫을 액슨(axonal) 쪽의 웰 하단 개구부에 배치하고, 진공 장치를 이용해 배지를 흡입하여 제거합니다. 메인 채널 내의 배지를 포함하여 장치의 액슨 쪽에서 모든 배지를 완전히 제거합니다. 배지 제거 후 이 과정을 반복하려면, 피펫 팁을 메인 채널의 개구부에 배치하고 피펫을 강하게 눌러 150 µL의 배지를 메인 채널 안으로 강제로 주입합니다.

다음으로, 메인 채널의 입구와 장치의 축삭측 상단 웰에 진공을 적용합니다. 다시 한번 진공을 이용하여 메인 채널을 포함한 축삭측의 모든 배지를 제거합니다. 그 다음, 피펫 팁을 메인 채널 입구에 대고 강하게 눌러 150 µL의 배지를 메인 채널 내부로 강제로 주입합니다.

이 시점에서 연구자는 현미경으로 장치를 관찰하여 축삭 절단의 효율성을 확인할 수 있습니다. 축삭이 충분히 절단되지 않은 경우, 필요에 따라 이 과정을 다시 반복할 수 있습니다. 본 영상에서는 E 18 태아 래트 피질 뉴런을 준비하고 이를 뉴런 장치에 로딩하는 방법을 보여드렸습니다.

이 장치들의 주요 장점은 장치의 한쪽에 있는 뉴런 세포체의 배양과 반대쪽의 순수 축삭 분획을 분리하여 구획화할 수 있다는 점입니다. 이 영상이 유익하고 도움이 되었기를 바랍니다. 이것으로 John Lab의 설명을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다.