사람의 체외에서 억제

이 절차의 전반적인 목표는 체외 인간 억제 분석법을 사용하여 treg 기능을 측정하고, 잠재적인 향후 기능 상실을 예측하는 것입니다. 이는 먼저 세포 자극제로 사용될 코딩 비드를 준비하고 테스트함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 순수한 naive CD4+ CD25- T 세포, 체내 활성화된 CD4+ CD25low T 세포, 그리고 조절 CD4+ CD25high T 세포를 분리하는 것이며, 항원 제시 세포(APC)로 사용하기 위해 조사된 PP BMC를 준비하는 것입니다.

다음으로, 반응 세포로서 naive 또는 활성화된 T-세포를 사용하고 P BMC를 APC로 사용하는 단일 배양 또는 동일한 조건에서 treg를 1:10 비율로 추가한 공동 배양을 설정합니다. 마지막 단계로 세포를 회수하고 tritium 표지 thymidine의 통합 정도를 통해 세포 증식을 측정합니다. 최종적으로 얻은 결과는 naive T-세포 반응과 in vivo에서 활성화된 T-세포 반응의 억제 차이를 입증할 수 있습니다.

제 이름은 Jeff Woodcliff입니다. 조절 T 세포는 고유한 세포 표면 마커를 발현하지 않습니다. 따라서 이들의 기능을 신뢰성 있게 측정하기 위해서는 최적의 분리 효율을 제공하는 기술을 사용하여 세포를 분리해야 합니다.

다른 분리 방법인 max isolation보다 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting)를 사용하는 주요 장점은 FACS를 통해 매우 순수한 세포 집단을 얻을 수 있다는 점입니다. 이렇게 얻은 세포의 기능은 여기서 입증한 바와 같이 in vitro 억제 분석(suppression assays)을 통해 신뢰성 있게 테스트할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 건강한 피험자와 제1형 당뇨병 관련 피험자의 Treg 기능을 파악하는 데 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이는 인간 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 기타 다른 자가면역 질환에도 적용될 수 있습니다. anti-human CD3로 taa 활성 비드를 코팅합니다.

원래 바이알에서 M four 50 toil 활성 비즈 1 mL를 1.5 mL 튜브에 넣고, 모든 비즈가 튜브 벽면에 부착될 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 둡니다. 그 후, 튜브를 마그네틱 스탠드에 둔 상태에서 피펫으로 비즈 버퍼를 제거합니다. 이어서 튜브를 마그네틱 스탠드에서 꺼내고 버퍼 1 1 mL를 추가합니다.

튜브를 자석 스탠드에 반복해서 놓습니다. 튜브가 자석 스탠드에 있는 동안 버퍼를 제거합니다. 다시 1 mL의 버퍼 1로 비드를 재부유시킵니다.

이번에는 anti-human CD3 40 µL를 함께 추가합니다. 비드와 항체를 37 °C에서 15분 동안 교반합니다. 그 후 0.1% w/v BSA를 첨가하고 다음 16시간 동안 계속해서 교반합니다.

다음으로, 1 mL의 buffer two에 비즈를 넣고 2~8°C에서 5분 동안 배양한 후, 튜브를 마그네틱 스탠드에 둔 상태에서 버퍼를 제거하여 비즈를 두 번 세척합니다. 그런 다음 동일한 멸균 조건에서 비즈를 한 번 더 세척합니다.

이번에는 1 mL의 buffer three를 사용하여, 최적의 비율을 결정하기 위해 세포당 CD three 코팅 비드의 수를 달리하여 추가함으로써 항체 코팅 효율을 테스트하고, 96-well 플레이트의 각 웰에 50,000~5,000 PBMC를 3반복으로 분주합니다. 37 °C에서 72시간 동안 배양한 후, 1 µCi의 tritiated thymidine을 첨가하고 이후 16시간 동안 계속 배양합니다. 멀티스크린 수확 플레이트 또는 이와 유사한 플레이트에 세포를 수확합니다.

신틸레이션 액을 첨가하고 웰당 분당 계수 또는 CPM을 측정합니다. TopCount NXT 신틸레이션 카운터 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 비드 대 세포 비율을 결정하며, 본 실험진의 경험상 CPM이 지속적으로 5,000 초과 15,000 미만으로 나타나는 비율을 선택합니다. 테스트한 모든 인간 피험자에서 세포당 비드 3개의 비율이 반응 세포와 Treg 세포 모두에 최적의 자극을 주는 것으로 나타났습니다.

50 mL 원뿔형 튜브에 15 mL의 fal plus를 채웁니다. 그다음, 혈액이 담긴 튜브에 250 mL의 PBS를 첨가하여 50 mL의 buffy coat를 1:6로 희석합니다. 층이 섞이지 않도록 주의하며, 희석된 buffy coat 25 mL를 fial pack 위에 천천히 층을 이루어 쌓습니다.

4°C에서 800 ×g로 30분간 원심분리합니다. 브레이크 기능을 끈 상태에서 피콜(fial)과 버퍼 사이의 흰색 중간층인 PBMC 층을 조심스럽게 수집합니다. 필요한 경우, 튜브 벽면의 세포를 스크레이퍼로 긁어 모읍니다.

몇 분간 기다린 후 중간상에서 세포를 다시 수집하십시오. 세포를 새 50 milliliter 튜브로 옮기고, 튜브에 PBS를 채워 세척한 뒤 원심분리하여 펠렛(pellet)을 만듭니다. PBM cs.

세척 단계를 매회 2번씩 반복합니다. 두 개의 세포 펠렛을 하나의 튜브에 합치고, 최종적으로 모든 세포 펠렛을 하나의 50 milliliter 튜브에 합칩니다. 그런 다음 현탁된 세포 20 microliters를 사용하여 트라이판 블루 배제법으로 세포 생존율을 측정합니다.

생존 가능한 pbmc 1 mL를 새 튜브로 옮겨 테스트용 APC를 생성합니다. 그 다음 배지 4 mL를 추가하고 세포에 5,000 rads를 조사하며, 나머지 PBMC가 담긴 튜브의 상단을 PBS 버퍼로 채웁니다. 이후 4 °C에서 250 ×g로 10분간 원심분리한 뒤, 상층액을 따라내고 동일한 혼합액 4 mL에 세포를 재현탁합니다.

그다음 PBMC에 max anti CD4 microbeads 200 µL를 첨가하고, 세포와 비드 혼합물을 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 40 mL의 PBS 버퍼로 세포를 세척한 다음 세포를 펠렛화합니다. 이어서 상층액을 따라내고 상온에서 8 mL의 Degas PBS 버퍼로 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 분리 필터를 사용하여 세포 현탁액을 여과 분리합니다. 그런 다음 PBM CS를 두 개의 15 milliliter 튜브에 나눕니다. 각 튜브에 P BMCs 4 milliliter를 첨가합니다.

두 개의 컬럼을 미니맥스 분리기에 고정하고 각 컬럼 아래에 수집 튜브를 배치합니다. 그런 다음 각 컬럼에 3 mL의 DGAs PBS 버퍼를 첨가합니다. 버퍼가 모두 소진되면 각 튜브에 담긴 4 mL의 세포 용액 전체를 세포 현탁액이 완전히 빠져나가기 전에 컬럼 위에 층을 이루도록 가합니다. 각 컬럼에 실온의 DGAs PBS 버퍼 3 mL를 첨가하고 버퍼가 수집 튜브로 흘러 내려가게 합니다.

투명하게 나올 때까지 버퍼를 더 추가합니다. DGAs 버퍼 5 mL를 LS 컬럼에 더 분주한 다음, minimax 분리기에서 LS 컬럼을 제거합니다. 컬럼을 새로운 멸균 50 mL 수집 튜브에 넣습니다.

0.5 mL를 흘려보낸 다음, 나머지 부피인 약 4 mL를 천천히 밀어내십시오. 이제 CD4 양성 분획 두 개를 합칩니다. 그다음 튜브에 PBS를 최대 50 mL까지 추가하고, 4 °C에서 400 ×g로 10분 동안 원심분리한 후 세포 수를 측정하십시오.

세포를 2 mL의 PBS 버퍼에 재현탁합니다. 항-CD 14, CD 32, CD 16 및 선택적으로 항-CD 4를 포함하여 염색에 사용할 항체들을 하나의 튜브에 혼합합니다. 형광색소 마이너스(FLUOROCHROME minus) 튜브의 염색을 위해 이 혼합액의 일부를 취합니다.

튜브의 밀리리터 세포 현탁액 중 5 µL를 FACS 튜브로 옮겨 FMO 튜브를 준비하고, 미리 준비한 항체 칵테일 2 µL로 세포를 염색합니다. 다음으로, 세포 분리를 위한 보정 대조군(compensation controls)으로 사용하기 위해, 염색되지 않은 세포와 마우스 IgG가 코팅된 비드를 새로운 개별 FACS 튜브에 넣고 단일 형광색소로 염색합니다. 그런 다음 칵테일에 anti-human CD 25 PE 50 µL를 추가하고, 이 칵테일을 나머지 세포 현탁액에 첨가합니다.

튜브를 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 항체 칵테일로 세포를 배양한 후, 세포에 PBS 완충액을 추가하고 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 펠릿을 10⁷ cells/mL 농도의 PBS 완충액에 부유시킵니다.

FMO 튜브를 사용하여 CD 25 양성 T 세포 분리를 위한 임계값을 설정하십시오. 이 게이팅 전략을 사용하여, 먼저 이 그림에 표시된 것처럼 단핵구, 대식세포 및 기타 모든 CD 4 양성 비 T 세포로 구성된 FITC 양성 세포를 제외하기 위해 FITC 음성 세포 주변에 게이트를 설정하십시오. 별도의 플롯에서, 이 그림과 같이 CD 25 음성 및 CD 25 low T 세포와 CD 25 high treg 세포를 위한 게이트를 그리십시오.

유세포 분석 및 세포 하위 집단 분류 후, 수집 튜브를 원심 분리하여 펠렛을 만들고 플레이팅 전까지 T-세포를 얼음 위에 보관하십시오. 표에 표시된 대로 U-bottom 96-well 플레이트에 라벨을 붙입니다. 96-well 플레이트의 각 웰에 반응 세포당 3개의 비드 농도가 되도록 계산된 CD3 코팅 비드 50 µL 분량을 10% pooled human AB serum이 포함된 완전 배지에 현탁한 후, 이전에 방사선을 조사한 APC를 배지로 희석하여 5 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춥니다.

96-웰 플레이트에 세포 50 µL를 분주한 다음, 웰당 2.5 × 10⁴개의 CD4⁺ CD25⁻ 또는 CD4⁺ CD25ˡᵒ T세포를 3반복으로 첨가합니다. 여기에 표시된 대로, B행과 'tregs only'로 표시된 웰에 Tregs를 1:10 비율로 공동 배양하여 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 5% CO₂와 포화 습도가 유지되는 37 °C 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다. 다음으로, 세포에 1 µCi의 tritium-labeled thymidine을 처리하고, 공동 배양 마지막 몇 시간 동안 thymidine이 세포 내로 통합되도록 37 °C에서 16시간 동안 추가로 배양합니다.

필터 메이트 하베스터(filter mate harvester)를 사용하여 멀티 스크린 수확 플레이트의 세포를 수확합니다. 그 다음, 미리 신틸레이션 용액(scintillation fluid)을 채워둔 투명 플라스틱 커버로 수확 플레이트를 덮습니다. 마지막으로 웰당 CPM을 측정합니다.

신틸레이션 카운터를 사용하여 이 시스템으로 다음과 같은 일련의 도트 플롯에서 볼 수 있듯이 T세포 하위 집단을 높은 순도로 분리할 수 있습니다. 여기 하단 게이트에는 CD4 양성 CD25 음성 T세포가 표시되어 있습니다. 다음 그림에서는 고순도로 분리된 CD4 양성 CD25 low T세포를 확인할 수 있습니다. 유세포 분석으로 분리된 순수한 CD4 양성 세포 집단입니다.

상단 게이트 컨트롤에서 CD 25 고발현 treg 세포가 확인됩니다. 건강한 공여자의 APC와 treg 단일 세포 유형 배양에서는 티미딘 통합 측정 결과 배경값 대비 증식이 거의 또는 전혀 나타나지 않았습니다. 반면, naive CD 25 음성 세포와 in vivo 활성화된 CD 25 저발현 T 세포는 뚜렷한 증식을 보였으며, 이러한 반응 세포 유형들을 treg 세포와 공동 배양했을 때 증식이 억제되었습니다. 다만, tregs가 반응성 naive CD 25 음성 세포와 in vivo 활성화된 CD 25 저발현 T 세포를 억제하는 능력에는 약간의 차이가 관찰되었습니다.

이는 유의미한 대조군이 아니었습니다. 고위험군 피험자의 APC 및 Treg 단일 세포 유형 배양물은 티미딘 결합으로 측정했을 때 배경값 대비 증식이 거의 또는 전혀 나타나지 않았습니다. 반면, naive CD 25 음성 및 InVivo 활성화된 CD 25 low T 세포는 건강한 대조군에 비해 더 낮은 수준의 증식을 보였습니다.

분석 결과의 신뢰성이 확보되었으므로, 반응성 T 세포가 treg 및 공동 배양에 의해 추가적으로 억제되었음을 확인하였습니다. 또한, 낮은 CPM 값은 신호 전달의 잠재적 결함을 시사하며, 이는 다른 유형의 연구를 통해 추가 조사가 필요하다는 결론을 내릴 수 있습니다. 그러나 고위험군 피험자에서 CD 25 음성 반응성 T 세포와 CD 25 저발현 반응성 T 세포를 억제하는 treg의 능력 차이는 유의미하게 나타났습니다.

이 영상을 시청한 후, 건강한 피험자와 면역 체계가 손상된 피험자(예: 제1형 당뇨병 환자)를 대상으로 Treg 존재 여부를 확인하기 위한 성공적이고 신뢰할 수 있는 기능성 테스트의 모든 필수 단계를 원활하게 연결하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.