레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

이 절차의 전반적인 목표는 억제성 신경 회로의 국소 기능 조직을 조사하는 것입니다. 이 절차는 생쥐의 1차 체감각 피질에서 살아있는 뇌 절편을 준비하는 것으로 시작됩니다. 다음 단계는 뇌 절편에서 억제성 세포 유형을 발현하는 표적 GFP를 시각화하고 기록하는 것입니다.

글루타메이트를 통한 이 레이저 스캐닝 광 자극에 이어, 언케이징은 흥분성 또는 억제성으로 시냅스전 뉴런의 작은 클러스터를 활성화하는 데 사용됩니다. 시냅스 후 전류는 뉴런 사이를 발현하는 GFP에 기록됩니다. 마지막 단계는 사진 자극, 데이터 분석을 진행하고 기록된 뉴런에 대한 시냅스 입력의 정량적 지도를 생성하는 것입니다.

궁극적으로, 전체 세포 기록과 결합된 레이저 스캐닝 광 자극은 특정 유형의 억제 뉴런에 대한 시냅스 입력의 상세한 지도를 구축할 수 있게 하며, 이를 통해 국소 억제 피질 회로의 조직과 기능을 결정할 수 있습니다. 광 자극 기반 기술은 Dr.Larry Katz, Ned Calloway에 의해 개척되었으며, Dr.Carols Waboda, my pi, Dr.Xing Z에 의해 더욱 개발되었습니다. 우리 그룹은 현재 이러한 연구를 확장하고 계속하여 구강 간 회로를 조사하고 있습니다.

이 절차를 시작하려면 출생 후 2-3 주에 참수하여 형질 전환 마우스를 희생하고 신속하게 뇌를 제거하고 뇌를 냉동 및 산소가 함유 된 절단 용액에 넣습니다. 그런 다음 GFP 고글을 사용하여 뇌를 육안으로 검사하고 GFP 발현을 확인합니다. 다음으로, 바이브레이터를 사용하여 1차 체성 감각 피질을 400마이크로미터 두께의 섹션으로 자릅니다.

섭씨 32도에서 95%O2와 5%CO2로 거품이 일어난 A CSF가 함유된 자당의 슬라이스를 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 슬라이스를 일반 A CSF로 옮겨 실험을 위해 레이저를 준비하고 레이저 냉각 시스템과 전원 공급 장치를 켭니다. 그런 다음 스캐닝 미러 시스템, 광학 변조기 및 전자 셔터, 포토다이오드 입력 증폭기를 포함하여 광 자극 제어와 관련된 모든 하드웨어를 켭니다.

다음으로 멀티 클램프 700 B 증폭기 및 마이크로 매니퓰레이터와 같은 전기 생리학 장비를 켭니다. 전기생리학적 기록, 광 자극 및 이미징은 현미경의 전동 스테이지에 장착된 슬라이스 관류 챔버에서 수행됩니다. 그 후, 이미징 카메라를 켜면 이미징 시스템을 통해 적외선 DIC 및 에피 형광 광학이 있는 직립 현미경에서 슬라이스가 시각화됩니다.

그런 다음 모니터에서 MATLAB 기반 FS 소프트웨어와 Q 캡처 카메라 소프트웨어를 엽니다. 실험을 실행하기 전에 레이저 광 자극 시스템을 점검하고 작동 상태인지 확인하십시오. 4 x microscope objective 아래에 종이 한 장을 놓고 시스템이 실행되는 동안 레이저 스캐닝 패턴을 관찰합니다.

4-6 메가 OM 저항을 가진 마이크로 전극을 만들려면 피펫 풀러로 유리 전극을 당깁니다. 그런 다음 세포 라벨링 및 형태학적 식별을 위해 0.1% 비오틴이 포함된 내부 용액으로 전극을 채웁니다. 다음으로, 가압 관류 시스템을 켜서 A CSF를 챔버 내부로 펌핑합니다.

챔버의 슬라이스보다 2.0mm 높은 유체 레벨이 일정하게 유지되도록 합니다. MNI 케이지 글루타메이트의 원액 분취액을 0.2 밀리몰 케이지 글루타메이트 농도에 대해 25 밀리리터의 순환 A CSF에 첨가합니다. 그런 다음 하나의 뇌 절편을 녹음실로 옮깁니다.

이미징 시스템을 실행하여 절편 품질을 확인하고 해부학적으로 주요 체성 감각 영역을 찾습니다. 다음으로, 맞춤 제작된 현악기 플래티넘 링으로 슬라이스를 고정하고 녹음을 위한 뇌 영역에 앵커를 놓지 않도록 주의하십시오. A DIC 형광 현미경에서 GFP 발현의 시각화를 기반으로 60 x 대물렌즈로 세포를 시각화합니다.

억제성 세포 유형을 식별하고 선택합니다. 녹음은 적외선 DIC의 도움을 받는 시각적 제어 하에 수행됩니다. 전극을 타겟 셀로 낮추면서 GFP 셀의 위치를 확인하기 위해 DIC와 형광 모드 간의 비디오 모니터링 및 전환이 필요합니다.

기존의 패치 클램핑 기술을 사용합니다. 먼저 전극에 양압을 가합니다. 세포 표면 가까이로 이동하여 대상 세포막에 눈에 띄는 딤플을 만듭니다.

그런 다음 음압을 빠르게 가하여 기가 씰을 형성하고 셀을 끊으면서 비디오 모니터에서 현재 주입 반응을 모니터링합니다. 침입 시 온라인 검증을 위해 DIC 및 형광 모드에서 60배 배율로 인트라 뉴런을 발현하는 기록된 GFP의 이미지를 촬영합니다. 광 자극 데이터를 수집하기 전에 과분극 및 탈분극 전류 펄스를 주입하여 각 세포의 기본 전기생리학적 특성을 검사합니다.

일단 안정되면, 일반적으로 20 메가 옴 미만의 우수한 접근 저항으로 전체 세포 기록이 달성되고, 레이저 스캐닝 광 자극을 위해 현미경 대물렌즈를 60 x 배율에서 4 x 배율로 전환하고, 4 x 배율에서 슬라이스 이미지를 획득하고, 광 자극 부위를 안내하고 등록하는 데 사용합니다. phys의 구성 스위치 모듈을 활성화하여 광 자극 및 데이터 수집 매개변수를 설정합니다. 1초의 자극 간격으로 약 20밀리와트의 1밀리초 레이저 펄스를 사용합니다.

광 자극 매핑의 경우, 10kHz에서 샘플링된 1초의 데이터 트레이스를 획득합니다. 다음으로, 4개의 x 슬라이스 이미지를 phys의 매퍼 모듈에 로드합니다. 소마의 위치를 정의하고 16 x 16 패턴의 광 자극 부위를 80, 마이크로미터 x 80 마이크로미터로 설정합니다.

모든 피질층을 덮고 있는 세포 위치 주위의 간격. 그런 다음 현재 클램프 모드에서 광 자극에 대한 반응으로 스파이크 위치를 검사하여 기록된 뉴런의 여기 프로파일을 매핑합니다. 온라인 디스플레이 기능을 갖춘 사용자 친화적인 소프트웨어는 매핑 실험을 용이하게 합니다.

그 후, 기록된 셀에서 흥분성 시냅스 후 전류를 감지하여 국부 흥분 회로 연결을 매핑합니다.다른 위치에서 레이저 스캔을 통해 전압 클램프 모드에서 셀을 음의 70밀리볼트로 유지하여 내부 여기 전류를 감지합니다. 그런 다음 흥분성 시냅스 후 전류 맵을 광 자극 패턴을 회전하거나 뒤집어 2-3회 반복합니다. 국소 억제 회로 연결을 매핑하려면 기록된 세포에서 억제 시냅스 후 전류를 감지합니다.

이 경우 셀을 0 밀리 볼트에 가깝게 유지하고, 전압 클램프 모드에서 음의 15 밀리 볼트로 유지하여 외부 억제 전류를 감지합니다. 모든 생리학적 분석을 완료한 후 기록된 세포에서 전극을 부드럽게 제거합니다. 챔버에서 뇌 절편을 제거한 다음 하룻밤 동안 4%파라 포름알데히드에 고정하고 기록된 세포를 비오틴에 대해 염색합니다.

이 실험에서는 GFP 발현, 고유 전기 생리학 및 형태학적 특성의 조합을 사용하여 억제성 뉴런을 분류합니다. 표시. 다음은 레이저 스캐닝 광 자극을 설명하기 위한 예제와 원시 데이터 맵으로, 이를 통해 기록된 억제 뉴런에 대한 국소 피질 회로 연결을 광범위하게 매핑할 수 있습니다. 다음은 그림 D에 표시된 원시 추적에서 파생된 색상으로 구분된 정량적 입력 맵의 예입니다.기록된 인터 뉴런에서 감지된 시냅스 이벤트의 진폭은 색상으로 구분되고 광 자극 위치에 지형적으로 겹쳐집니다.

세포체 위치는 눈금 막대에서 빨간색 열린 원으로 표시됩니다. 따뜻한 색상은 강한 시냅스 입력을 나타내고 차가운 색상은 표적 세포에 대한 연결이 약하거나 없음을 나타냅니다. 마찬가지로, 그림 E는 기록된 뉴런에 샘플링된 언케이징 위치당 시냅스 이벤트의 수를 나타냅니다.

그림 F는 눈금 막대에서 기록된 세포 사후 광 자극에 대한 첫 번째 감지된 시냅스 이벤트의 시작 시간을 보여줍니다. 따뜻한 색은 짧은 입력, 대기 시간을 나타내고 차가운 색은 더 긴 시냅스 대기 시간을 나타냅니다. 따라서 LSPS를 사용하면 특정 유형의 억제 뉴런에 영향을 미치는 위치, 강도, 대기 시간 및 입력 수에 대한 상세한 맵을 구축할

글쎄,이 절차에 참석하는 것은 인내심을 갖고 깨끗한 실험 조건을 만드는 것이 중요하지만 뉴런은 물체 고배율에서 저배율로 효과적이고 신중하게 변경하는 것이 중요합니다. 그런 다음 토지 소프트웨어의 마지막 사용은 아주 잘합니다.