Murine Pancreatic Draining Lymph Nodes에서 조절 T 세포 subsets 확인

조절 T 세포 또는 Treg는 면역 체계 항상성을 매개하기 위해 면역억제 효과를 발휘하는 특수한 T 세포 하위 집단입니다. Treg는 세포 표면 마커 CD4, CD25 및 Neuropilin 1, Nrp1 및 핵 전사 인자 포크헤드 박스 P3, Foxp3 및 Helios를 발현합니다.

마우스 췌장 배액 림프절 또는 PDLN에서 Treg를 분리하려면 원추형 튜브 위에 금속 메쉬를 놓습니다. PDLN을 메쉬 위에 놓고 조직을 분쇄하여 기계적으로 해리시킵니다. 메쉬 위에 적절한 배지를 추가하여 세포를 튜브로 세척합니다.

원

심분리기, 죽은 세포와 세포 파편을 제거합니다. 활기 세포를 배지에 재현탁합니다. 둥근 바닥 튜브에 장착된 세포 스트레이너 캡을 통해 세포를 통과시켜 균질한 단일 세포 현탁액을 얻어 남아 있는 세포 덩어리를 제거합니다.

형광색소 접합 항-CD4, 항-CD25 및 항-Nrp1 항체를 추가합니다. 항-CD4 및 항-CD25 항체는 Treg의 각각의 세포 표면 항원에 결합합니다. 동시에 항-Nrp1은 Nrp1 수용체에 결합합니다.

적절한 투과화 고정 완충액으로 세포를 처리하여 세포를 고정하고 세포막과 핵막을 투과화합니다. Foxp3 및 Helios를 표적으로 하는 형광색소 접합 항체를 추가합니다.

투과화된 막은 항체가 세포에 들어가 각각의 핵내 표적에 결합할 수 있도록 합니다. 유세포 분석을 사용하여 세포를 분석합니다.

Treg는 핵 전사 인자 Foxp3 및 Helios와 함께 CD4, CD25 및 Nrp1의 양성 세포 표면 발현을 특징으로 합니다.

먼저 15밀리리터 원뿔형 튜브를 랙에 넣습니다. 멸균 250마이크로미터 금속 메쉬를 튜브 위에 놓습니다. 1밀리리터의 RPMI로 메쉬를 헹굽니다. 그런 다음 림프절을 금속 메쉬로 옮기고 핀셋을 사용하여 메쉬를 통해 갈아줍니다. 메쉬에 RPMI 1밀리리터를 도포하여 세포를 튜브로 세척합니다. 각 샘플에 대해 림프절을 옮기고 분쇄하는 이 과정을 세 번 반복한 다음 메쉬를 제거합니다.

튜브를 섭씨 433 x g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 약 5밀리리터의 RPMI에 재현탁한 다음 튜브를 RPMI로 채웁니다. 샘플을 원심분리하는 것부터 튜브에 RPMI를 채우는 것까지 이 과정을 한 번 반복합니다.

튜브를 433 x g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 2밀리리터의 RPMI에 재현탁합