Name: Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 배우세요 마우스 각막 포켓 분석법으로 basic FGF의 혈관신생 효과를 평가하는 방법을. 각막에 포켓을 만들고 펠릿을 삽입하여 림부 혈관에서 새로운 혈관이 자라는 과정을 관찰할 수 있습니다.

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우리의 연구는 NIH, 국립 안과 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.

사용된 모든 장비와 시약이 멸균됩니다. 프로토콜은 동물 케어 승인 및 (동물 연구 프로토콜 네이 - 553) 네이 / NIH에서위원회 (ACUC)를 사용하고, NIH의 지침과 규정에 따라 수행였습니다. 1. angiogenic 요인 함유 알약을 생산 이 부분에 관심 angiogenic 요인을 포함하고있는 알약을 준비하고 있습니다. <ol><li> 10 % (W / V) PBS로 sucralfate 솔루션을 확인하십시오. 실온 하에서 보관하십시오. </li><li> 12% (W / V) 절대 에탄올과 쓰임새 HEMA하십시오. 실온 하에서 보관하십시오. </li><li> 1 μg / μl bFGF 솔루션을 확인하십시오. -80에 저장 ° C. </li><li> 50 알약을 만들기 위해 sucralfate와 bFGF 주식 솔루션 4 μl의 1μl 폴리 - HEMA 5 μl, 철저하게 소용돌이를 섞는다. </li><li> 배양 접시에있는 깨끗한 parafilm 조각을 장소, 조직 문화 후드에서 15 분 자외선 아래로 노출. 한 펠렛에 대한 parafilm에 솔루션 혼합물의 0.2 μl를 버려라. 따라서 솔루션 혼합물의 10 μl 50 알약을 얻을 것입니다. 1-2시간 위해 상온에서 산탄이 건조하자. 마른 쥐똥은 ° C 몇 달 동안 몇 일, 또는 -80 4 OC에 저장할 수 있습니다. </li><li> 사용시, 캐내다와 포셉 한 켤레의 도움말로 알약을 픽업. 그들을 아프게하거나 멀리 봄하게하지 않도록 각별히주의하십시오. </li></ol> 2. 마우스 각막 포켓 분석을 수행 이 부분에서, 우리는 주머니에 펠렛를 삽입하는 방법을 마우스 각막에 주머니 만드는 방법을 보여, 그리고 것입니다. 펠렛에 포함된 angiogenic 요인은 각막의 주변 지역 (그림 1) 점진적으로 공개됩니다. 이 예제에서, 우리는 8 주 여성 C57/Bl6 마우스를 사용합니다. <ol><li> 마우스 마취제 (75 MG / kg)과 xylazine (5mg/kg, IP 사출)의 혼합물과 함께 체계적으로 깊이 anesthetized입니다. 이것은 30-60 분 마취 상태에서 마우스를 계속합니다. 국소 마취 (0.5 % proparacaine HCL)은 각막에 적용됩니다. 5 분 후, 해부 현미경으로 눈 하나 수정. </li><li> 매우 부드러운 상처는 본 Graefe 백내장의 칼로 각막 limbus (그림 1 그림)에서 각막 1.2 -1.4 mm의 중간에 이루어집니다. 각막을 건드리지 않게 매우주의하십시오. </li><li> 포켓은 수평 각막의 중간에 칼을 삽입하고 limbus 신중 (Fig.1)쪽으로 칼을 확장하여 각막의 상피 층 아래에​​ 이루어집니다. 주머니의 크기는 한 angiogenic 요인 함유 펠렛을 수용할 정도로 큰 수 있습니다. 아니라 각막을 통해 펑크 매우주의하십시오. </li><li> 천천히 주머니에 포셉 한 쌍의와 펠렛을 넣습니다. 가능한 한 평면으로 펠렛을 만들어보십시오. </li><li> 펠렛의 주입 후 국소 안과 항생제 연고가 눈에에 적용됩니다. 악기 동물 사이에 70 % 알코올 패드로 닦아 있습니다. </li><li> 그것이 똑바로 자세를 유지하고 다음의 홈 케이지로 돌아갈 수 때까지 따뜻하고 건조한 지역에 마우스를 이동하고 모니터링합니다. 체계적 진통제 (예, buprenorphine, 2 MG / kg, IP 주입) 및 국소 항생 연고 (예 : gentamicin) 수술 후 2 일 회 제공되며 마우스가 밀접하게 3 일간 모니터링합니다. 힐링은 처음 48 시간 이내에 수술 완료 예정입니다. 주머니에있는 안과는 펠렛 주입 후 4~10일 사이에 슬릿 램프 biomicro 범위에 따라 검사한다. </li></ol> 3. 대표 결과 <ol><li> 펠렛 주입 후 이레는 마우스 systemically과 몸에 붙이기로 2.1에 설명된 anesthetized 있습니다. </li><li> 해부 현미경 angiogenic 요인에 의해 유도된 각막에 혈관을 관찰. 차량 대우 각막에는 아무런 혈관의 성장은 (그림 2A, 차량 취급 각막) 관찰 수 없습니다. bFGF 대우 각막에서 강력한 angiogenesis는 (그림 2B) 볼 수 있습니다. 혈관의 성장은 혈관 (새로운 혈관의 맨 ​​정상 limbal 혈관에서), 그리고 전체 혈관 영역 (그림 2B, bFGF에 빨간색 점선과 delineated의 최대 길이를 사용하여 평가 수 ) 각막 - 처리. 기타 부량 방법도 2,5 설명하고 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. H &amp; E의 얼룩과 함께. 정상 각막. 대한 혈관은 정상 각막에 존재하지 않습니다. B는. 각막의. C 상피 층 아래에 주머니하십시오. 주머니에 펠렛을 삽입할 수 있습니다. D. angiogenic 요인은 펠렛에서 풀려나, 새로운 혈관은 정상 혈관 limbal에서 성장합니다. <img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 오일 메신저 후 대표 결과펠렛의 농장.. 전용 차량을 포함한 펠렛과 함께 각막. 각막에 새로운 혈관 형성하지 않습니다. 단지 기존 일반 limbal 선박 볼 수 있습니다. B는. 펠렛 함유 bFGF와 각막. 강력한 새로운 혈관 (도트 늘어선) 기존의 일반 limbal 선박에서 자랐습니다.

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

마우스 각막 포켓 분석 모델을 먼저 Muthukkaruppan VR 및 아우어 바흐 R 6 1979 년에 설명했다. 자세한 프로토콜은 다른 실험실 2,3,7,8에 의해 공개되었습니다. 저희 연구실은 몇 년 4 수정 및 우리의 연구에이 방법을 사용하고 있습니다. 마우스 각막 포켓 검정 좋은 재현성있는 비교적 간단한 모델입니다. 이 모델의 또 다른 장점은 각막이 정상적으로 혈관 부족 때문에,이 분석의 배경 최소 금액이있다는 것입니다. 따라서,이 모델은 일반적으로 다른 요소와 분자의 angiogenic 효과를 연구하기 위해 필드로 사용됩니다. 이러한 쥐 및 토끼 같은 큰 동물의 눈으로 비교, 마우스 눈은 작고 다루기 어렵습니다. 특히 각막의 주머니를 만들고 펠렛을 삽입의 과정 동안,이 모델을 수행할 때 특별한주의가 따라서 필요합니다. 나이프는 정확하게 제어 방식으로 처리되어야 그것이 소중히 각막을되지 않습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> PZMIV - BS </td></tr><tr><td> 본 Graefe 백내장 나이프 (1.5x25mm 블레이드, 평면) </td><td> 앰블러 외과 </td><td> 3401E </td></tr><tr><td> 더몬트 # 5 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-50 </td></tr><tr><td> 슬릿 램프 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 30 SL - M </td></tr></tbody></table> 표 1. 장비 <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> bFGF (기본 fibroblast의 성장 인자) </td><td> PEPROTECH (주) </td><td> 100 - 18B </td><td></td></tr><tr><td> Sucralfate (자당 octasulfate - 알루미늄 복합) </td><td> 시그마 </td><td> S0652 </td><td> PBS에서 10 % </td></tr><tr><td> 폴리 - HEMA (폴리 (히드록시 에틸 메타 크릴 레이트 2)) </td><td> 시그마 </td><td> P3932 </td><td> 에탄올에 12% </td></tr></tbody></table> 표 2. 시약 및 재료

angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

정상 각막은 혈관 조직이 분명하다. 그러나 혈관이 강력한 angiogenic 요인이 1을 투여하는 각막의 성장과 생존을 유도하실 수 있습니다. 이 독특한는 각막 포켓 분석 angiogenesis 연구에 대해 가장 많이 사용되는 모델 중 하나가되었다. 각막은 세포의 여러 레이어를 작곡. 그것은 angiogenic 효과 2,3를 조사하기 위해 각막에 대한 관심의 angiogenic 요인을 포함한 펠렛를 포함하는 것이 가능합니다. 여기, 우리는 (I)는 angiogenic 요인 함유 펠렛 (II)을 (III)의 관심 angiogenic 요인에 의해 유발 angiogenesis를 분석 각막에 펠렛을 포함을 생산하는 방법의 단계 시범에 의해 단계를 제공합니다. 기본 fibroblast의 성장 인자 (bFGF)가 가장 강력한 angiogenic 요인 4의 하나로 알려져 있기 때문에, 그것은 각막에 angiogenesis를 유도 여기에 사용됩니다.

각막은 혈관 조직이 부족한다는 점에서 고유합니다. 그러나, 강력한 혈관의 성장과 생존은 강력한 angiogenic 요인에 의해 각막에 유도된 수 있습니다. 따라서 각막이 우리와 함께 angiogenic 연구 가치있는 도구를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 각막 포켓 분석 방법과이 모델을 사용 angiogenic 요인에 의해 유발 angiogenesis을 평가의 마우스 모델을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

정상적인 각막에는 혈관 조직이 없습니다. 하지만 강력한 혈관 형성 인자가 ... 될 때, 각막 내에서 혈관이 성장하고 생존하도록 유도될 수 있습니다.

본 절차의 전체적인 목표는 각막 포켓 분석 모델을 사용하여 basic FGF의 혈관 형성 효과를 테스트하는 것입니다. 이는 각막에 포켓을 만들고 그 안에 basic FGF 펠릿을 삽입함으로써 수행됩니다. 이후 펠릿에서 basic FGF가 방출되어 각막연 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하도록 유도합니다.최종적으로, 이 프로토콜을 통해 각막 주변부 혈관에서 기본 FGF 펠렛 방향으로 강력한 신생 혈관 성장을 유도할 수 있습니다. 안녕하세요, 국립 INIH 연구소 Shiley 박사님 연구실의 Shuan입니다. 이 모델의 주요 장점은 재현성이 높으면서도 모델 구조가 비교적 단순하다는 점입니다.또 다른 장점은 정상 각막에는 혈관이 없기 때문에 배경이 매우 깨끗하다는 점입니다. 이제 모델에 대한 전반적인 개념을 파악했으므로, 각막 팝업 질환 모델을 만드는 방법을 단계별로 보여드리겠습니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 준비하기 위해 10% w/v sate 및 PBS, 12% w/v poly hema 및 에탄올, 그리고 1 g/µL basic FGF 솔루션을 제조하십시오. basic FGF는 -80 °C에서 보관해야 하며, 나머지 두 솔루션은 상온에서 보관할 수 있습니다.50개의 혈관 형성 인자 펠렛을 만들기 위해, 200 µL PCR 튜브에 5 µL의 poly hema 용액, 1 µL의 sate 용액, 4 µL의 basic FGF 용액을 혼합한 후 볼텍스하여 혼합물을 완전히 섞습니다. 그런 다음 파라필름 조각을 페트리 접시에 놓고, 혼합물을 0.2 µL씩 파라필름 위에 분주합니다.각 방울은 하나의 펠렛으로 건조됩니다. 펠렛을 실온에서 1~2시간 동안 건조시키십시오. 건조된 펠렛은 4°C에서 며칠 동안, 또는 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.펠릿을 사용하려면 핀셋을 이용해 파라필름에서 조심스럽게 떼어내되, 펠릿이 깨지거나 튕겨 나가지 않도록 각별히 주의하십시오. 케타민과 자일라진 혼합물로 마우스를 마취시킨 후, 피펫을 사용하여 각막에 0.5% 프로판 하이드로클로라이드 50 µL를 도포합니다. 5분 동안 기다린 후, 한쪽 눈이 대물렌즈 바로 아래에 오도록 마우스를 해부 현미경 아래에 배치하십시오.멸균된 von grave 백내장 칼을 사용하여 각막 주변부(corneal limbus)에서 약 1.2 ~ 1.4 mm 떨어진 각막 중앙에 매우 조심스럽게 절개창을 냅니다. 이때 각막을 완전히 관통하지 않도록 극도로 주의

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

physiologic angiogenesis 그 부족 일반 성인 vascularized 포유류의 조직은 학습하는 데 사용됩니다 수술 개입에 노출되지 않았습니다 (I) 개시 및 시험 요원의 intraperitoneal 관리 다음 angiogenesis의 개발, 그리고 체계적인 관리 아래와 angiogenesis의 (2) 수정 테스트 에이전트를 선택했습니다.

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

이 비디오는 안구 미세혈관 신생을 연구하기 위한 맥락막 발아의 생체 외 모델 개발을 보여줍니다. 이 분석은 맥락막 미세혈관 발아를 촉진하는 특정 조건에서 공막과 망막 색소 상피에 부착된 맥락막 조직을 포함하는 쥐 눈 외식물을 배양하는 것을 포함합니다.

생체 외 안구 미세혈관 증식을 연구하기 위한 맥락막 발아 분석

각막의 혈관 신생 (NV)는 여러 시각 병리를 복잡하게 할 수 있습니다. 제어, 알칼리 화상을 입지 모델을 활용, 각막 NV의 정량화 수준은 신생 혈관 질환에 대한 잠재적 인 치료의 각막 NV 및 평가의 기계 론적 연구를 위해 생성 될 수있다.

마우스의 각막 신생 혈관의 알칼리 화상 상해 모델

이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다.

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

아이리스 neovascularization, 허 혈 성 망막 질환의 일반적인 합병증은 신생 녹 내장 시력을 위협 하 될 수 있습니다. 여기, 우리는 신생 변조 물질의 비 침범 성 평가 위해 사용할 수 있는 실험 아이리스 neovascularization를 유도 하는 murine 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 모델 Rubeosis Iridis의 아이리스 Neovascularization 펑크 유발

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

이 프로토콜은 마우스의 알칼리 화상 유발 각막 신생혈관화에 중점을 둡니다. 이 방법은 병리학적 혈관신생 및 관련 분자 메커니즘을 연구하고 각막 신생혈관을 예방하기 위한 새로운 약리학적 제제를 테스트하기 위해 재현 가능하고 제어 가능한 각막 질환 모델을 생성합니다.

알칼리 화상에 의한 각막 신생혈관 형성을 위한 마우스 모델

여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

배우세요 마우스 각막 포켓 분석법으로 basic FGF의 혈관신생 효과를 평가하는 방법을. 각막에 포켓을 만들고 펠릿을 삽입하여 림부 혈관에서 새로운 혈관이 자라는 과정을 관찰할 수 있습니다.

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

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