쥐 피질 뉴런에서 Filamentous Actin Puncta의 정량화

폴리머 코팅된 유리 바닥 접시에 쥐 일차 피질 뉴런을 취합니다.

세포 구조를 보존하기 위해 파라포름알데히드로 뉴런을 고정합니다.

과도한 파라포름알데히드를 씻어냅니다.

세포를 투과화하기 위해 비이온성 세제를 첨가하십시오.

구조 단백질인 필라멘트 액틴 또는 F-액틴을 표적으로 하는 녹색 형광 염색제로 세포를 처리합니다.

여분의 얼룩을 제거하십시오.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단제를 도포합니다.

수지상 단백질을 표적으로 하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거합니다.

적색 형광단 접합 2차 항체를 첨가하여 1차 항체에 결합합니다. 과도한 항체를 씻어냅니다.

형광 염료를 바르고 핵을 염색합니다. 결합되지 않은 염료를 제거합니다.

형광단 광표백을 방지하기 위해 퇴색 방지 시약을 추가합니다.

형광 현미경을 사용하여 뉴런의 이미지를 캡처합니다.

표지된 수상돌기 내에서 F-액틴이 풍부한 영역을 식별합니다.

소프트웨어를 사용하여 F-액틴 점점 또는 반점을 계산하고 수지상의 길이를 수동으로 추적하여 F-액틴 밀도를 계산합니다.

실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정한 후 PBS 세척을 2회 수행합니다. 다음으로, PBS에서 0.1% Triton X-100으로 세포를 5분 동안 투과화하고 실온에서 F-액틴 특이적 염색으로 표지합니다. 20분 후, PBS로 세포를 두 번 헹구고 10% 정상 염소 혈청으로 비특이적 세포 표면 염색을 차단합니다.

배양이 끝나면 닭 다클론 항-MAP2 항체로 섭씨 4도에서 밤새 세포를 표지합니다. 다음날 아침, PBS로 세포를 두 번 헹구고 적절한 2차 항체로 표지합니다.

실온에서 2시간 후, 세포를 PBS로 다시 헹구고 실온에서 3분 동안 10마이크로리터의 Hoechst로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 PBS로 세포를 마지막으로 두 번 세척하고 100마이크로리터의 퇴색 방지 시약으로 보존합니다.

염색 후 3일 이내에 형광 현미경을 켜고 20x 대물렌즈를 선택합니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어에서 픽셀 이미지 크기를 1,600 x 1,200으로 설정하고 픽셀당 0.17미크론 이미지 해상도를 1배 줌으로 설정합니다. 세포 접시를 현미경 스테이지로 옮기고 녹색 및 빨간색 형광 채널 아래에서 공동 표지된 F-액틴 MAP2 뉴런의 이미지를 획득합니다.

모든 이미지를 얻었으면 명확하게 정의된 수지상 아버가 있는 녹색, 빨간색 및 파란색 채널에서 개별 뉴런의 5개