Name: 광학 프로젝션 Tomography를 사용하여 인간 유방암 표본과 그 분석의 장기 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 광학 프로젝션 단층촬영법을 이용해 인간 유방암 조직을 20일간 장기 배양하고 3차원 침윤 패턴을 정량 분석하는 방법입니다. 이 기술은 개별 종양의 약물 반응을 평가하여 맞춤형 치료에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 임상 표본을 얻기 그녀의 귀중한 도움로나 랜쇼 (에딘버러 유방 단위)를 주셔서 감사합니다. 종양 소재의 이용은 로디언 연구 윤리위원회 (08/S1101/41)에 의해 승인되고 실험 암 의학 센터 프로그램 (에든버러)의 후원하에 얻은 것입니다. 이 작품은 스코틀랜드 기금위원회에 의해 지원됩니다. ADL은 미스 마가렛 버터 리키 신뢰 임상 사람이다.

1. 랫 뒷면에서 콜라겐을 추출 <ol><li> 70 % 에탄올에 냉동 신선한 쥐의 꼬리를 놓습니다. </li><li> 메스 노출 힘줄과 overlying 피부를 Deglove. </li><li> 멀리 꼬리와 소독을 70 % 에탄올의 장소에서 힘줄을 스트립. </li><li> 수집 힘줄과 초산 (250ml 0.5M 초산에 1g의 힘줄)로 전송을 나가는거야. 4 48hr에 대한 믹스 ° C. </li><li> 30 분 대한 1만g에 힘줄이 / 아세트산 혼합물을 원심 분리기와 펠렛을 삭제. </li><li> 뜨는 10 %의 동일한 부피 (W / V) NaCl을 추가하고 혼합 4에서 하룻밤 서있게 ° C. </li><li> G. 10,000에서 추가로 30 분 대한 콜라겐이 풍부한, 불용성 아래 레이어와 centrifugate를 수집 </li><li> 4 0.25M 초산에있는 콜라겐이 풍부한 재료 ° C를 Resuspend 두 번 매일 투석 버퍼를 변경, 3 일 동안 4 ° C에서 1:1000 초산에 대한 dialyse. </li><li> 또한 4 원심 분리 (2 시간에 대한 2만그램)과 저장하여 콜라겐 솔루션을 소독 ° C. </li><li> 1mg/ml의 재고 농도로 멸균 1:1000 초산의 추가로 필요한 콜라겐을 희석. </li></ol> 2. 3D 분석 작성 3D 분석은 세포 라인 분석을 기반으로, 이전에이 게시되었습니다. <ol><li> 다중 코어 biopsies는 침입 유방암에 대한 치료 수술 절제술시 환자 동의에서 수확하고 있습니다. </li><li> 눈으로, 1mm 3 조각으로 메스를 사용하여 코어를 나눕니다. 트림 및 macroscopically 별개의 지방을 삭제. </li><li> MEGM 완료 언론의 조각을 담가. 조직은 최대 1 시간까지이 상태로 저장할 수 있습니다. </li><li> 얼음 1mg/ml 랫 꼬리 콜라겐에있는 콜라겐 젤, 믹스를 생성하려면, 1:1000 필터링 초산, 3:5:1:1의 비율 10X DMEM/F12 및 0.22M NaOH 0.3의 최종 콜라겐 농도를 만들 수 MG / ML. </li><li> 37 인큐베이터에 24 잘 접시와 장소 개별 우물에 콜라겐 혼합의 1.2ml를 주사 ° C를 10 분 대한 겔화를 시작합니다. </li><li> 10 분 후 인큐베이터에서 24 잘 플레이트를 제거합니다. 겔화 콜라겐에 종양의 조각을 놓고 부드럽게 10μl 피펫 팁을 사용하여 젤의 중심에 그들을 밀어. 1 시간을위한 인큐베이터에 24 잘 번호판을 반환합니다. </li><li> ER + 종양 들어, 3.2x10 -10 M.의 농도 β - oestradiol와 MEGM 완전한 미디어를 보완 겔 assays는 1 시간에 대한 gelled 후에는 신중하게 각 우물에 보충 미디어 1.2ml 소개합니다. 검정 내에서 최종 β - oestradiol 농도는 유방 조직 3 발견 생리 에스 트로겐 수준을 요점을 되풀이하는 1.6x10 -10 M에 equilibriate 것입니다. </li><li> 따라서 각 젤 미디어 내에서 자유롭게 부동 수 있도록 circumferentially 각 젤 발표 각 우물의 안쪽 가장자리 주위에 10μl 피펫 팁을, 실행합니다. 인큐베이터에 24 잘 번호판을 반환합니다. </li><li> Exchange는 실험 종료까지 미디어가 두 번 주간 보충. 미디어를 제거하고 포르말린 정착액을 추가하여 실험을 종료할 수 있습니다. </li></ol> 3. 광학 프로젝션 Tomography 준비 어세이의 항체 스테 이닝 우리는 전체 샘플 얼룩의 4 이전에 게시된 방법을 채택했습니다. <ol><li> PBS로 30 분 대한 포르말린 고정 표본 씻으십시오. 각 단계에서 33% 66 %, 그리고 ≥ 15 100 % PBS는 0.05 % 트윈 20 (0.05 % PBST)을 포함하는으로 희석 메탄올에 stepwise 젤을 탈수. </li><li> DMSO : : 30 % H 2 autofluorescence를 끄지을 이용하려면에 대해 실온에서 2시 1분 3초의 비율 (15 % V / V H 2 O 2)에서 O 2 신선한 MeOH의 조직을 품어. </li><li> 메탄올에 30 분에 두 샘플을 씻으십시오. -80 ° C 조직의 깊은 부분에 항원을 보장하기 위해 실내 온도 (RT)로 적어도 1 시간마다 시간을위한 다섯 시간이 렌더링에 액세스할 수있는 샘플을 고정. </li><li> 희석제 (각 단계에서 33% 66 % 및 15에 대한 100 %)로 메탄올과 다시 0.05 %의 PBST로 조직을 Rehydrate. </li><li> 이용하려면에 대한 솔루션 (0.05 %의 PBST에서 혈청 10 %) 차단의 조직을 차단합니다. </li><li> 48hr 5 % DMSO를 포함 차단 솔루션 1.5ml에 희석 1:500의 농도에 방지 cytokeratin 토끼를 사용하여 상피 내용을 식별하는 기본 항체로 조직을 품어. </li><li> 30 분 각각에 대해 0.05 %의 PBST로 샘플 네 번이나 씻으십시오. </li><li> 48hr 5 %의 DMSO를 포함 1.5ml 차단 솔루션에 희석 형광등 보조 항체 (1:100 염소 방지 - 토끼 Alexa555)로 조직을 품어. </li><li> 30 분 각각 0.05 % PBST 네번로 다시 샘플을 씻으십시오. </li></ol> 4. 광학 프로젝션 Tomography 광학 프로젝션 tomography는 최대 15mm 5의 두께 형광 생물 학적 표본의 고해상도 3D 이미지를 생산하기 이전에 개발된 현미경 기법입니다. <ol><li> S 마운트tained 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스 겔 및 이용하려면에 대한 100 % 메탄올로 탈수. 48hr에 대한 밥 솔루션 (1시 2분 벤질 알코올, 벤질 벤조 산)의 표본을 해제하고 OPT 3001M 스캐너 (Bioptonics)을 사용하여 검사합니다. </li><li> 대상 및 autofluorescence 모두 Cy3 필터 세트 (자극 545nm/30 NM, 에미터 75분의 610 NM)와 각각 GFP1 필터 세트 (자극 425nm/40 NM, 에미터 LP475 NM)을 사용하여 캡처합니다. </li></ol> 5. 재건 및 3D의 부량 <ol><li> OPT 인수 각도 예측의 집합은 침공 분석을 통해 단면 슬라이스 일련의를 만드는 NRecon 소프트웨어 (SkyScan)를 사용하여 복원 수 있습니다. 이 소프트웨어에서 무료로 다운로드할 수 있습니다 <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Volocity 소프트웨어 (PerkinElmer)를 사용하여 복원 데이터를 Analyse. 무료 데모 소프트웨어는 다음 위치에서 다운로드할 수 있습니다 <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> cytokeratin 얼룩으로 상피 볼륨을 계량하기 위해서는 대상 채널의 배경 형광의 간섭을 줄이기 위해 최소 voxel의 강도 임계값 설정합니다. 우리는 측정 어플 리케이션에서 사용할 수있는 매개 변수 목록을 사용하여 9000 프에서 경험적으로이 임계값을 정의, 우리는 원래의 핵심 (autofluorescent 채널에 demarcated)과 연속성에서 상피의 볼륨을 계량. 이것은 우리가 다른 사이의 상피 가지의 볼륨을 계량 수 종양 샘플. </li></ol> 6. 대표 결과 : 분석의 개발 과정, 52 유방암의 총 조직 병리학의 다양한 표본이 사용되었습니다 생검. 이들 중 &lt;10 % (5 / 52) 적어도 하나의 가능한 공격 분석을 제공하지 못했습니다. 분석 실패도 위에 감염 세균이나 부족 종양 생검 재료에 의한했다. 따라서 분석의 응용 프로그램은 유방암의 특정 subtype에 제한되지 않습니다. 일반 assays (그림 1) 콜라겐 문화 20 일 후에 고정 및 이후 cytokeratin에 대한 얼룩. Volocity 소프트웨어는 원래의 핵심과 세포를 침해의 분리된 그룹과 지속적인 상피 대량을 모두 인식하고 개별적으로 각각의 볼륨을 정할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 고정 및 부량 다음 그림 1. 침공 assays. 검정 여러 유방암 subtypes에서 얻은 샘플을 지원합니다) ER + B) HER2 + 및 C) ER -.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

바느질과 JF은 Bioptonics OPT 스캐너의 상용화는 MRC 기술에 의해 고용됩니다. 기타 저자 관심에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.

암 세포 라인의 행동을 연구하는 콜라겐 기반 assays 지금은 널리 6,7,8를 사용하고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 assays는 종양과 환경의 전체 복잡에 반영하지 않았습니다. 본 연구에서는, 우리는 인간 유방암 자료는 유사한 방식으로, 전 생체내에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 또한, OPT는 유방암의 3D 확장을 특징하는 유용한 도구입니다. 우리는이 기술의 주요 한계는 종양 자료 (단일 코어 생검은 4-6 assays에 충분합니다)의 이용되고있는 것으로 나타났습니다. 또 다른 제한 요인은 구조적 침략은 assays의 약 40 %에서 발생합니다. 이것을 극복하기 위해, 우리는 정기적으로 보이는 성장과 모든 assays하는 일 7.2 주변에 원하는 치료를 추가합니다. OPT의 사용은 또한 약물 치료로 인한 대량 변경, 전직의 생체내를 감지하는 미래의 확장 수 있습니다. 이 차례, 동물 모델의 독립보다 개별적인 암 치료를 용이하게 수 있습니다. 현재 tamoxifen 전직의 생체내에 ER + 종양의 반응을 탐구하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 완료 MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC - 3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β - oestradiol </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E8875 - 250MG </td></tr><tr><td> 토끼 방지 cytokeratin </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> 염소 안티 - 토끼 Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> 다른 모든 표준 시약은 시그마 - 알드리치 얻은되었습니다.

광학 프로젝션 tomography를 사용하여 인간 유방암 표본과 그 분석의 장기 문화

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

유방암은 서양 세계에서 사망의 주요 원인이다. 이곳은 유방암의 확산은 먼저 로컬 나중에 distally, 환자 예후에 중요한 요인임을 설정됩니다. 유방암의 실험적 시스템은 일반적으로 기본 종양이나 흉막 effusions에서 파생된 세포 선에 의존하고 있습니다. 두 가지 주요 장애물이 연구를 저해 : (I) 유방 암 (특히 가난한 예후 luminal B 종양)의 하위 유형의 알려진 일부 현재 라인 컬렉션 내에 표시되지 않습니다; (2) 종양의 microenvironment의 영향은 일반적으로 고려되지 않습니다. 우리 모두는 하위 유형의 문화 일차 유방암 표본에 대한 기술을 보여줍니다. 이것은 종양의 작은 조각이 나는 부드러운 쿠션 쥐의 콜라겐에 포함된하는 입체 (3D) 문화 시스템을 사용하여 이루어진다. 2-3 주 내에, 종양 세포는 콜라겐으로 확산하고 인간 tumours1에서 관찰 비슷한 여러 구조를 형성하고 있습니다. 가능한 adipocytes는 원래 핵 내에 상피 세포와 섬유아 세포가 조직학에 분명했다. squamoid 형태와 악성 상피 세포는 주변의 콜라겐에 폐를 끼치고 시연했다. 핵 pleomorphism은 mitotic 인물과 apoptotic 기관과 함께,이 세포 내에서 분명했다. 우리는 문화의 종양 확산의 범위를 정할 수 있도록 광학 프로젝션 Tomography (OPT), 3D 이미징 기술을 고용했습니다. 우리는 종양 문화의 대량 볼륨을 측정하는 OPT를 사용하여 있고, 매개 변수는 정기적으로 약물 치료에 반응을 평가하는 유방암 환자의 네오 도움이되는 치료를하는 동안 측정. 여기, 우리는 하위 유형 편견없이 문화를 인간의 유방 종양 수있는 기회를 제시하고 그 전 생체내의 확산을 계량. 이 방법은 원래 종양의 약물 민감도를 수치 미래에 사용될 수 있습니다. 이것은 현재 사용되는 셀 라인보다 예측 모델을 제공할 수 있습니다.

우리는 콜라겐 기반을 개발<em&gt; 체외에서</em모든 유방암 subtypes의 샘플에서 증식과 침략을 촉진&gt; 분석. 광학 프로젝션 Tomography, 입체 현미경 기술은 종양의 확장을 시각화하고 수치 활용했다. 이 분석은 개별 종양 샘플의 약물 반응을 계량하는 데 사용할 수 있습니다.

광학 프로젝션 Tomography를 사용하여 인간 유방암 표본과 그 분석의 장기 문화

유방암은 서구 세계에서 주요 사망 원인 중 하나입니다. 유방암의 확산은 처음에는 국소적으로, 그 후에는...라는 점이 잘 확립되어 있습니다.

본 절차의 전반적인 목표는 일차 유방암 조직의 장기 배양체를 구축하고, 3차원 성장 패턴을 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐 꼬리에서 1형 콜라겐을 추출합니다. 그 다음, 암 생검 시료를 준비하여 콜라겐 매트릭스 내에 매립합니다.20일간의 배양 후, 유방암 조직을 면역 형광 염색하고 광학 투사 단층 촬영(optical projection tomography)을 통해 스캔한 뒤 데이터를 재구성 및 정량화합니다. 최종적으로 개별 종양의 침습 패턴을 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이는 3차원 분석을 통해 추가로 정량화될 수 있습니다. ex vivo 배양의 주요 장점은 생리적 맥락 내에서 실제 암 물질을 사용한다는 점입니다.세포주 배양과 달리, 일차 암 조직은 얻기가 어렵기 때문에 이 기술에 대한 시각적 시연이 중요합니다. 올바른 기술을 적용해야 실험 결과를 성공적으로 도출할 가능성을 최적화할 수 있습니다. type one collagen 추출을 시작하기 위해, 저와 MRC Technology의 Joanne Farrell이 이 기술을 시연하겠습니다.냉동된 쥐 꼬리를 70% ethanol에 넣어 해동합니다. 메스를 사용하여 겉피부를 제거해 힘줄을 노출시킨 뒤, 꼬리에서 힘줄을 분리하여 멸균을 위해 70% ethanol에 넣습니다. 수집된 힘줄의 무게를 측정하고 이를 acetic acid로 옮깁니다.4°C에서 48시간 동안 교반합니다. 다음으로, 건-초산 혼합물을 10,000 ×g에서 30분 동안 원심분리하고 침전물을 제거합니다.S 상층액에 동일한 부피의 10% sodium chloride를 첨가하고 혼합물을 4°C에서 하룻밤 동안 방치합니다. 상층부를 피펫으로 빨아들여 제거합니다. 그런 다음 콜라겐이 풍부한 불용성 하층부를 수집하여 10,000 ×g에서 30분 동안 원심분리합니다.그 후 중력을 이용하여 콜라겐이 풍부한 물질을 4°C의 0.25 M 아세트산에 재현탁하고 피펫으로 투석 막에 옮깁니다. 4°C에서 1:1000 아세트산을 대상으로 3일 동안 투석합니다.투석 버퍼를 매일 2회 교체합니다. 이 분석을 위해 콜라겐을 추가적인 원심분리 단계와 아세트산 내 재현탁을 통해 더욱 멸균할 수 있습니다. 침습성 유방암의 근치적 외과적 절제술 시 동의한 환자로부터 육안 확인 및 메스를 사용하여 채취한 여러 개의 코어 생검 조직으로 시작합니다.조직을 1mm³ 크기의 조각으로 나누고, 육안으로 구분되는 지방은 다듬어 제거합니다. 샘플을 메스 날에 고정하면 후드 내에서 시각화가 용이하며, 정밀하고 안전하게 해부할 수 있습니다. 분리한 조각들을 MEGM 완전 배지에 담급니다.조직은 이 상태로 최대 1시간 동안 보관할 수 있으며, 얼음 위에서 0.3 mg/mL 농도의 콜라겐 겔 믹스를 제조합니다. 1 mg/mL 쥐 꼬리 콜라겐, 1/1000 여과된 아세트산, 10배 D-M-E-M-F 12 및 0.22 M 수산화나트륨을 사용합니다. 콜라겐 혼합물 1.2 mL를 24웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주하고, 37 °C 인큐베이터에 10분 동안 보관합니다. 겔화를 시작하려면 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다.종양 조각들을 겔화되는 콜라겐 위에 올리고, 10 µL 피펫 팁을 사용하여 조각들을 겔 중앙으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 배양합니다. A-M-E-G-M 완전 배지에 beta estradiol을 최종 농도가 3.2 × 10⁻¹⁰ M이 되도록 첨가합니다.겔 분석물을 1시간 동안 배양한 후, 각 웰에 보충 배지 1.2 milliliters를 조심스럽게 넣습니다. 유방 조직에서 발견되는 생리학적 에스트로겐 수준을 재현하기 위해 최종 beta estradiol 농도는 1.6 times 10 to the minus 10 molar로 평형을 이룹니다. 10 microliter 피펫 팁을 각 웰의 내측 가장자리를 따라 돌려 각 겔을 원주 방향으로 분리함으로써, 각 겔이 배지 내에서 자유롭게 뜰 수 있도록 합니다.실험이 종료될 때까지 24-well 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 일주일에 두 번 보충 배지를 교체하십시오. 이 단계에서 명시야 현미경을 사용하여 침습적 성장을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 시간 지연 캡처 확장 초점 깊이(extended depth of focus) 비디오를 통해 7일째부터 9일까지 60시간 동안 종양 가장자리에서 주변 콜라겐으로 상피 세포가 침습하는 모습을 확인할 수 있습니다.배지를 제거하여 실험을 종료하고 고정액을 첨가합니다. 광학 투영 단층 촬영(optical projection tomography)을 위해 3D 분석 샘플을 48시간 동안 면역 염색 고정합니다. 먼저 포르말린으로 고정된 시료를 웰에서 바이알로 옮깁니다.그런 다음 30분 동안 세척합니다. 0.05% Tween 20이 포함된 PBS에 희석한 메탄올을 사용하여 젤의 단계적 탈수를 수행합니다. 자가형광을 제거하기 위해 갓 제조한 메탄올, DMSO, 30% hydrogen peroxide 혼합액(비율 2:1:3)에 조직을 넣고 상온에서 24시간 동안 배양합니다. 다음으로, 샘플을 30분 동안 두 번 세척합니다.조직 깊은 곳의 항원에 접근이 가능하도록 메탄올 내에서 샘플을 -80 °C에서 상온까지 5회 동결-융해하며, 각 회당 최소 1시간 이상 유지합니다. 그 후 메탄올을 희석제로 사용하여 0.05% T-20이 포함된 PBS로 조직을 다시 수화시키고, 상피 성분을 확인하기 위해 4 °C에서 24시간 동안 블로킹 용액에 조직을 배양합니다. 5% DMSO가 포함된 블로킹 용액 1.5 mL에 희석한 rabbit anti-cytokeratin 1차 항체에 샘플을 넣고 4 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 0.05% T-20이 포함된 PBS로 샘플을 24회 세척하며, 각 세척 단계는 30분 동안 수행합니다.5% DMSO가 포함된 블로킹 용액 1.5 milliliters에 희석한 형광 2차 항체에서 조직을 4°C로 48시간 동안 배양합니다. 0.05% PBS로 샘플을 30분씩 24회 다시 세척합니다. 광학 투영 토모그래피(optical projection tomography) 샘플을 준비하기 위해, 염색된 겔을 1% 저융점 agarose에 고정하고 100% methanol에서 24시간 동안 탈수시킵니다.다음으로, BABB 용액에서 48시간 동안 표본을 투명화합니다. OPT 3001 M 스캐너를 사용하여 샘플을 스캔합니다. 타겟과 자가형광은 각각 SI three 및 GFP one 필터 세트를 사용하여 캡처합니다.시편을 투명한 아로겔(aro gel) 실린더에 고정하고 0.9도씩 각도를 조절하며 회전시킵니다. 400개의 회전 위치 각각에서 정지된 시편의 디지털 이미지를 촬영합니다. n recon 소프트웨어를 사용하여 OPT로 획득한 각도 투영 세트를 재구성함으로써 침습 분석(invasion assay)의 연속적인 단면 슬라이스를 생성합니다.Velocity 소프트웨어를 사용하여 재구성된 데이터를 분석함으로써 사이토케라틴(cytokeratin) 염색을 통한 상피 부피를 정량화합니다. 대상 채널의 배경 형광 간섭을 줄이기 위해 최소 복셀 강도 임계값을 설정하십시오. 이 임계값은 경험적으로 9,000 arbitrary units로 정의되었습니다.마지막으로, 측정 애플리케이션에서 사용 가능한 파라미터 목록과 상피 조직이 원래의 코어와 연속적으로 연결되어 있음을 나타내는 자가형광(Autofluorescent) 채널의 데이터를 사용하여 종양 성장부 내 상피 조직의 부피를 정량화합니다. 콜라겐 배양 후 20일째에 고정하여 사이토케라틴(cytokeratin)으로 염색한 전형적인 분석 결과가 여기에 제시되어 있습니다. Velocity 소프트웨어는 원래의 코어와 연속된 상피 덩어리와 분리된 침습 세포 집단을 모두 인식하여 각 부피를 개별적으로 정량화할 수 있습니다.획득한 원래의 생검 조직은 ex Vivi 배양 이후 다양한 종양에서 얻은 것입니다. 증식률이나 세포 사멸 또는 이와 유사한 지표를 결정하기 위해 면역조직화학 또는 면역형광법과 같은 다른 기술을 사용할 수도 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 중개 유방암 연구 분야의 연구자들은 유방암 환자의 약물 내성을 식별하는 방법을 탐구할 수 있게 되었습니다.

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Huang, Y. et. al., 광간섭 단층촬영을 사용한 3차원 종양 스페로이드의 종단적 형태학적 및 생리학적 모니터링. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 광간섭의 사용을 보여줍니다. 단층촬영(OCT)은 고해상도 단면 이미지를 캡처하여 멀티웰 플레이트에서 종양 스페로이드를 모니터링합니다. OCT는 세포 구조에서 반사되는 빛을 분석하여 3D 모델을 구축하여 크기 및 모양과 같은 형태학적 특징을 평가하는 동시에 시간 경과에 따른 광 산란 변화를 기반으로 생존 가능한 세포와 생존 불가능한 세포를 구별합니다.

Optical Coherence Tomography를 사용한 종양 스페로이드의 형태학적 및 생리학적 모니터링 

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

심혈관 질환의 동물 모델에서 동맥 병변의 생체 외 분석은 고전적으로 조직학 및 면역 조직 화학 기술에 의존합니다. 이는 3차원 병변에서 2차원 측정을 제공합니다. 이 원고는 광학 투영 단층촬영을 사용하여 3차원의 정량적 분석을 위한 동맥 병변의 발생에 대해 설명합니다.

생성 및 마우스의 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

환자 유래 오가노이드 (PDO)는 질병의 유전 적 및 표현형 이질성과 개인화 된 항암 요법에 대한 반응을 모두 반영하는 번역 암 연구의 강력한 도구입니다. 여기서, 표현형 분석 및 약물 반응의 평가를 위한 준비로 인간 원발성 방광암 PDOs를 생성하기 위한 통합 프로토콜이 상세히 설명된다.

정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화

우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.

절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

이 프로토콜은 다양한 질병 단계의 난소암 오가노이드 확립을 위한 체계적인 프레임워크를 제공하고 환자별 변동성 문제를 해결하여 수율을 높이고 후속 응용 분야에서 강력한 장기 확장을 가능하게 합니다. 여기에는 조직 처리, 파종, 배지 요구 사항 조정 및 면역형광 염색을 위한 자세한 단계가 포함됩니다.

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

배우세요 광학 프로젝션 단층촬영법을 이용해 인간 유방암 조직을 20일간 장기 배양하고 3차원 침윤 패턴을 정량 분석하는 방법입니다. 이 기술은 개별 종양의 약물 반응을 평가하여 맞춤형 치료에 활용할 수 있습니다.

광학 프로젝션 Tomography를 사용하여 인간 유방암 표본과 그 분석의 장기 문화

더 많은 동영상 탐색