Name: 사람의 체외에서 억제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 학습하세요 체외 억제 분석법을 사용하여 Treg 기능을 측정하고 제1형 당뇨병 위험군의 면역 불균형을 조기에 식별하는 방법을. 이 기술은 자가면역 질환 연구에 중요한 도구입니다.

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이 연구는 위스콘신과 위스콘신의 어린이 연구소 소년 Diabetesat 메디컬 칼리지에 대한 최대 맥기 국립 연구소에 의해 지원되었다. funders는 연구 설계의 데이터 수집과 분석, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

1. 억압의 분석을 설정하기 전에, 이후 세포 자극과에 대한 안티 인간 인 경우에는 3 번 CD (복제 UCHT1, 최종 농도 1μg/ml)로 코팅 tosylactivated 구슬 하나 필요는 비즈가 효율적으로 인간을 사용하여 체외 확산 분석에를 설정하여 코팅 여부 확인 T 세포 <ol><li> 원래 유리병, 자기 스탠드의 장소에서 M - 450 tosylactivated 구슬의 1ml을 가지고 모든 구슬이 튜브의 측면을 준수 때까지 기다려. 튜브는 자기 서서 아직도있는 동안 버퍼를 제거합니다. 37, 선동을 resuspend 비즈를 buffer1의 1ml 및 안티 인간 인 경우에는 3 번 CD의 40μl를 추가 °, 마그네틱 스탠드 밖으로 튜브를 타고 buffer1의 1ml을 추가, 다시 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 튜브는 자기 스탠드에있는 동안 buffer1를 제거 C 15 분, 0.1 % W / V BSA를 추가하고 다음 16시간에 대한 agitating 계속합니다. </li><li> 버퍼를 제거하고 buffer2의 1ml에있는 구슬을 resuspend,, 비즈가 ° C 한번 5 분 buffer3에서 2-8에서 ° C 이상의 설명으로 자기 스탠드를 사용하여 2-8에서 5 분 동안 두 번 buffer2에 비즈 와시 4x10 8 / ML 최종 농도 및 사용을위한 준비. </li><li> 나누어지는 50000 및 25000 PBMC / 잘 96 - 웰 플레이트에 triplicates에서 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 구슬의 변수 번호 (4x10 8 구슬 / ML, 인 경우에는 3 번 CD에 들어 1μg/ml, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 구슬 / 셀 추가 ) 셀 당 구슬의 최적의 수를 결정하기 위해서. 문화 72 시간 후, 1μCi [3 H] thymidine을 추가하고 37 ° C 잠복기를으로 16 시간 동안 계속합니다. Multiscreen 수확 플레이트 (Millipore)에 수확 세포는 섬광 액체를 추가하고 위로 카운트 NXT (팩커드, CT)를 사용하여 잘 / 분 당 카운트 (CPM)을 참조하십시오. 진압 기능을 잃을지도 모른다고 Tregs의 overstimulation을 피하​​기 위해 비즈 / 노출당 비용은 5,000 위 아르 셀 비율이지만 미만 15,000을 사용합니다. 보통, 3 구슬 / 세포의 비율은 지금까지 테스트 1-4 전체 제목 그룹에서 응답하고 Treg 세포 모두를 자극. </li></ol> 2. 건강한 기증자 또는 인간 leukopacks 또는 일반적으로 지역 수혈 센터에서 무료로 건강 자원 봉사자 이용할에서 가져온 버피 코트 (BC) (그림 1)에서 전체 혈액에서 PBMC 절연 <ol><li> BC을 (~ 50ml) 1시 6분 PBS로 (추가 250ml) 희석. 지금은 300ml 총 볼륨이 있습니다. 천천히 15ml Ficoll - Paque 위에 희석 BC의 25ml 계층 Plus는 레이어를 방해하지 않고, 50ml 팰컨 튜브에 추가됩니다. 4 30 분 ° C, 브레이크에 대한 800xg에서 원심 분리기는 (스윙 양동이 로터 SH - 3000와 Sorvall 원심 분리기에서 1400rpm) 해제. </li><li> 조심스럽게 PBMC 층 (중간 단계)를 수집하고 신선한 50ml 팰컨 튜브로 전송할 수 있습니다. DPBS와 50ml로 튜브를 작성하여 PBMC 씻으십시오. 한 튜브에이 세포 알약을 수집합니다. 4 10 분 400xg에서 원심 분리기 ° C. 때마다 하나의 튜브로이 세포 알약을 결합하여, 두 번 세척 단계를 반복합니다. 단일 50ml 튜브로 모든 세포 알약을 결합합니다. </li><li> Trypan 블루 제외 테스트를 사용하여 PBMC를 계산합니다. Trypan 블루 180μl 얼룩 PBMC의 20μl를 추가하여 Trypan 블루에서 1시 10분 희석하십시오. 잘 믹스 즉시 hemacytometer에서 셀 20μl 가져가라. 두 블럭 16 작은 사각형을 포함하는 각에 위치한 모든 흠없는 오직 푸른 스테인드 세포의 숫자를 계산합니다. 두 숫자의 평균을 10으로 곱하면됩니다. PBMC / ML의 번호를 100으로이 번호를 나눕니다. 가능한 세포의 비율로 계산 [1 - (총 세포의 세포 블루 / 숫자 번호) x100의]. 생존 능력은 ≥ 95% 경우 진행합니다. </li></ol> 3. CD4 T 세포의 맥 사전 정렬 <ol><li> 계속하기 전에, 새로운 튜브로 PBMC의 1ml을 전송 5000rad - 다음과 방사선에 대한 세포를 준비하는 미디어 4ml를 추가 항원 제시 세포 (APC)가 될것이다. </li><li> 4 10 분 대한 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA의 버퍼에 250xg에있는 세포의 나머지 부분을 원심 ° C. PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼의 4ml에 뜨는하고, resuspend 세포를 하거라. </li><li> 맥스 안티 - CD4의 microbeads의 200μl를 추가하고 4 품어 ° C를 20 분. </li><li> 4 10 분 대한 250xg에 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼와 원심 분리기의 40ml를 추가하여 씻어 ° C. degassed, 실온 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼의 8ml에 뜨는 및 resuspend을 하거라. </li><li> LS 칼럼 그들을 로딩하기 전에 사전 분리 필터를 사용하여 필터 - 별도의 세포 현탁액. </li><li> 세포 현탁액 및 레이어 4ml 각 이상의 보정 LS 칼럼 (deggassed PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼의 3ml)를 분할. LS 칼럼은 MidiMACS 구분 기호에서 해결되었습니다. 세포 현탁액은 다시 실행 flowthrough 중 하나를 실행하거나 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼를 deggassed 실내 온도의 3ml 추가하고 버퍼를 통해 실행하게하기 전에. 그것이 밖으로 명확 올 때까지 더 많은 버퍼를 추가합니다. </li><li> LS 칼럼에 피펫 5ml deggassed 버퍼를 통해 ~ 1.0ml 실행시키는 새로운 살균 15ml 수집 관에 MidiMACS 분리 및 장소에서 LS 열을 제거하십시오. 칼럼로 플런저를 넣고 천천히 나머지를 밀어볼륨보세요. </li><li> 두 LS 컬럼과 동일한 작업을 수행하고 두 CD4 + 분수를 결합. 50ml PBS와 수를 셀 개까지 추가할 수 있습니다. 예상 수확량은 5x10 8 세포에 달려있다. 2ml PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼에 잘 10 분, resuspend 전지 400xg에서 원심 분리기. </li></ol> 4. 형광 활성 세포 정렬 (외과) 격리 (그림 2) <ol><li> 다음과 같은 세포 표면 마커 (빛으로부터 보호 유지)로 CD 마커에 항체의 칵테일 만들기 : 안티 - 인간의 CD8 - FITC (클론 RPA - T8), 안티 - 인간 CD14 - FITC (클론 M5E2 20 μl 20 μl; LPS 수용체), 안티 - 인간 CD32 - FITC (클론 FLI8.26 20 μl, FcγR 타입 II) 및 안티 인간 CD116 - FITC (클론 M5D12 6 μl, GM - CSFRα 체인) 및, 또는, 40μl 안티를 추가 인간 CD4 - APCCy7 (클론 RPA - T4). </li><li> 2ml 세포 현탁액에서 5μl을 가지고 얼룩 칵테일의 2μl와 얼룩,이 임계값 (Fluorochrome 빼기 1 - FMO) 5를 결정하기위한 튜브입니다. </li><li> 얼룩 칵테일로, 4 ° C 삼십분에 세포 현탁액과 부화 칵테일을 추가, 안티 - 인간 CD25 - PE (IL - 2Rα 복제 M - A251) 50 μl를 추가합니다. 10 7 / ML의 세포 농도로 10 분, resuspend 전지 400xg에서 PBS 버퍼, 원심 분리기에서 세포를 씻으십시오. </li><li> 흠없는 세포와 세포 또는 외과 아리아 (BD Biosciences, 산호세, NJ)에서 셀 정렬에 대한 보상 제어로 사용할 하나의 fluorochrome 물들일 구슬을 준비합니다. </li><li> 사용자가 CD25 + T 세포 (그림 2A)의 정렬에 대한 임계값을 설정할 수 FMO 튜브에 세포를 취득. monocytes, macrophages 및 기타 모든 CD4 + - 비 - T 세포 (그림 2B)로 구성된 FITC - 양성 세포를 제외 FITC - 부정적인 세포 주위에 게이트를 설정합니다. </li><li> 별도의 음모에, CD25 -, CD25low 및 CD25high T 세포 - Tregs (상단 CD25 가장 높은 숫자를 표현하는 세포의 1 %) (그림 2C)의 빌 게이츠를 그립니다. 세포 하위 집합은 일반적으로 고순도 (그림 2D, 2E 및 2 층)를 보여줍니다. </li><li> 10 분 400xg에서 전지 수집 튜브를 원심 분리기 및 도금까지 얼음에 있습니다. </li></ol> 5. 200μl/well에서 96 - 웰 플레이트 (계획은 Table1로 첨부)에서 세포 배양을 설정 <ol><li> 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 구슬 나누어지는의 50μl (1 μg / ML) 3 구슬 / U - 바닥에서 10 % 풀링된 인간 AB 혈청 완벽한 미디어 resuspended 우물에 응답 세포, 96 - 웰 플레이트로 계산. (예를 들어, 인 경우에는 3 번 CD - 코팅과 2ml 미디어를 만들기 위해, 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 재고 비즈 - 최종 농도 4x10 8 / ML에서 7.5μl 가지고 미디어 2ml에 희석, 모든 50μl가 75,000 beads-3beads/cell를 포함합니다.) </li><li> 5x10 5 / ML 세포 농도로 조사 APC를 희석하고 "오직 Tregs"로 표시 우물, "오직 APC"와 테이블에서 "미디어 전용"을 포함하여 이전에 추가 자극, 각 우물에 (2.5 X 10 4 세포를 포함) 50μl 추가 1. </li><li> 표 1의 디자인을 다음과 triplicates 2.5 × 10 4 / 잘 CD4CD25 또는 CD4CD25low T 세포를 추가합니다. </li><li> 비율 1시 10분 (2500 Treg 세포)의 공동 문화 (행 B, 표 1)과 "오직 Tregs"로 표시 우물에 Tregs을 추가하고 5 % CO 2와 CO 2 배양기에서 37 접시 ° C를 품어 72 시간 동안 포화 습도 인치 </li><li> 펄스 1μCi [3 H] thymidine과 우물 및 ° C으로 16 시간 동안 37 인큐베이션을 계속합니다. </li></ol> 6. 수확 및 계산 <ol><li> 팩커드 filtermate 하베스터 또는 다른 시스템을 사용 multiscreen 수확 접시에 수확 세포. </li><li> 섬광 액체 (Microscint 20) 추가 마지막 단계에 대비하여 투명 플라스틱 커버 플레이트를 수확 커버. </li><li> 분 당 카운트 (CPM)을 읽기 / 잘 톱 카운트 NXT (패커드, CT) 또는 다른 시스템을 사용합니다. </li></ol> 7. 억압의 컴퓨팅 비율 <ol><li> 세포 triplicates에서 교양 것처럼, 평균은 각 조건에 대해 계산됩니다. 변화의 계수가&gt; 30 %면, 국외자는 평균 두 우물에서 제거되며 CPM입니다. 억제 비율은 계산에 의해 얻어진다 [(SC) / S] X 100 %, 어디서 S = 노출당 비용 (CPM) 단일 문화와 C = 공동 문화 노출당 비용 (CPM). </li><li> 나이브 (CD25 -) 및 생체내 활성 (CD25low)에 효과기 T 세포 응답 T 세포로 도금이며, 이러한 집합의 각을 억제하는 Tregs의 능력의 차이는 전제를 기반으로 잠재적인 기능 전조 표시기로 캡처하고 사용되는 그 활성 세포 억제가 어렵습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : 방법에 큰 변화가 사용하고 체외 인간 억제 분석의에서 파생된 결과는 우리가 분석 한 영향을 미치는 조건의 종합적인 연구를 수행하라는 메시지가 나타납니다. 우리가 이전에 6 결정 Teffs (1시 10분) : 우리는 Tregs 간의 낮은 비율을 고려, Treg 기능뿐만 아니라 시험 분석뿐만 아니라, 자신의 순결을 개발했습니다. 또한, Tregs는 일에 차이가면역 균형에 문제가있다면 T1D 개발 위험이 과목에서와 같이 성공적으로 순진한와 그림 3에서 더 유명되고 우리의 이전 연구 2,4, 표시도 건강한 과목 생체내 활성화된 T 세포에 억제 EIR 능력 . 분석 우리가 건강 관리 사이에 자신의 기능을 비교할 수 있도록, 우리는 자연 (nTregs), inducible (iTregs)과 체외 확장의 nTregs에의 진압 기능을 비교 연구에서 매우 잘 작동, 최근 - 발병 (RO) T1D과 오랜 (LS ) T1D 과목. 우리는 RO T1D 과목 LS T1D 건강 관리 과목 7 비해 기능 iTregs 모두 및 확장 nTregs를 생성하는보다 능력이 있다고 결론을 내렸다. 따라서,이 분석은 면역 불균형의 초기과 늦은 상태 모두의 인식의 훌륭한 도구로 사용할 수 있습니다. 체외 억제 분석에 관련된 단계 계획 1 도식 프레 젠 테이션 <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 사진과 함께 제공 체외 억제 분석의 각 단계 <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 외과 세포 격리 게이팅 전략. A) CD25 + 임계값은 FITC - 부정적인 세포 (자세한 문이 있었고, CD + CD25 -, CD + CD25low과 CD + CD25high로 회수) 세포, C FITC - 부정적으로 문이되었습니다) Fluorochrome 빼기 1 (FMO), B에 따라 조정되었습니다 Tregs)가) 백분율, D로 표시 전자는 정렬 후 CD + CD25low를 정렬, 정렬 후 Tregs를 정렬 외과) 외과, 그리고 F) 정렬 후 정렬 CD4 + CD25 - T 세포를 외과 <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 건강한 과목 대표 결과) 관련된 모든 셀의 하위 집합에 대해 하나의 문화로 제시 건강한 과목 (순진한 - CD25 -, 생체내 활성 - CD25low에서 항원 제시 세포 - APC의 분당 카운트 대표 결과 (CPM)을하고 각 CD25 및 autologous Tregs에 의해 CD25low 응답 T 세포가 건강한 제어 과목 제시 (N의 억압의 규제 T 세포 - Treg)뿐만 아니라 응답 T 세포의 공동 문화 (CD25 또는 CD25low)와 Tregs. B) 비율 = 4). 억제는 [(SC) / S]로 계산했습니다 X 100 %, 어디서 S = 노출당 비용 (CPM) 단일 문화와 C = 노출당 비용 (CPM) 공동 문화 인치 응답 T 세포를 억제하는 Tregs의 능력에 약간의 차이가 발견되었지만, 그것은. C (T - 테스트 P = 0.08 이점)) 발표는 응답으로 CD25 및 CD25low 포함하여 각 단일 문화에 대한 위험 과목에의 CPM 아르 중요 아니었 T 세포뿐만 아니라 각 응답 T 세포 부분 집합은 autologous 각 CD25 및 CD25low 응답 T 세포의 억제의 Tregs (CD25-/Tregs 및 CD25low/Tregs.) D) 비율과 씨앗을 품고있다 APC와 Tregs 및 공동 문화 Tregs는 위험 과목 (n은 = 4)에서 제시합니다. CD25 - 대 CD25low 응답 T 세포를 억제하는 Tregs의 용량의 차이는 상당한되었다 (T - 테스트 P는 = 0.04를 결합하여). 표 1. 개략도 체외 억제 분석에의 준비 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1-3 </td><td> 4-6 </td><td> 7-9 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> </td><td> CD4CD25 - </td><td> CD4CD25low </td><td> 전용 미디어 </td><td> 전용 미디어 </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25 - / Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> 단 Tregs </td><td> APC 전용 </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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<li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+biological+evaluation+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23-targeted+PAMAM+dendrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Tregs 수있는 유일한 고유 기능으로, 진압 기능은 동일한 시간과 여러 연구 사이의 질병 개발의 다른 단계에서 과목 사이에 안정적으로 균일하게 테스트해야합니다. 우리는이 분석의 표준화로 우리의 기여로 저희 연구실에서 개발된 억제 분석의 세부 사항을 제공합니다. 우리의 광범위한 최적화 연구에서는, 우리는 안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 구슬 (APC로 PBMC와 함께 1μg/ml의 농도 UCHT1 복제 (같은 상용 5μg/ml 반대)와 T 세포의 자극 천연 자극을 제공하는 것으로 나타났습니다 단 Ancell 항체가 예상 결과를 준 우리 손에서와 같이 시험 과목 1 잘 응답 T 세포와 Tregs를 모두 활성화 능력. 방지 인간 인 경우에는 3 번 CD에 들어 항체의 선택은 매우 중요합니다. 방지 인간 인 경우에는 3 번 CD 및 안티과 동시 자극이 PBMC는 신호 전달과 효율적인 자극의 기회를 증가, 공동 stimulatory 신호의 전체 팔레트를 제공하면서 인간 CD28는 주제 그룹 (결과가...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 악기의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Ficoll - Paque PLUS </td><td> 애머스햄 Pharmacia 생명 공학 </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS - 1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CD4의 microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> 사전 분리 필터 </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS 칼럼 </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 인간 CD4 - APCCy7 (클론 RPA - T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 인간 CD25 - PE (클론 M - A251, IL - 2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 인간 CD8 - FITC (클론 RPA - T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 인간 CD14 - FITC (클론 M5E2, LPS 수용체) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 인간 CD32 - FITC (클론 FLI8.26, FcγR 타입 II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 인간 CD116 - FITC (클론 M5D12, GM - CSFRα 체인) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M - 450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD에 들어 </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> 홈메이드 </td><td></td><td> 0.1M 나 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> 홈메이드 </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / 0.1 % BSA pH7.4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> 홈메이드 </td><td></td><td> 0.2M Tris/0.1 % BSA pH8.5 </td></tr><tr><td> 완료 RPMI 미디어 </td><td> 홈메이드 </td><td></td><td> RPMI 1640 미디어 2 MM L - 글루타민 5 MM의 HEPES 100 U / μg / ML peni / strept 0.5 MM 나트륨 pyruvate </td></tr><tr><td> [3 H] thymidine </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> 인간의 풀링 AB 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Multiscreen 수확 플레이트 </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> 6,013,6​​21 </td><td></td></tr></tbody></table>

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

규제 T 세포 (Tregs)는 자기 항원에 면역 관용의 중요한 중재자입니다. 또한, 그들은 다음과 같은 감염 면역 반응의 중요한 규제하고 있습니다. Tregs의 독특한 표면 마커를 식별할 수 있도록 노력에도 불구하고, 유일한 고유 기능은 효과기 T 세포의 증식과 기능을 억제하는 능력이다. 그것은 체외의 assays 인간의 Treg의 기능을 평가에서 사용할 수있는 것이 분명이지만 건강한 세포와 세포가자가 면역 질환 (제 1 형 당뇨병 - T1D 등) 필요로하는 과목에서 격리 교차 단면 연구의 결과를 평가하면,이 문제가됩니다 비교합니다. 응답 비율과 항원 제시 세포의 수와 유형 (APC)는 체외 억제의 assays 인간의 사용 : 응답 T 세포, 자극의 자연과 강도, Treg의 수와 유형 실험실 사이 큰 변화가있다. 이 변화는 Treg 함수가 어려운 측정 연구 사이의 비교를합니다. Treg 필드는 건강한 과목과 면역 질환있는 사람 모두 잘 작동하는 표준 억제 분석이 필요합니다. 우리는 췌장 β - 세포의 면역 파괴를 기본과 과목에 비해 건강한 지원자에서 격리 T 세포의 자극에 아주 작은 내부 분석 변화를 보여줍니다 체외 억제 분석에을 개발했습니다. 이 작품의 주요 목표는 서로 다른 주제 그룹 간의 비교를 허용 체외 인간 억제 분석에 대해 설명하는 것입니다. 또한이 분석은 기능을 nTreg의 작은 손실을 윤곽을 그리다하고 앞으로 손실, 예방 immunomodulatory 치료 1에서 혜택을 누릴 수 있으므로 식별 과목을 예상할 수있는 잠재력이있다. 아래, 우리는이 절차에 관련된 단계 철저한 설명을 제공합니다. 우리는 Treg 기능을 측정하는 데 사용되는 체외 억제 분석에의 표준화에 기여할 수 있도록 최선을 다하겠습니다. 또한, 우리는 면역 불균형의 초기 상태와 T1D에 대한 잠재적인 biomarker 기능을 인식하는 도구로 분석을 제공합니다.

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된 설명을<em&gt; 체외에서</emT1D 개발하기 위해 위험 과목 면역 불균형을 식별하는 능력&gt; 검정.

조절 T 세포(Tregs)는 자기 항원에 대한 면역 관용의 핵심 매개체입니다. 또한, 조절 T 세포는 면역 반응의 중요한 조절자로서...

이 절차의 전반적인 목표는 인비트로(in vitro) 인간 억제 분석법을 사용하여 Treg 기능을 측정하고, 잠재적인 미래의 기능 상실을 예측하는 것입니다. 이는 먼저 세포 자극제로 사용될 코딩 비드(coded beads)를 준비하고 테스트함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 순수한 naive CD4+ CD25- T 세포, 인비보(in vivo) 활성화된 CD4+ CD25low T 세포, 그리고 조절 CD4+ CD25high T 세포를 분리하는 것이며, 항원 제시 세포(APC)로 사용하기 위해 방사선 조사된 PP BMC를 준비하는 것입니다.다음으로, 반응 세포로서 naive 또는 활성화된 T-세포를 사용하고 P BMC를 APC로 사용하는 단일 배양 또는 동일한 조건에서 treg를 1:10 비율로 추가한 공동 배양을 설정합니다. 마지막 단계는 세포를 회수하고 tritiated Thymidine incorporation을 통해 증식 정도를 측정하는 것입니다. 최종적으로 얻은 결과는 naive T-세포 반응과 in vivo에서 활성화된 T-세포 반응의 억제 차이를 보여줄 수 있습니다.제 이름은 Jeff Woodcliff입니다. 조절 T 세포는 고유한 세포 표면 마커를 발현하지 않습니다. 따라서 이들의 기능을 신뢰성 있게 측정하기 위해서는 최적의 분리 효율을 제공하는 기술을 사용하여 분리해야 합니다.max isolation과 같은 다른 방법보다 형광 활성 세포 분리법(FACS)을 사용하는 주요 장점은 FACS를 통해 매우 순수한 세포 집단을 얻을 수 있다는 점입니다. 그러면 여기서 입증한 바와 같이, in vitro 억제 분석법을 통해 세포 기능을 신뢰성 있게 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 건강한 피험자와 1형 당뇨병 관련 피험자의 treg 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 인간 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 기타 다른 자가면역 질환에도 적용될 수 있습니다. anti-human CD3로 taal 활성 비드를 코팅합니다.원래 바이알에서 M four 50 toil 활성 비드 1 mL를 1.5 mL 튜브에 넣고, 모든 비드가 튜브 벽면에 부착될 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 둡니다. 그런 다음 튜브가 마그네틱 스탠드에 있는 상태에서 피펫팅으로 비드 버퍼를 제거합니다. 이후 튜브를 마그네틱 스탠드에서 꺼내고 버퍼 1 1 mL를 추가합니다.튜브를 자석 스탠드에 반복해서 놓습니다. 튜브가 자석 스탠드에 있는 동안 버퍼를 제거합니다. 버퍼 1 mL에 비드를 다시 재현탁합니다.이번에는 anti-human CD3 40 µL를 함께 추가합니다. 비드와 항체를 37 °C에서 15분 동안 교반합니다. 그런 다음 0.1% w/v BSA를 추가하고 향후 16시간 동안 계속해서 교반합니다.다음으로, 1 mL의 buffer two에 비드를 넣고 2~8 °C에서 5분 동안 반응시켜 비드를 두 번 세척합니다. 그 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 둔 상태에서 buffer two를 제거합니다. 그런 다음 동일한 무균 조건에서 비드를 한 번 더 세척합니다.이번에는 1 mL의 완충액 3을 사용하여, 96-웰 플레이트의 각 웰에 50,000 PBMC를 3회 반복으로 분주하고, 세포당 CD3 코팅 비드의 수를 다양하게 추가하여 항체 코팅 효율을 테스트함으로써 최적의 비율과 ALI를 결정합니다. 37°C에서 72시간 동안 배양한 후, 1 µCi의 삼중수소화 티미딘을 첨가하고 다음 16시간 동안 계속 배양합니다. 멀티스크린 수확 플레이트 또는 이와 유사한 플레이트로 세포를 수확합니다.섬광액(scintillation liquid)을 첨가하고 웰당 분당 측정치(counts per minute) 또는 CPM을 읽습니다. top count N XT 섬광 계수기 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 비드 대 세포 비율을 결정하는데, 저희의 경험상 CPM이 지속적으로 5,000 초과 15,000 미만으로 나타나는 비율을 사용합니다. 테스트한 모든 인간 피험자에서 세포당 비드 3개의 비율이 반응 세포(responder cells)와 treg 세포 모두에 최적의 자극을 제공하는 것으로 나타났습니다.50 mL 원추형 튜브에 Ficoll-Paque 15 mL를 채웁니다. 그다음, 혈액이 담긴 튜브에 PBS 250 mL를 추가하여 50 mL의 버피코트(buffy coat)를 1:6 비율로 희석합니다. 희석된 버피코트 25 mL를 Ficoll-Paque 층이 흐트러지지 않도록 그 위에 천천히 층을 쌓아 올립니다.4°C에서 800 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 브레이크 기능을 끈 상태에서, 피콜(fial)과 버퍼 사이의 흰색 중간층인 PBMC 층을 조심스럽게 수집합니다. 필요한 경우, 튜브 벽면에 붙은 세포를 긁어내어 수집합니다.몇 분 정도 기다린 후 중간층에서 세포를 다시 수집합니다. 세포를 새로운 50 mL 튜브로 옮기고, PBS로 튜브를 채워 세척하여 펠렛 상태로 만듭니다. PBM cs.세척 단계를 매회 2번씩 반복합니다. 두 개의 세포 펠릿을 하나의 튜브에 합치고, 최종적으로 모든 세포 펠릿을 하나의 50 milliliter 튜브에 합칩니다. 그런 다음, 부유 세포 20 microliters를 사용하여 트라이판 블루 배제법으로 세포 생존율을 측정합니다.생존 가능한 PBMC 1 mL를 새 튜브로 옮겨 테스트용 APC를 생성합니다. 그런 다음 배지 4 mL를 추가하고 세포에 5,000 rads를 조사합니다. 나머지 PBMC가 들어 있는 튜브의 빈 공간을 PBS 버퍼로 채웁니다. 이후 4 °C에서 250 ×g로 10분간 원심분리한 다음, 상층액을 따라내고 동일한 혼합물 4 mL에 세포를 재부유시킵니다.그 다음, PBMC에 200 µL의 max anti CD4 microbeads를 첨가하고, 세포와 비드 혼합물을 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 40 mL의 PBS 버퍼로 세척한 다음 세포를 펠렛화합니다. 이어서 상층액을 따라내고, 실온에서 8 mL의 Degas PBS 버퍼로 세포를 재현탁합니다.다음으로, 분리 필터를 사용하여 세포 현탁액을 여과 분리합니다. 그런 다음 PBM CS를 15 mL 튜브 두 개에 나누어 담습니다. 각 튜브에 P BMCs 4 mL씩을 첨가합니다.두 개의 컬럼을 미니맥스 분리기(minimax separator)에 두껍게 고정하고 각 컬럼 아래에 수집 튜브를 배치합니다. 그런 다음 각 컬럼에 3 mL의 DGAs PBS 완충액을 추가합니다. 완충액이 모두 소모되면, 각 튜브에 담긴 4 mL의 세포 용액 전체를 세포 현탁액이 완전히 빠져나가기 전에 컬럼 위에 층지어 가합니다. 각 컬럼에 실온의 DGAs PBS 완충액 3 mL를 추가하고 완충액이 수집 튜브로 모두 흘러내리도록 둡니다.투명하게 나올 때까지 버퍼를 더 추가합니다. DGAs 버퍼 5 mL를 LS 컬럼에 더 피펫팅한 후, minimax 분리기에서 LS 컬럼을 제거합니다. 컬럼을 새로운 멸균된 50 mL 수집 튜브에 넣습니다.0.5 mL를 흘려보낸 다음, 나머지 약 4 mL의 부피를 천천히 밀어내십시오. 이제 CD4 양성 분획 두 개를 합칩니다. 그런 다음 튜브에 최대 50 mL의 PBS를 추가하고, 4 °C에서 400 ×g로 10분 동안 원심분리한 후 세포 수를 측정하십시오.세포를 2 mL의 PBS 완충액에 다시 현탁합니다. FACT 염색에 사용할 항체들(anti-CD14, CD32, CD16 및 선택적으로 anti-CD4)을 하나의 튜브에 혼합합니다. FLUOROCHROME 마이너스 튜브 염색을 위해 이 혼합액의 일부를 분취합니다.세포 현탁액 1mL당 튜브에서 5µL를 FACS 튜브로 옮겨 FMO 튜브를 준비하고, 이전에 준비한 항체 칵테일 2µL로 세포를 염색합니다. 다음으로, 세포 소팅을 위한 보정 대조군으로 사용할 새로운 개별 FACS 튜브에 미염색 세포와 마우스 IgG가 코팅된 비드를 넣고 단일 형광색소로 염색합니다. 그런 다음 칵테일에 anti-human CD 25 PE 50µL를 추가하고, 이 칵테일을 나머지 세포 현탁액에 넣습니다.튜브를 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 항체 칵테일로 세포를 배양한 후, 세포에 PBS 버퍼를 추가하고 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 펠렛을 10⁷ cells/mL 농도의 PBS 버퍼에 현탁합니다.FMO 튜브를 사용하여 CD 25 양성 T 세포의 분리를 위한 임계값을 설정하십시오. 이 게이팅 전략을 사용하여, 우선 이 그림에서 보여주는 것과 같이 단핵구, 대식세포 및 모든 기타 CD 4 양성 비 T 세포로 구성된 Fitc 양성 세포를 제외하기 위해 Fitc 음성 세포 주변에 게이트를 설정하십시오. 별도의 플롯에서, 이 그림과 같이 CD 25 음성 및 CD 25 low T 세포와 CD 25 high treg 세포를 위한 게이트를 그리십시오.유세포 분석 및 세포 하위 집단 분리 후, 수집 튜브를 원심 분리하여 펠릿을 형성하고 도말 전까지 T-세포를 얼음 위에 보관하십시오. 표에 표시된 대로 U-바닥 96웰 플레이트에 라벨을 붙입니다. 웰당 반응 세포 하나당 3개의 비드가 되도록 계산된 10% pooled human AB serum이 포함된 완전 배지 내의 CD3 코팅 비드 50 µL 분주액을 96웰 플레이트에 현탁한 다음, 이전에 방사선 조사한 APC를 배지로 희석하여 5 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춥니다.96-웰 플레이트에 세포 50 µL를 분주하고, 웰당 2.5 × 10⁴개의 CD4⁺ CD25⁻ 또는 CD4⁺ CD25ˡᵒ T-세포를 3반복으로 추가합니다. 여기에 표시된 대로 1:10 비율로 B행과 'tregs only'로 표시된 웰에 treg를 추가하여 공동 배양합니다. 그런 다음, 5% CO₂와 포화 습도가 유지되는 37 °C 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다. 다음으로, 1 µCi의 tritium-labeled thymidine을 세포에 처리한 후, 공동 배양의 마지막 몇 시간 동안 thymidine이 통합될 수 있도록 37 °C에서 16시간 동안 추가로 배양합니다.필터 메이트 하베스터(filter mate harvester)를 사용하여 멀티 스크린 수확 플레이트의 세포를 수확합니다. 그다음, 미리 신틸레이션 용액을 채워둔 투명 플라스틱 커버로 수확 플레이트를 덮습니다. 마지막으로 웰당 CPM을 측정합니다.신틸레이션 카운터를 사용하면 다음의 도트 플롯 시리즈에서 보는 바와 같이 이 시스템을 통해 T 세포 서브셋을 고순도로 분리할 수 있습니다. 하단 게이트에는 CD four 양성 CD 25 음성 T 세포가 표시되어 있습니다. 다음 그림에서는 고순도로 정제된 CD four 양성 CD 25 low T 세포를 확인할 수 있습니다. 플로우 소팅된 순수한 CD four 양성 집단입니다.상단 게이트 컨트롤에서 CD 25 high treg 세포가 나타나 있습니다. 건강한 공여자의 APC와 treg 단일 세포 유형 배양에서는 티미딘 통합으로 측정한 결과 배경값 대비 증식이 거의 또는 전혀 나타나지 않은 반면, naive CD 25 negative 및 in vivo 활성화된 CD 25 low T 세포는 뚜렷한 증식을 보였으며, 이러한 반응 세포 유형을 treg 세포와 공동 배양했을 때 증식이 억제되었습니다. 다만, tregs가 반응성 naive CD 25 negative 및 in vivo 활성화된 CD 25 low T-세포를 억제하는 능력에는 약간의 차이가 관찰되었습니다.이는 유의미한 대조군이 아니었습니다. 고위험군 피험자의 APC 및 Treg 단일 세포 유형 배양에서는 티미딘 통합 측정 결과 배경값 대비 증식률이 거의 없거나 매우 낮게 나타났습니다. 반면, naive CD 25 음성 및 InVivo 활성화된 CD 25 저발현 T 세포는 건강한 대조군에 비해 낮은 수준의 증식을 보였습니다.분석 결과의 신뢰도가 확보되었으므로, 반응성 T 세포가 tregs 및 공동 배양에 의해 추가로 억제되었음을 확인하였습니다. 또한, 낮은 CPM 값은 신호 전달의 잠재적 결함을 시사하며, 이는 별도의 연구를 통해 추가로 조사되어야 한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 다만, 위험군 대상자에서 CD 25 음성 반응성 T 세포와 CD 25 low 반응성 T 세포를 억제하는 tregs의 능력 차이는 유의미했습니다.이 영상을 시청하신 후, 건강한 대상자 및 제1형 당뇨병 환자와 같이 면역 체계가 손상된 대상자에게서 Treg의 존재 여부를 확인하기 위한 성공적이고 신뢰할 수 있는 기능적 테스트의 모든 필수 단계를 원활하게 연결하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 분비의 조절에 면역 경로의 역할을 조사하기 위해 시험 관내 분석을 개발 하였다.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

당사는 양성 선택을 이용하여 살아있는 인간 배아 줄기세포(hESC)의 식별 및 농축을 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 세포 표면 항원의 결합된 검출을 위한 단일클론 항체 TG30(CD9) 및 GCTM-2의 사용을 기술하고 또한 혼합세포 집단으로부터 hESC를 퍼지기 위한 음성 선택의 사용을 설명한다.

단일 클론 항체 TG30 및 GCTM-2를 사용하여 세포 표면 항원 검출에 의한 인간 배아 줄기 세포의 농축 및 정화

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 번역형 면역 종양학 연구를 위한 기지를 둔 인간화한 이종이식 마우스 모형. 이 프로토콜은 I-O 치료 평가를 위한 유사한 모형을 설치하고 특성화하기 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

고형 종양 조직의 정량적 면역 프로파일을 결정하고 면역 종양학 바이오마커 발견을 위한 임상 코호트를 활용하는 RNA 기반 접근법의 사용은 분자 및 정보학 프로토콜을 통해 설명된다.

고형 종양의 예측 면역 모델링

여기에 제시된 1 차적인 인간 혈액 단화 절연을 위한 프로토콜은 대식세포 및 수지상 세포로의 분화뿐만 아니라 다세포 인간 폐 모델로 상피 세포를 조립한다. 염증 성 자극에 노출되면 갓 분리되거나 해동 된 단핵구로부터 분화 된 면역 세포로 구성된 공동 배양의 생물학적 반응이 비교됩니다.

유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

이 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계(HIS) 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 이 모델에 이식된 인간 종양에 대한 인간 면역치료제를 시험하기 위한 이 모델의 사용에 있어서의 지침 및 고려사항은 종양에 대한 인간 면역계의 반응을 특성화하는 것에 중점을 두고 제시된다.

인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트

학습하세요 체외 억제 분석법을 사용하여 Treg 기능을 측정하고 제1형 당뇨병 위험군의 면역 불균형을 조기에 식별하는 방법을. 이 기술은 자가면역 질환 연구에 중요한 도구입니다.

사람의 체외에서 억제

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