Name: Preparación de ADN viral de nucleocápside (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprende a aislar ADN de nucleocápside de herpesvirus de alta pureza mediante ultracentrifugación y extracción con fenol-cloroformo. Este método permite obtener ADN concentrado sin contaminación del hospedero para secuenciación y transfecciones.

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Los autores agradecen las contribuciones de Greg Smith, Lisa Pomeranz, Lyman Matt, Eldridge Marlies, Halina Staniszewska Goraczniak, y los miembros del laboratorio de Enquist en el perfeccionamiento de este protocolo.

1. Primer Día: infección viral y preparación de tampones <ol><li> Preparar platos 50-10 (15 cm de diámetro) de las células de cultivo de tejidos para la infección, por ejemplo, células PK-15 para el virus de la pseudorrabia (PRV) o de células Vero de virus del herpes simple (VHS). </li><li> Cuando las células son de 95 - 100% confluentes, que infectan a un (MOI) de 5.10. Para ello, vacunar a cada plato con stock de virus en un volumen total de 4 ml por placa, y luego se incuban las placas durante 1 hora a 37 ° C. Placas de roca suavemente cada 15 minutos para asegurarse de que la monocapa celular sigue siendo totalmente recubierto por el inóculo de virus. Mientras tanto, calentar el medio para el siguiente paso. </li><li> Después de una hora de la infección, aspiración de inóculo viral de las placas, agregar 15 ml de medio caliente, y se incuba a 37 ° C durante 12-20 horas en un incubador humidificado. </li><li> Preparar buffers LCM (ver Tabla 1) y el rock la noche a 4 ° C para la mezcla completa. Prepare TNE para la resuspensión de ADN viral (ver Tabla 2). </li></ol> 2. Segundo día, Fase 1: lisis celular y ultracentrifugación <ol><li> Confirmar visualmente que la infección de las células ha causado un efecto uniforme citopático (CPE). Permitir la infección de progreso hasta que todas las células tienen rodeados, pero no han quitado la placa. </li><li> Raspar las células infectadas en el medio, y se combinan células y el medio en tubos de 50 ml cónicos. El número de tubos cónicos necesario para este paso dependerá de la cantidad de los platos utilizados para la infección en el Paso 1.2, por ejemplo, un tubo de 50 ml cónicos se puede utilizar para precipitar un máximo de tres platos de medio de 15 ml cada uno. Opcional: Enjuague el placas con 10 ml de PBS y se combinan con las células y medianas empresas. </li><li> Centrifugue las células y medio durante 10 minutos a 2000 la fuerza relativa centifugal (FCR) a temperatura ambiente, y aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 10 ml de PBS. Si el sedimento de una infección viral se extendió en varios tubos cónicos en el Paso 2.2, estos se pueden recombinar en un tubo cónico en este paso. Repetir la centrifugación y la aspiración. Opcional: Esta pastilla puede ser almacenado a -20 ° C y el protocolo seguido en un momento posterior. </li></ol> 3. Segundo día, Fase 2: Ultracentrifugación Mantener el sedimento celular y tampones LCM en hielo siempre que sea posible durante los siguientes pasos. <ol><li> Añadir β-mercaptoetanol al glicerol 0% - búfer LCM. Empieza a enfriar a la ultracentrífuga (para el paso por debajo de 3,9) mediante el establecimiento a 4 ° C y girando en el vacío. </li><li> Resuspender el botón celular en 5 ml de glicerina de 0% - búfer LCM hasta que ya no es abultada. Si es necesario, el tubo de vórtice para romper cualquier disolver el sedimento celular. </li><li> Extraer mediante la adición de 1,5 ml de freón (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoro) y agitación vigorosa. Inmediatamente se centrifuga durante 10 minutos a 2000 fcr a una temperatura de 4 ° C. Recoger la capa superior con una punta de pipeta de gran calibre (evitando la interfaz) y la transferencia a un nuevo tubo. Opcional: Si el pellet es un sólido gelatinoso, usted puede verter la capa superior en un nuevo tubo. </li><li> Repetir la extracción de freón y centrifugar de nuevo. </li><li> Recoger la capa superior (~ 5 ml) y transferir a un tubo de ultracentrífuga polyallomer nuevo. Añadir β-mercaptoetanol al glicerol dos restantes - buffers LCM. </li><li> Preparar un gradiente en el tubo de centrífuga polyallomer underlaying por el extracto de freón (capa superior) con 3 ml de glicerol al 5% - LCM (capa media), y luego underlaying de nuevo con 2,5 ml de 45% de glicerol - LCM (capa inferior). Use una pipeta fina para evitar el desbordamiento de los contenidos del tubo. </li><li> Si es necesario, prepare un tubo de equilibrio equivalente con las mismas proporciones de búferes de LCM. </li><li> La transferencia de los tubos en los cubos de ultracentrifugación. Balance de cubos de 0,1 g de cada uno, añadiendo lentamente glicerol extra 0% - búfer LCM a la capa superior (~ 50 a 100 l en un momento). </li><li> Usando una ultracentrífuga frío con un rotor de cubeta horizontal o basculante, girar las muestras equilibrada durante 1 hora a 77.000 RCF (por ejemplo, 25.000 rpm para un rotor SW41Ti) a una temperatura de 4 ° C. </li><li> Durante la ultracentrifugación, hacer un gancho de vidrio para capturar el ADN flotante en la etapa de precipitación con etanol (4.6). Sostenga los dos extremos de una pipeta Pasteur de vidrio y la suspensión de la sección media sobre una llama. Cuando una sección del vaso está casi fundido, tire suavemente para estirar el vidrio, doble suavemente para crear un gancho fuertemente inclinadas (&lt;90 grados), y tirar fuertemente para sellar el final. Si la punta del gancho de vidrio está abierta, mantenga la punta sobre la llama para que el vidrio se funde lo suficiente como para cerrarla. </li><li> Después de la ultracentrifugación, debería ver un fino precipitado opaco, con una mancha oscura en el centro. Con cuidado aspirar el líquido del tubo, incluyendo grasa a lo largo de los lados, pero evitando los pellets en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 0,5 ml TNE a temperatura ambiente. </li><li> Deje que el pellet se siente por lo menos 10 minutos para permitir la hidratación de la pastilla. Opcional: La pastilla también podría volver a suspender en TNE noche a la mañana, si se conserva a 4 ° C. </li></ol> 4. Tercer Día: "Ghost" ADN Precipitaciones <ol><li> Romper el pellet con la pipeta con una punta de pipeta de pequeño calibre (por ejemplo, una punta de la pipeta p200). No te preocupes por corte en este paso, ya que el ADN viral es todavía contenida en cápsides en este momento. Añadir los siguientes reactivos al tubo que contiene el virus de pellets, a temperatura ambiente, para destruir cápsides: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml de 10% SDS </li><li> 2 mg de proteinasa K </li></ul> Agite suavemente para mezclar los reactivos. Debe haber un ligero aumento de la viscosidad. </li></ol> Tenga cuidado con los de corte a partir de ahora, por ejemplo, el uso de gran calibre pipetas y no agite el material viral <ol start="2"><li> Extracto de proteínas virales mediante la adición de 5 ml de fenol-cloroformo y empezar inmediatamente a invertir o agitación para mantener una emulsión. Mezclar durante 10 segundos, centrifugar la emulsión durante 5 minutos a 2000 fcr a temperatura ambiente. Recoger la capa superior con una punta de gran calibre la pipeta, evitando la interfaz, y la transferencia a un nuevo tubo. Opcional: Use la fase de bloqueo de gel (PLG) en los tubos de este paso para evitar la contaminación de la interfaz. </li><li> Repetir la extracción con fenol-cloroformo y centrifugar de nuevo. </li><li> Después de la segunda extracción con fenol-cloroformo, recoger la capa superior en un tubo de 30 ml de cristal Corex y enfriar el tubo a -20 ° C durante 10-15 minutos, teniendo cuidado de que no se congela. </li><li> Añadir 10 ml de etanol helado, cubrir el tubo (por ejemplo, se extiende un trozo de Parafilm M en la parte superior), e invierta para mezclar inmediatamente. Esté atento a un ADN "fantasma" que aparecen, que consiste en un precipitado viscoso delgada. Invertir el tubo suavemente para mezclar aún más y hacer que el ADN pegajoso precipita a agruparse. </li><li> Utilice un gancho de vidrio para capturar el fantasma del ADN (s). Cuidadosamente blot el ADN para eliminar el exceso de líquido, a continuación, coloque el gancho (la punta hacia abajo) en un tubo de 1.5 ml y dejar secar. Añadir 0,25 a 0,5 ml de TE para disolver el fantasma del ADN. Permitir la resuspensión de ADN para proceder de al menos una hora. ADN se almacenan a 4 ° C. Opcional: Para maximizar el rendimiento de ADN, se rompe el gancho de vidrio en el tubo de 1.5 ml, de modo que la resuspensión de los fragmentos de vidrio pueden seguir el paso del tiempo. </li></ol> 5. Resultados representante Con un alto MOI suficiente, las células deben lograr la plena CPE dentro de ~ 18 horas post-infección (hpi) para cepas de tipo salvaje PRV, y ~ 24 hpi de tipo salvaje cepas de HSV-1 (Figura 1). Una vez que el pellet de células infectadas se cosecha, el resto de pasos del protocolo se puede completar en un día largo o llevado a cabo durante dos días (Figura 2). En la preparación de los ganchos de vidrio para capturar el fantasma del ADN, es importante que el ángulo de gancho de ser inferior a 90 grados, para que después pueda caber en la base de un tubo de 1.5 ml (Figura 3). Sellado de la punta de este gancho previene la pérdida de ADN dentro de la pipeta. Los fantasmas de ADN se forman durante la etapa de precipitación y aparecerá como hilos blancos, viscosa (Figura 4). Estos agregados y se adhieren entre sí y / o el gancho de vidrio utilizado para capturar el ADN. Así, el gancho de vidrio mismo se puede utilizar para reunir varios hilos de ADN dentro de la solución de precipitación. <table border="1"><tbody><tr><td> Elija columna basada en el volumen deseado: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 l </td><td> 450 l </td><td> 600 l </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> MgCl2 1M </td><td> 50 l </td><td> 75 l </td><td> 100 l </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 l </td><td> 15 l </td><td> 20 l </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 l </td><td> 75 l </td><td> 100 l </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol (agregue inmediatamente antes del uso) </td><td> 4,3 l </td><td> 6,5 l </td><td> 8,6 l </td><td> 17,2 l </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Usar proporciones para el glicerol por ciento deseado (0, 5, o 45%) </td></tr><tr><td> 0% de glicerol </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td> de agua </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> 5% de glicerol </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> de agua </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> de agua </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Recetas para la preparación de tampones LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Por volumen de 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml de NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2,5 ml de 1M Tris, pH 7,5 </td></tr><tr><td> Una de 0,5 ml con EDTA </td></tr><tr><td> 41,5 ml de H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Preparación de la TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Para el volumen 1 L </td></tr><tr><td> 0,2 g de KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g de KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g de NaCl </td></tr><tr><td> 1,15 g de Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O a 1 litro </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Preparación de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4 pH 7,0) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. PK15 células (A) antes de la infección, (B) a mitad de la infección, y (C) en el efecto citopático (CPE), después de una multiplicidad de infección. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Descripción general del protocolo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Tres ejemplos representativos de vidrio anzuelos utilizados para recoger los fantasmas del ADN viral. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ejemplo representativo de un ADN bien formado y abundante "fantasma".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Algunas partes de este protocolo fueron desarrollados originalmente para el aislamiento de ADN viral en BSL4 condiciones, pero se adapta igualmente bien a los no-BSL condiciones. 4 Se suelen usar este protocolo para aislar el ADN de la PRV alfa-herpesvirus y el VHS-1, que tienen genomas de ADN encerrado en una cápside proteica y rodeado por una envoltura lipídica. 7,8 Sin embargo, es probable que directamente adaptables a otras grandes virus de ADN, incluyendo beta-y gamma-herpesvirus y adenovirus....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Freón (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoro) </td><td> Pescador </td><td> T178-4 </td><td> Verifique con su institución para las instrucciones sobre la eliminación adecuada de los desechos que contengan freón, o ver Mendez et al. alternativas posibles freón. 9 </td></tr><tr><td> Fase de bloqueo de los tubos de gel, la capacidad de 15ml pesado </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Opcional </td></tr><tr><td> Polyallomer tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Seleccione los tubos adecuados para su propia ultracentrífuga, los cuales se incluyen a título de ejemplo </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> Células PK-15 </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Las células Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de adn viral de nucleocápside

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Los virus son parásitos obligados celular, y por lo tanto el estudio de su ADN requiere aislar material viral de distancia de los contaminantes de la célula huésped y el ADN. Varias aplicaciones posteriores requieren grandes cantidades de ADN viral pura, que es proporcionada por este protocolo. Estas aplicaciones incluyen la secuenciación del genoma viral, donde la extracción de ADN del huésped es crucial para optimizar la salida de datos de secuencias virales, y la producción de nuevas cepas virales recombinantes, 1,2, donde la co-transfección de ADN purificado viral y plásmido lineal facilita la recombinación., 3 Este procedimiento utiliza una combinación de extracción y la densidad basado en la centrifugación para aislar ADN purificado herpesvirus nucleocápside lineal de las células infectadas. 4,5 Los pasos de la purificación inicial objetivo de aislar a cápsidas virales purificados, que contienen y protegen el ADN viral en las extracciones y los pasos de centrifugación que eliminan las proteínas celulares y el ADN. Lisis de la nucleocápside libera el ADN viral, y dos finales de fenol-cloroformo pasos eliminar las proteínas restantes. El final de ADN capturado de la solución está muy concentrado y puro, con un promedio de 260/280 OD de 1,90. Dependiendo de la cantidad de células infectadas, los rendimientos de la gama de ADN viral 150 a 800 mg o más. La pureza de este ADN hace que sea estable durante el almacenamiento a largo plazo a 4 ° C. Este ADN es por lo tanto ideal para el alto rendimiento de secuenciación de alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfección. Antes de comenzar el protocolo, es importante conocer el número promedio de células por plato (por ejemplo, un promedio de 8 x 10 6 células PK-15 en un plato cm confluentes 15), y el título de la acción viral para ser utilizado ( por ejemplo, 1 x 10 8 unidades formadoras de placas por ml). Estos son necesarios para calcular la multiplicidad apropiado de la infección (MOI) para el protocolo. 6 Por ejemplo, para infectar a un plato de 15 cm de células PK-15 con la acción viral por encima, en una MOI de 5, se utiliza 400 l de stock viral y la mezclan con 3,6 ml de medio (volumen de inoculación total de 4 ml para una placa de 15 cm). Múltiples preparaciones de ADN viral se puede preparar al mismo tiempo. El número de preparaciones simultáneas está limitado sólo por el número de tubos en poder del rotor ultracentrífuga (uno por virus, consulte el paso 3.9 más adelante). A continuación se describe el procedimiento como si se hace por un virus.

Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

Preparación de ADN viral de nucleocápside

Los virus son parásitos celulares obligatorios y, por lo tanto, el estudio de su ADN requiere aislar el material viral de los contaminantes y del ADN de la célula huésped. ...

Este video demuestra un procedimiento para aislar con alta pureza el nucleocápsido viral y el ADN a partir de células infectadas. Primero, las membranas lipídicas se desnaturalizan utilizando una extracción doble con fenol. Luego, la muestra se ultracentrifuga para sedimentar los nucleocápsidos virales y separarlos de los componentes celulares y virales más livianos.Se añaden detergentes y proteína K para liberar el ADN viral de los nucleocápsides sedimentados. Luego, se realizan extracciones duales con fenol-cloroformo para eliminar todas las proteínas restantes. Finalmente, el ADN viral se precipita en solución.En última instancia, los resultados muestran que se ha aislado ADN viral altamente concentrado y puro a partir de estas células infectadas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes que no implican extracciones libres de enzimas o ultracentrifugación, es que el ADN viral obtenido presenta niveles muy bajos de contaminación con ADN del huésped, lo que lo hace ideal para procedimientos posteriores como la PCR y la secuenciación profunda de genomas virales. Utilizamos este método por primera vez en los inicios del trabajo con ADN recombinante, cuand

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Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus

Genómica de virus individuales (SVG) es un método para aislar y amplificar los genomas de los viriones individuales. Suspensiones virales de un conjunto mixto se ordenan mediante citometría de flujo en un portaobjetos de microscopio con pozos discretas que contienen agarosa, capturando así el virión y la reducción del genoma cizallamiento durante el procesado posterior. Amplificación del genoma completo se logra mediante la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) resultante en el...

Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando &quot;Genómica solo virus &#39;

Fuente: Dembowski, J. A., et al. Purificación de ADN viral para la identificación de proteínas virales y celulares asociadas. J. Vis. Exp. (2017).Este video demuestra el aislamiento de complejos de ADN viral–proteína a partir de núcleos celulares mediante química click y purificación con perlas magnéticas. El protocolo incluye la marcación de genomas virales con nucleótidos modificados con alquino, biotinilación mediante una reacción click y unión a perlas magnéticas recubiertas con...

Aislamiento de proteínas a partir de complejos ADN viral-proteína

Fuente: Gao, Y., et al. Generación y Ensamblaje de Nucleocápsides Específicos del Virus del Virus Sincitial Respiratorio. J. Vis. Exp. (2021)El video demuestra el ensamblaje in vitro de nucleocápsides específicas del virus a partir de un complejo purificado de nucleoproteína–fosfoproteína libre de ARN, su purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaño y la validación del ARN viral de longitud completa dentro de las partículas ensambladas.

Reconstitución in vitro y purificación de partículas similares a la nucleocápside viral

En este video, describimos un procedimiento para realizar una nanoinyección de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo en moscas Drosophila macho adultas y posteriormente estudiar las respuestas antivirales iniciadas debido a la infección. El análisis de la reacción en cadena de la polimerasa identifica la regulación positiva de genes específicos en las moscas infectadas que indican la activación de vías de respuesta inmunitaria, incluida la interferencia de ARN y la señalización...

Nanoinyección viral intratorácica para estudiar las interacciones huésped-virus en moscas adultas

Aquí, se presenta un protocolo para crear un cromosoma artificial bacteriano infeccioso que contiene un ADNc de longitud completa del ARN genómico de cadena positiva del virus de la encefalitis japonesa. Este protocolo se puede utilizar para construir un ADNc funcional de otros virus de ARN de cadena positiva, lo que lo convierte en una poderosa herramienta genómica para estudiar la biología del virus.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Proporcionamos una estrategia novedosa para aislar compartimentos de replicación viral (RC) de células humanas infectadas con adenovirus (Ad). Este enfoque representa un sistema libre de células que puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la replicación y expresión del genoma viral, así como la regulación de las interacciones viral-huésped establecidas en el RC.

Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.

Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación

El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

Aquí presentamos un nuevo enfoque para identificar virus con genomas de ADN de doble cadena. Usamos métodos estándar para extraer el ADN y el ARN de hojas infectadas y llevar a cabo la secuenciación de próxima generación. Herramientas bioinformáticas montan secuencias en contigs, identifican contigs representación de genomas del virus y asignan genomas a grupos taxonómicos.

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

Para el análisis mecánico profundizado de la síntesis sincitial respiratoria del ARN del virus (RSV), divulgamos un protocolo de utilizar la fosfoproteína de la chaperona (p) para el coexpression de la nucleoproteína ARN-libre (N0)para el montaje in vitro subsecuente de las nucleocápsides virus-específicas (NCs).

Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial

Aprende a aislar ADN de nucleocápside de herpesvirus de alta pureza mediante ultracentrifugación y extracción con fenol-cloroformo. Este método permite obtener ADN concentrado sin contaminación del hospedero para secuenciación y transfecciones.

Preparación de ADN viral de nucleocápside

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