G 단백질 결합 수용체에 작용제 활동 Quantifying

이 절차의 전반적인 목적은 농도-반응 곡선 분석을 통해 수용체의 활성 상태에 대한 작용제의 상대적 친화도 상수 KB를 추정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 G-단백질 결합 수용체에서 반응을 유도하는 일련의 작용제들에 대한 농도-반응 곡선을 측정합니다. 다음 단계는 비선형 회귀 분석을 사용하여 작용제들의 eemax 및 EC 50 값을 추정하는 것입니다.

이 값들은 이후 작동 모델(operational model)을 이용한 비선형 회귀 분석을 위한 초기 매개변수 추정치를 계산하는 데 사용됩니다. 마지막 단계로, 작용제들의 농도 반응 곡선에 대한 전역 비선형 회귀 분석을 통해 수용체의 활성 상태에 대한 작용제의 친화도 상수의 상대적 추정치를 얻습니다. 최종적으로, 작동 모델의 수정된 형태를 사용하여, 다른 작용제와 비교하여 수용체 활성 상태에 대한 특정 작용제의 친화도 상수를 농도 반응 곡선의 전역 비선형 회귀 분석을 통해 추정할 수 있습니다.

이 방법은 작용제가 특정 신호 전달 경로에 대해 선택성을 가지는가와 같은 약물 발견 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 수학적 분석의 세부 사항으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 상대적 작용제 KB 값을 추정하려면 최소 두 개 이상의 작용제 농도 반응 곡선 시리즈가 필요합니다.

이러한 실험에 관한 고려 사항은 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 반응 곡선을 얻은 후, 각 작용제 농도에서 측정된 반응에서 기저 반응을 빼고, 농도 반응 실험 데이터를 데이터 테이블에 입력하기 시작하십시오. Prism 소프트웨어에서는 모든 작용제의 로그 농도 값을 X로 표시된 열에 입력합니다. 최대 반응 또는 eax 값이 가장 큰 것으로 보이는 작용제의 반응 측정값은 A열에 입력하고, 다른 작용제들의 측정값은 인접한 알파벳 열에 입력합니다.

농도 반응 곡선의 반복 측정값을 지정된 알파벳 열의 하위 열에 입력하십시오. 데이터가 플롯된 그래프 시트를 선택하고 '분석(analyze)'을 선택하여 가변 기울기 방정식(variable slope equation)을 이용한 비선형 회귀 분석으로 데이터를 분석하며, 이때 parameter bottom을 0으로 설정하여 회귀 분석을 수행하십시오. 초기 파라미터 추정치 계산에 사용할 top과 log EC 50 파라미터를 기록하십시오.

초기 파라미터 추정치를 계산하려면, 관찰된 log tau K를 표준 작용제의 negative log EC 50 값으로 지정하십시오. 다음으로, 각 테스트 작용제의 log RAI 값을 테스트 작용제의 eemax 값과 표준 작용제의 EC 50의 곱을 표준 작용제의 emax 값과 테스트 작용제의 EEC 50의 곱으로 나눈 값의 로그 값으로 계산하십시오. 이 식에서 표준 작용제의 파라미터는 아포스트로피(')로 표시됩니다.

그런 다음 테스트 작용제의 로그 친화도 상수를 각 EC 값의 음의 로그 값으로 할당하십시오. Prism에 데이터를 입력한 후, EMAX 값이 가장 큰 작용제의 데이터를 A열에 입력했는지 확인하십시오. 이 작용제는 이제 표준으로 지정되며, 나머지 작용제들은 테스트 작용제로 지정됩니다. 다음으로, 사용자 정의 방정식 log, RAI를 Prism의 여러 줄에 입력하십시오.

이 사례에서 사용자 정의 방정식에는 총 5가지의 작용제가 포함됩니다. 수용체 R의 초기 매개변수 추정값과 테스트 작용제의 친화도 상수를 입력하십시오. M sis에는 표준 작용제의 EMAX 값이 할당되며, M에는 1의 값이 할당됩니다.

이제 테스트 작용제의 log RAI 값에 대한 초기 파라미터 추정치를 입력합니다. log K1을 0으로 제한하고, log GR, m, sis 및 M을 모든 데이터 세트에 대해 동일한 값으로 설정하여 파라미터 제약을 적용합니다. 다음으로, 비선형 회귀 분석을 시작합니다.

결과를 통해 관찰된 log K 및 log RAI 값을 얻어, 역 몰 단위(inverse molar units)의 절대 단위로 작용제 KB 값을 추정하며, 이때 구성적 수용체 활성을 나타내는 세포 기반 인 비트로(vitro) 분석법이 사용됩니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 작용제를 선택하고 실험을 설계하십시오. 구성적 수용체 활성과 각 작용제 농도에 대한 반응은, 여기에 제시된 수용체가 형질전환되지 않은 세포의 기저 반응을 측정된 반응에서 뺀 값으로 계산하십시오. 예비 분석을 위해, 매우 낮은 구성적 활성을 보이는 신호 전달 경로에 대해 이러한 방식으로 계산된 다양한 작용제에 대한 반응 결과입니다.

먼저, 비구성적 활성에 대해 설명된 대로 데이터를 Prism에 입력하십시오. 확인을 누릅니다. 또한, -20의 로그 효능제 농도에 해당하는 행의 적절한 알파벳 열에 구성적 수용체 활성으로 인해 유발된 반응 값을 입력하십시오. 여기서는 효능제 농도 0에 근접하게 하기 위해 큰 음수의 로그 값을 입력합니다.

구성적 활성(constitutive activity)의 경우 parameter bottom을 모든 데이터 세트에서 공유하도록 제한하는 것을 제외하고, 이전과 동일하게 데이터를 분석하십시오. 공유 파라미터뿐만 아니라 각 작용제(agonist)에 대한 parameter top 및 log EC를 기록하십시오. 별도의 실험을 통해 표준 작용제의 log 친화도 상수를 결정한 후, 각 부분 작용제(partial test agonist)의 log K observed 초기 추정치를 다음과 같이 계산하십시오. 표준 작용제의 emax 값과 테스트 작용제의 emax 값의 차이를, EC 50와 표준 작용제의 emax 값 및 구성적 반응(constitutive response) 간의 차이의 곱으로 나눈 값의 로그값을 구합니다.

각 효능제에 대한 log KB의 초기 추정값과 효능제 KB 값을 추정하기 위한 log T cis의 초기 추정값을 계산하십시오. 데이터를 Prism에 입력한 후 사용자 정의 방정식을 입력하십시오. 두 가지 효능제 조건에 대해 여기에서 시연하는 바와 같이 Prism의 여러 행에 Log KB를 입력하십시오.

다음으로, 각 효능제의 친화도 상태를 입력하여 초기 매개변수 추정치를 입력합니다. log T sis 추정치, M sis 추정치 및 M 추정치에서 M sis에는 표준 효능제의 EMAX 값이 할당되고 M에는 1의 값이 할당됩니다. 마지막으로, log kb의 초기 추정치를 입력합니다.

log K1을 이전에 결정된 값으로 제한하고, log Tsis, msis 및 M을 모든 데이터 세트에 대해 공통 값으로 설정하여 파라미터 제약 조건을 적용합니다. 비선형 회귀 분석을 시작합니다. 분석 결과로 표준 효능제의 log KB, 관찰된 log K 및 부분 효능제의 log KB 값이 산출됩니다.

여기에서 제시된 작동 모델의 시스템 최대 반응, 유리 수용체 복합체에 대한 log T cys 값 및 트랜스듀서 기울기 계수는 M3 무스카린 수용체를 안정적으로 발현하는 중국 햄스터 난소 세포에서 무스카린 작용제에 의해 유도된 포스포이노시티드 가수분해입니다. 선택된 무스카린 작용제들의 농도 반응 곡선을 이 분석법으로 측정하였으며, Oxotremorine M의 값에 상대적인 각 작용제의 KB 값을 추정하기 위해 데이터를 여기 설명된 대로 분석하였습니다. 이론적 곡선은 데이터에 대한 회귀 방정식의 최소 제곱 적합을 나타냅니다. kabale, a recline, pilocarpine 및 McNeil에 대한 log RAI 추정치가 표시되어 있습니다.

A 3, 4 3. 시스템의 최대 반응 및 트랜스듀서 기울기 계수의 해당 추정치를 결정하였습니다. 또한 표시된 각 작용제에 대해 관찰된 log K 값을 구하였습니다.

HC 2 93 세포에서 무스카린 작용제(muscarinic agonist)로 자극된 포스포이노시티드 가수분해 실험 결과입니다. G alpha 15를 안정적으로 발현시키고 M three 무스카린 수용체를 일시적으로 발현시켰을 때 기저 포스포이노시티드 가수분해의 증가가 나타났으며, 이는 수용체의 구성적 활성(constitutive receptor activity)에 의한 것으로 분석되었습니다. 데이터 분석을 통해 Oxo Tremaine M 및 MacNeil, A 3 43의 log KB 값을 추정하였습니다.

이론적 곡선은 데이터에 대한 회귀 방정식의 최소제곱 적합을 나타냅니다. Oxo Tremoring M 및 McNeil, A 3 43에 대한 log KB 추정치가 표시되어 있습니다. 또한 McNeil A 3 43의 K 관측값 추정치도 결정되었습니다.

이 데이터 분석 기법을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 단 몇 분 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 G 단백질 결합 수용체의 신호 전달 경로 하위 단계에서 반응을 유도하는 효능제의 농도 반응 곡선으로부터 상대적 및 실제 KB 값을 추정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.