Name: Peroxidative와 산화히드록실 급진적 Footprinting에 의해 RNA 구조의 모니터링 평형 변경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: 배우세요 하이드록실 라디칼 풋프린팅을 이용한 RNA 삼차구조 형성 정량화 방법입니다. 말단 라벨링, 겔 정제, Fenton 시약 처리 후 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 절편을 분석합니다. 이 기법은 RNA 접힘 동역학과 Mg(II) 의존적 구조 안정성 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 건강 RO1 - GM085130 국립 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) MCB0929394에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 그녀의 환대와 그녀의 실험실에서 영화 우리에게 허용에 대한 박사 메리언 슈미트 감사합니다.

1. Footprinting의 시약의 준비 <ol><li> 100 MM 나트륨 cacodylate, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M KCl을 포함 10X 반응 버퍼를 준비합니다. 7.4로 산도를 조정합니다. 0.2 μm의 아세테이트 필터 장치 (Nalgene)를 사용하여 버퍼를 필터링합니다. 비고가 : 10X 버퍼에 직접 pipet의 RNA를하지 않습니다. </li><li> 로 표 1에 표시된 각 반응에 대한 적정 반응 믹스를 준비합니다. 적정 믹스의 볼륨 (원하는 농도에 1X 버퍼와 MG (II)는) 1X 버퍼에서 RNA의 10μl를 추가하기 전에, 90 μl해야합니다. </li><li> 6.63M 요소, 20mM 나트륨 구연산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1mM, 0.25 μg / μl tRNA, 0.025 %의 크실렌의 cyanol, 그리고 0.025 %의 bromphenol 블루를 포함하는 RNAse T1의 소화 버퍼를 준비합니다. 이 버퍼는 최대 6 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 펜톤 반응은 250 MM 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 500 MM 나트륨 L - 아스코 브 산의 신선한 수성 솔루션을 필요로합니다. 농도는 제 1에 명시된0.5은 래디 칼의 다양한 이가의 이온 농도를 청소하지 않는 등 나트륨 cacodylate로 버퍼에 평형 실험에 최적입니다. </li><li> peroxidative (1.5.1)과 산화 (1.5.2) footprinting 반응에 대한 시약. <ol><li> peroxidative 펜톤 반응은 100 MM 철 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션, 50 MM 나트륨 L - 아스코 브 산 및 1.5 % H 2 O 2의 신선한 수성 솔루션을 필요로합니다. 철 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션은 철분 이상의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1.1 배 초과를 가질 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 혼합 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2 준비가되어 있습니다. </li><li> 그냥 산화 절단 반응 (3.4.2)를 시작하기 전에 μl 철 2 μl (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 ㎜), EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2.2 μl (250 ㎜), 62.5를 결합하여 펜톤 반응 믹스를 만들 나트륨 L - 아스코 브 산 (500 ㎜), 22.5 μl 반응 10X 버퍼와 0 footprinting 반응 혼합물 (3.4.2)에 최종 농도에 도달하는 H 2 O의 135.5 μl.10 MM, 0.11 MM, 그리고 6.61 MM, 각각. </li></ol></li></ol> 2. Footprinting 실험을위한 RNA 준비 <ol><li> 짧은 50 세포핵 (DNA 통합 기술, www.idtdna.com에서 예) 구입할 수있다면 RNA는 DNA 템플릿 6 시험 관내 전사의 표준에 의해 생산 또는 수 있습니다. footprinting 실험 중에 RNA의 샘플 무결성을 유지하는 것이 좋습니다 실험실 청결 절차를 따르십시오. 7 </li><li> 체외 베꼈는데 RNA에의 Dephosphorylation 8 이전 RNA의 5 '끝에 32 P 라벨이 필요합니다. RNA 10 pmol는 kinasing에 의해 최종 분류됩니다. 9 솔루션은 인산 가수 분해 효소의 불활 성화 성공 후 뿌연한다. </li><li> denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 radioactively 레이블 RNA 정화. RNA는 0.3 M의 아세트산 나트륨 (산도 5.5) 사용하여 두 후속 젤 extractions하여 복구할 수 있습니다. RNA는 1 ML의 에탄올과 이후로 0.5 ML 수용액을 혼합하여 시켰던 것입니다드라이 아이스 1 분간 인큐베이션. 4 ° C, 0.5 시간을 위해 12,500 RPM에서 샘플을 돌린다. 뜨는을 취소하고 70 % 에탄올로 RNA 펠렛을 씻는다. 추가 원심 분리 후 뜨는 제거하고 진공에서 펠렛을 건조. </li><li> 반응 관의 RNA 솔루션, 에탄올과 진공 건조 RNA와 침전물의 1X Buffer.Pipet 30 μl의 330 UL에서 32 P - 표시 RNA 샘플을 분해, 참조 사다리 (단계 3.5) 생성이 튜브를 유지. 95에서 가열하여 버퍼 RNA 솔루션 ° 2 분 C를 변성. 15 분 상온에서 샘플을 냉정하고 다시 솔루션에 튜브의 뚜껑에 condensates을 가지고 빠른 스핀을 제공합니다. </li></ol> 3. Footprinting 실험 <ol><li> 전기 장식은 분석 젤 당 데이터 요소의 최대 개수를 결정합니다. 우리는 30 잘 빗을 사용합니다. 참조 사다리 2 우물과 uncleaved 컨트롤 하나를 가득 메우고 있습니다. 27 반응 튜브를 준비합니다. 최종 MG (II) concentrati기능은 고르게 적정의 midpoint 주위 규모의 주문을 걸쳐 로그 규모 간격해야합니다. </li><li> 별도로, 5 분 50 RNA와 MG (II) 솔루션 ° C를 품어. 100 μl의 최종 볼륨을 도달 1X 버퍼에 MG의 해당 금액 (II) 90 μl와 RNA 용액 10 μl를 섞는다. 50 30 분 솔루션을 품어 ° C. </li><li> 접는가 발생하는 동안 솔루션은 25 ° C 1 시간에 대한 평형하자. </li><li> Peroxidative (3.4.1) 또는 산화 (3.4.2) 수산기 라디칼 footprinting 반응. <ol><li> 2 μl 철 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (100 ㎜)의 방울을 배치하여 peroxidative 반응을 시작, 2 μl 나트륨 L - 아스코 브 산 (50 ㎜) 2 μl H 2 O 2 (1.5 %)는 반응의 맨 안쪽에 서로 구분 튜브는 RNA 솔루션을 포함하고 활발한 혼합하여 footprinting 반응을 시작합니다. 300 μl 감기 절대 에탄올을 추가로 약 15 초 후에 반응을 중지합니다. 튜브에게 3-5 번 돌립니다. 침전, 세척 및2.4 단계로 펠렛을 건조. </li><li> 신선한 펜톤 반응 믹스 (1.6) 5 μl을 추가하여 산화 히드록실 급진 footprintingreaction를 시작합니다. 25 30 분 품어 ° C. 튜브에게 3-5 번 회전하여 반응과 혼합을 담금질하기 위해 추운 절대 에탄올 300 μl를 추가합니다. 침전, 세척 및 펠렛대로 단계 2.4 표시된 건조. </li></ol></li><li> 단계 1.3 준비 솔루션을 사용하여 표준 절차에 따라 10 RNase T1 다이제스트 참조 예제를 생성합니다. </li><li> 8 μl 젤로드 염료 II (AMBION)와 확인 RNA에서 RNA의 알약을 분해은 가이거 계수기를 사용하여 resuspended 있습니다. </li><li> 11.로드 샘플이 참조 및 제어를 포함하여 표준 프로토콜에 따라 denaturing, 8 % polyacrylamide의 순서 젤을 준비합니다. 60 W에서 별도의 RNA 조각 - 2.5 시간에 대해 75 W. 하룻밤 저장 형광체 화면으로 건조 겔을 쉽게받을 수 있습니다. filmless autoradiography 예위한 이미징 시스템 스캔 형광체 화면. 폭풍 865 (GE 헬스케어) 또는 태풍 (GE 헬스케어). 컴퓨터에 겔 이미지 파일을 전송합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 각 염기의 수산기 라디칼 반응은 분석 젤의 각 밴드의 강도를 quantifying에 의해 결정됩니다. 다운로드, 설치 및 오픈 사파, 단일 밴드 피팅 및 부량을위한 오픈 소스 소프트웨어를 사용하기 편리합니다. 12, 13 사용 설명서의 지침을 따르십시오. 간단히 같은 RNA 시퀀스를로드합니다. txt 파일은. 겔 파일로 겔 사진으로 따라갔다. 밴드 농도를 조절하고, 차선을 정의 앵커 차선을 선택하고 젤 정렬을 수행합니다. 세포핵에 밴드의 임무는 RNase T1의 소화 사다리를 참조에서 발생합니다. 밴드 integrals를 정할 가능성이 불변량 잔류물을 정상화하고 할당 정상화 / colorplot 기능을 사용합니다. . txt 파일과 같은 출력을 저장합니다. </li><li> 사파가에서 대표 겔에 골목길과 행을 대표하는 열을 포함하는 스프레드 시트를 출력RNA의 조각에 해당하는 각각의 밴드의 밴드 밀도를 tegrated. 첫째, 끝점 MG (II) 농도 (예제 50 ㎜)의 프로필과 함께 MG (II) 샘플 노에서 파생 보호 프로파일을 비교하여 용매 접근에 눈에 띄는 변화를 표시 보호 사이트를 식별합니다. 낮은 값을, 더 뉴클레오 티드가 히드록실 래디 칼과 반대의 공격으로부터 보호합니다. </li><li> 개인 또는 MG (II) 농도 간의 세포핵의 그룹의 표준 대역 integrals에서 접는 등온선을 만듭니다. •을 - 등온선은 개별적 - Fi 인터넷 접속 = L + (L U)에 의해 부분 채도로 결정됩니다 <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> F는 밴드의 통합 밀도 (들)을 나타냅니다 어디에 분석하고, L과 U는 전환 아래쪽과 위쪽 한계를 나타내며 <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y"> 분수 채도입니다. 14 데이터가 적합한 비선형 리터를 사용하는힐 방정식 (1) 동쪽 평방 분석 프로그램 (우리도 마찬가지 유래 (OriginLab) 또는 GraphPad (GraphPad 소프트웨어, 주식 회사)를 사용합니다.) <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="등식 1"> K D의 평형이 어디 해리 상수, [M] 접는 반응을 mediates 변수,이 예제에서 MG (II)의 농도에 해당하고, N H는 힐 계수이다. 이 절차는 비늘 부분 포화로의 전환은 그 midpoint을 결정하고 전환이 sigmoidal 여부의 현상 학적 테스트를 제공합니다. 사파 (그림 3B)에 의해 분석하고 위에 설명된대로 맞는 순서 젤 (그림 3A)에서 파생된 등온선은 그림 3C에 표시됩니다. 그림 3에 표시된 부분 포화 등온선은 스프레드 시트에서 스케일링에 의해 생성되었다 방정식 분율을 사용하여 최고 맞게 위턱과 아래턱에 한계 (U와 L)에 대한 사파에 의해 생성된 값을 = 값 / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. 대표 결과 : 그림 3은 P4 - P6 RNA • OH의 footprinting 실험에서 담당자 결과를 보여줍니다. 겔 이미지 (왼쪽) 단일 염기 과제로 인해 T1 차선 (각 G의 RNase T1의 앞을)에서 잘 정의된 밴드 가능합니다)) 배경 절단은 (오른쪽 차선) B 최소한의 것을 나타냅니다하고, C) 수산기 라디칼 RNA의 유도 조각은 잘 배경 위에있다. 높은 MG (II)로 낮은에서 전환은 개인 및 RNA 차 구조의 형성을 나타내는 밴드 그룹의 통합 밴드 밀도를 감소와 연관되어있다. 단일 또는 그의 절단 변경 concomitantly '보호'라고 인접한 뉴클레오 티드 그룹. 밀접한의 결정 구조에서 관찰 분자의 용매 액세스할 지역에 해당하는 MG (II)의 특징 • OH 보호는 P4 - P6 RNA의 접는을 중재. 15 접힌 RNA 분자 C 분명 구조적 또는 동적 현상과 상관되지 않은 차 연락 보호 매우 다른 extents (즉, 어떻게 배경 밴드 밀도 감소를 닫습니다)가. 따라서 일부 RNA 분자는 그림 3과 같이, 잘 정의된 구조 전환을 표시되며, 몇몇은하지 않습니다. 밴드 농도는 사파 12 분석 (그림 3B)에 의해 계량 및 표준입니다. 출력 • OH에 대한 보호의 상대 정도를 시각화 '열'플롯이다. 컬러 전환은 MG (II) 또한시 접근의 변화에​​ 대해 설명합니다. 각각 빨간색 또는 파란색 보여줍 더 접근 이상의 세포핵 보호에 화이트. 음영의 각 학위는 보호 곡선 (그림 3C)로 꾸몄다과 힐 방정식 (1)과 같은 바인딩 모델을 분석할 수 수치와 연관되어있다. 지속적인 분리가 제한 153-155 부속 평형 보호 163-164의 해당 가치의 약 두배입니다. ontent "&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 수산기 라디칼 생산과 P4 - P6 RNA를 접는. A) 철 (II)는 과산화수소의 히드록실 래디 칼의 생성을 catalyzes. 아스코 브 산이 함유 철에 철 (III) 다시 줄어 듭니다. B) MG (II)의 부재에서 더 P4 - P6 차 구조는 히드록실 래디 칼은 모든 접근 백본 위치를 침투하고 다니엘 있도록 형성되지 않습니다. MG의 추가 (II)는 오직 용매 접근 백본은 히드록실 래디 칼에 의해 죽습 수 있도록, P4 - P6의 폴딩 시작합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 히드록실 급진적인 footprinting 실험에 대한 개요. A) Dephophorylation와 RNA의 32 P 5' 엔드 라벨. B) 32 정제는 denaturing polyacrylamide 젤에서 RNA를 P - 레이블. C) RNA 밴드의 절단, 후속 RNA 추출, 에탄올 침전. D) Prefolding과RNA의 접는. E) 갓 준비 펜톤 반응 혼합물의 추가는 히드록실 래디 칼을 생성합니다. polyacrylamide 겔 전기 영동을 denaturing하여 F) RNA 조각 분리. 사파 소프트웨어에 의해 RNA 조각의 G) Quantitation. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. peroxidative 펜톤의 footprinting 반응 후 RNA 조각의 분석. (A) RNA는 히드록실 래디 칼에 노출되었고 절단 제품은 denaturing polyacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)를 사용하여 해결이되었습니다. 사진은 MG의 농도 증가 (II)와 peroxidative 절단 제품을 보여줍니다. 참조 및 제어 골목길이 표시됩니다. 이 이미지 파일은 각각의 밴드의 볼륨을 quantitates 사파 프로그램에 입력됩니다. (B) '열'줄거리는 사파에 의해 생성된. (C) 사파에서 염기 번호를 출력 통합 밴드 밀도와 관련된 가치의 스프레드 시트는 같은 힐 equati으로 바인딩 모델로 분석됩니다에 (1). 보호 지역은 MG (II) 농도의 함수로 밴드 통합 밀도의 증가에 따라 선정되었습니다. K D는 RNA의 절반이 모니터링되고있는 사이트에 접혀있는의 MG (II) 농도입니다. 힐 계수, N H은 구속력 cooperativity에 대한 정보를 제공하고이 특정 사이트의 접이식에 관련된 마그네슘 이온의 개수에 대한 낮은 견적을 제공 곡선의 기울기의 측정이다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. 다른 MG (II) 농도를 포함하는 RNA 샘플을 생성하는 대표적인 볼륨.

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<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

히드록실 급진 footprinting는 핵산의 용매 접근 표면적을 평가하는 유용한 도구입니다. 차 구조 14 질적 및 양적 형성은 이러한 이온 종류와 농도, 산도, 온도, 바인딩 단백질이나 접는 공동 요인으로 매개 변수의 함수로 다음 수 있습니다. 정직하고 저렴한 프로토콜과 그 결과 용매 접근성 및 단일 뉴클레오 티드 수준에서 접는 정보의 강력한 조합이 방법은 매우 매력적합니다. 전통적 • OH의 footprinting 반응은 H 2 O 2, 우리는 (그림 1A) 'peroxidative'으로 참조 프로토콜을 추가를 사용하여 수행됩니다. 우리가 강조하는 대안 ( '산화') 프로토콜 17 자연스럽게 반응을 통해 과산화수소의 소량 생산 O 2를 해산 활용 <img alt="방정식 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-...

<table><tbody><tr><td>이름</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate(주의! 독성)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

&#39;peroxidative&#39;와 &#39;산화&#39;히드록실 급진적 footprinting에 의해 rna 구조의 모니터링 평형 변경

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA의 분자 생물학에서 필수적인 역할을한다. 유전 정보를 전달하는 이외에, RNA는 레귤레이터, 바인더 또는 촉매와 같은 특정 생물 학적 역할을 수행 고유한 삼차 구조로 접을 수 있습니다. 차 접촉 형성에 관한 정보는 RNA 분자의 기능을 이해하는 것이 필수적입니다. 히드록실 래디 칼 (• OH)가 높은 반응과 작은 크기로 인해 핵산의 구조 독특한 프로브입니다. 1 footprinting 프로브로 사용하면, 히드록실 래디 칼과 함께 DNA 1과 RNA 2의 phosphodiester 백본의 용매 접근 표면을지도 단일 뉴클레오 티드 해상도만큼 괜찮아요. 히드록실 라디칼 footprinting는 DNA - 단백질 1과 RNA - 단백질 단지의 예 분자간 접촉면 내에 세포핵을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 평형 3 번과 4 번 전환 운동은 soluti의 함수로 수산기 라디칼 footprinting을 실시하여 확인할 수 있습니다에서 변수 또는 시간을 각각. footprinting의 주요 기능은 프로브에게 노출 제한 (예 : &#39;싱글 히트 속도론&#39;) 폴리머의 각 염기의 유니폼을 샘플링 결과입니다 5. 이 비디오 문서에서, 우리는 RNA 샘플의 준비와 MG (II) - 중재 접는 등온선의 결정을 설명하기 Tetrahymena ribozyme의 P4 - P6 도메인을 사용합니다. 우리는 H 2 O 2 (우리가이 &#39;peroxidative&#39;프로토콜 호출)와 자연스럽게 녹아 O 2를 사용하는 귀중한하지만, 널리 알려진 아니라, 대안을 (우리가 부르는 &#39;가 필요합니다 잘 알려진 수산기 라디칼 footprinting 프로토콜의 사용을 설명 산화 &#39;프로토콜). 데이터 감소, 변환 및 분석 절차의 개요가 제공됩니다.

이 프로토콜은 MG (II) - 종속 히드록실 급진 footprinting 두 가지 방법으로 RNA 차 구조 형성을 계량하는 방법을 설명합니다.

&#39;Peroxidative&#39;와 &#39;산화&#39;히드록실 급진적 Footprinting에 의해 RNA 구조의 모니터링 평형 변경

RNA 분자는 생물학에서 필수적인 역할을 합니다. RNA는 유전 정보를 전달할 뿐만 아니라, 독특한 3차 구조로 접혀 ...를 수행할 수 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 하이드록실 라디칼 풋프린팅을 이용하여 RNA 분자가 어떻게 접히는지 확인하는 것입니다. 이는 RNA의 말단 표지, 겔 정제 및 사전 접힘 과정을 통해 수행되며, 이를 통해 후속 단계인 마그네슘 매개 접힘 전 RNA의 구조적 무결성을 보장합니다. 그 다음, 펜톤 시약을 혼합하여 하이드록실 라디칼을 생성하며, 이는 용매 접근성에 따라 RNA 골격을 절단할 수 있습니다. 이후, RNA 절단 생성물을 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하고 자동 방사선 촬영법으로 시각화합니다.밴드 적분 값은 반자동 풋프린팅 분석 소프트웨어를 통해 정량화됩니다. 최종 목표는 RNA의 3차 구조 형성을 반영하는 폴딩 등온선을 생성하는 것입니다. 이는 정규화된 밴드 적분 값을 분율 포화도로 스케일링함으로써 달성됩니다.이후 등온 흡착선을 Hill 방정식에 맞추어 피팅할 수 있습니다. 하이드록시 풋프린팅의 주요 장점은 저렴한 화학 물질을 사용하여 RNA의 3차 구조 정보를 얻을 수 있다는 점입니다. 크기가 작은 하이드록시 라디칼은 활성이 더 높기 때문에 용매 접근 가능 뉴클레오타이드와 매몰된 뉴클레오타이드를 구분하는 완벽한 프로브가 됩니다. 이 방법은 RNA 구조 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 리보솜은 활성 구조에 도달하기 위해 금속 이온을 어떻게 활용할까요? 하이드록실 라디칼 풋프린팅은 RNA의 특이성과 인식의 기본 원리를 이해하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 RNA 3차 구조에 대한 정보를 밝혀낼 뿐만 아니라, RNA 또는 DNA 분자 내의 정밀한 단백질 결합 부위를 결정하는 데에도 사용될 수 있습니다.이 방법의 주요 과제는 리보핵산분해효소(ribonuclease)에 의한 시료 분해를 방지하고, 적절한 양의 RNA 절단을 얻기 위해 철 농도를 최적화하는 것입니다. 또한, 밴드 간격의 세밀한 분석은 상당히 까다로울 수 있습니다. 이 비디오의 주된 이점은 시청자가 하이드록실 라디칼 풋프린팅(hydroxy radical footprint) 실험의 계획 단계와 성공적인 수행 과정을 이해하도록 돕는 것입니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, 서면 프로토콜에 기술된 대로 모든 풋프린팅 시약을 준비하십시오.이 비디오와 함께 제공되는 지침에 따라, 4개의 관련 DFOs를 사용하여 RNA를 생성하고 말단 표지할 수 있습니다. 변성 젤 전기영동을 사용하여 방사성 표지된 RNA를 정제하십시오. 0.3 molar sodium acetate를 사용하여 두 번의 연속적인 젤 추출을 통해 정제된 RNA를 회수하십시오.그 다음, 수용액 0.5 milliliters를 에탄올 1 milliliter와 혼합하여 RNA를 침전시킵니다. 혼합물을 드라이아이스 위에서 1분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리한 후, 상층액을 제거합니다. 70% ethanol로 RNA 펠렛을 세척합니다.추가 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 진공 상태에서 건조하십시오. 다음으로, 정제된 P 32 표지 RNA 샘플을 용해합니다. 1배 반응 버퍼 330 µL가 담긴 새로운 반응 튜브에 RNA 용액 30 µL를 피펫으로 분주하십시오.에탄올로 RNA를 침전시킨 후 진공 상태에서 펠릿을 건조합니다. 건조가 완료되면, 서면 절차에 기술된 대로 이 펠릿을 사용하여 참조 래더를 생성할 수 있으며, 남은 완충 RNA 용액을 95 °C에서 2분 동안 가열하여 변성시킵니다. 샘플을 실온에서 15분 동안 방치한 후, 빠르게 원심 분리하여 응축물을 다시 용액으로 되돌립니다. 풋프린팅 실험을 시작하려면, 30웰 전기영동 겔을 채울 수 있는 충분한 샘플 양에 맞춰 27개의 반응 튜브를 준비합니다.래더와 절단 대조군을 포함시킨 후, 적정 중간 지점의 조제물을 중심으로 여러 자릿수의 로그 스케일 상에서 균등한 간격이 되도록 최종 마그네슘 이온 농도를 결정하십시오. 1배 반응 버퍼 내 마그네슘 이온의 조제 방법은 텍스트에 별도로 기술되어 있습니다. RNA와 마그네슘 이온 용액을 50 °C에서 5분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 RNA 용액 10 µL를 해당 농도의 마그네슘 이온 용액 90 µL와 혼합하십시오.최종 부피 100 µL가 되도록 각 혼합물을 50 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, RNA 폴딩이 일어나는 동안 용액이 25 °C에서 1시간 동안 평형을 이루도록 둡니다. 이와 동시에, 하이드록실 라디칼 풋프린팅 반응을 시작하기 직전에 서면 프로토콜에 설명된 대로 대조군 반응 혼합물을 준비합니다.RNA 솔루션이 들어 있는 반응 튜브의 상단 내벽에 iron EDTA, sodium ascorbate, hydrogen peroxide를 각각 2 µL씩 서로 닿지 않게 분주하여 과산화 반응을 준비합니다. 격렬하게 혼합하여 풋프린팅 반응을 시작합니다. 15초 후, 순수한 차가운 에탄올 300 µL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.튜브를 3~5회 뒤집어 섞어줍니다. 마지막으로 앞서 수행한 것과 같이 펠릿을 침전, 세척 및 건조합니다. 과산화 반응의 대안으로, 갓 조제한 Fenton 반응 혼합물 5 µL를 샘플에 첨가하여 산화 하이드록실 반응을 수행할 수 있습니다. 산화 반응을 25 °C에서 30분 동안 배양합니다.그 다음, 반응을 정지시키기 위해 차가운 순수 에탄올 300 µL를 첨가하고 튜브를 돌려 섞어줍니다. 다시 한번 침전시킵니다. 퍼옥시데이트(per oxidative) 또는 옥시데이트(oxidative) 반응이 완료되면 펠릿을 세척하고 건조합니다.건조된 RNA 펠릿을 8 µL의 gel loading dye two에 녹입니다. 가이거 계수기를 사용하여 P 32 표지 RNA가 재현탁되었는지 확인합니다. 표준 프로토콜에 따라 8% 변성 폴리아크릴아마이드 시퀀싱 겔을 준비합니다. 30웰 콤을 사용하여 두 개의 레퍼런스와 절단 대조군을 포함한 샘플을 로딩합니다.60~75W에서 2시간 30분 동안 RNA 단편을 분리합니다. 건조된 젤을 보관용 인광 스크린에 하룻밤 동안 노출시킵니다. 필름 없는 자동 방사선 사진 촬영을 위해 이미징 시스템으로 인광 스크린을 스캔합니다.그런 다음 분석을 위해 겔 이미지 파일을 컴퓨터로 전송합니다. 데이터 분석을 시작하려면 단일 밴드 피팅 및 정량을 위한 오픈 소스 소프트웨어인 Safa를 실행합니다. RNA 서열을 .txt 파일로 불러온 후, 겔 사진을 .gel 파일로 불러옵니다.레인을 정의하고 밴드 강도를 조정하십시오. 그다음 앵커 레인을 선택하고, RNA T one digestion ladder를 기준으로 밴드와 뉴클레오타이드를 매칭하는 젤 정렬 할당을 수행하십시오. 밴드 강도를 정량화하고 정규화/컬러 플롯 기능을 사용하여 정규화를 진행하며, 잠재적인 불변 잔기를 할당하십시오.결과물을 txt 파일로 저장하십시오. SFA는 겔의 레인을 나타내는 열과 RNA 단편에 해당하는 개별 밴드 적분값을 나타내는 행으로 구성된 스프레드시트를 출력합니다. 먼저, 마그네슘 이온이 없는 샘플에서 얻은 보호 프로파일을 최종 마그네슘 이온 농도의 프로파일과 비교하여 용매 접근성에 뚜렷한 변화를 보이는 보호 부위를 식별해야 합니다.값이 낮을수록 뉴클레오타이드가 하이드록실 라디칼의 공격으로부터 더 잘 보호됨을 의미하며, 그 반대도 마찬가지입니다. 다음으로, 스프레드시트 형식을 사용하여 마그네슘 철 농도에 따른 개별 또는 뉴클레오타이드 그룹의 밴드 강도 전이 곡선을 생성하십시오. 본 프로토콜의 텍스트 부분에 설명된 대로, 이러한 전이 값들을 분율 포화 함수에 맞게 개별적으로 스케일링하십시오. 마지막 단계로, 데이터를 Hill 방정식에 맞게 피팅하십시오.본 분석은 전이를 분율 포화도로 환산하여 전이 중간점을 결정하며, 전이가 시그모이드 형태를 띠는지에 대한 현상학적 검증을 제공합니다. 다음은 P four P six RRNA 하이드록실 라디칼 풋프린팅 실험의 대표적인 결과입니다. 등온선은 Safa가 분석한 시퀀싱 젤로부터 도출되었으며, 분석 섹션에 기술된 방식대로 피팅되었습니다.젤 이미지는 배경 분해가 최소화되었으며, T 1 레인에서 밴드가 뚜렷하게 나타나 단일 뉴클레오타이드 지정이 가능함을 보여줍니다. 하이드록실 라디칼에 의한 RNA 단편화는 배경 수준보다 훨씬 높게 나타납니다. 저농도에서 고농도 마그네슘 이온으로의 전이는 개별 밴드 및 밴드 그룹의 강도 감소와 선택적으로 연관되어 있으며, 이는 RNA의 형성을 나타냅니다.3차 구조 보호는 절단 시 밴드 강도가 동시에 변화하는 단일 또는 연속된 뉴클레오타이드 그룹을 의미하며, 이는 saffer 분석을 통해 정량화 및 정규화됩니다. 결과물은 하이드록실 라디칼에 대한 보호 정도를 시각화한 열 지도(thermal plot)로 나타납니다. 색상 변화는 마그네슘-철 첨가에 따른 접근성 변화를 설명하며, 흰색에서 빨간색으로의 변화는 접근성이 더 높아진 뉴클레오타이드를, 흰색에서 파란색으로의 변화는 보호 정도가 더 높아진 뉴클레오타이드를 나타냅니다.각 음영 단계는 수치 값과 연결되어 있으며, 이를 보호 곡선으로 도식화하고 Hill 방정식과 같은 결합 모델을 통해 분석할 수 있습니다. 본 예시에서 protection 1 5 3부터 1 5 5까지 연결된 평형 해리 상수는 protection 1 6 3부터 1 6 4까지의 해당 값보다 대략 두 배 정도 높습니다. 이 하이드록실 라디칼 풋프린팅 실험은 적절하게 수행될 경우 1.5일 만에 완료할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때, RNA 오염을 방지하기 위해 반드시 장갑과 실험복을 착용해야 함을 유념하십시오. 또한, 최종 철 농도는 실험 시스템에 따라 달라집니다. 따라서 본 절차에 따른 풋프린팅(footprinting)을 수행하기 전에 용량 반응 실험(dose response experiment)을 실시하는 것을 권장합니다.추가적인 질문에 답하기 위해 시간 분해 하이드록실 라디칼 풋프린팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, RNA 분자가 발달 후 어느 결정적인 시점에 미스폴딩되거나 활성 구조에 도달하는가 하는 점입니다. 이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 핵산의 중간 및 일시적인 분자 3차 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 RNA 분자의 3차 구조 형성을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 주의 사항으로, 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 보호 안경을 착용하고 플렉시글라스 차폐막을 사용하는 등의 위험 예방 조치가 권장됨을 잊지 마십시오.

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연구

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Biology

생물학

프라이머 확장 (SHAPE)에 의해 분석 높은 처리량의 선택 2 '수산기 실화는 단일 염기 해상도에서 수천 개의 뉴클레오티드로 수백에서의 RNA 구조를 결정하는 기술을 프로빙 소설 화학, 역전사, 모세관 전기 영동 및 이차 구조 예측 소프트웨어를 사용합니다.

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급진적 기반 biomimetic 화학은 biomarker 개발에 필요한 건물 업 라이브러리에 적용되었습니다.

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이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

배우세요 하이드록실 라디칼 풋프린팅을 이용한 RNA 삼차구조 형성 정량화 방법입니다. 말단 라벨링, 겔 정제, Fenton 시약 처리 후 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 절편을 분석합니다. 이 기법은 RNA 접힘 동역학과 Mg(II) 의존적 구조 안정성 연구에 필수적입니다.

'Peroxidative'와 '산화'히드록실 급진적 Footprinting에 의해 RNA 구조의 모니터링 평형 변경

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