χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

Kinetic CRAC는 전례 없는 짧은 시간 동안 RNA와 RNA 결합 단백질 간의 시간적 연관성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 당사의 교차결합제와 결합하면 kinetic CRAC은 몇 초 내에 살아있는 세포를 가교결합할 수 있습니다. 이는 UV 손상 반응을 줄이고 미세한 분해능에서 응력 반응을 쉽게 연구할 수 있습니다.

Kinetic CRAC은 신규 사용자에게 어려울 수 있는 매우 긴 프로토콜입니다. 또한 RNA를 사용하는 것은 그 자체로 어려움을 겪습니다. RNA 분해를 방지하려면 모든 용액을 여과 멸균하고 피펫과 실험실 벤치를 깨끗하게 유지해야 합니다.

이 방법의 시각적 시연은 일부 단계가 매우 직관적이지 않기 때문에 매우 중요합니다. 여기에는 세포의 UV 가교 결합 및 수확뿐만 아니라 겔에서 가교된 RNA를 추출하는 것이 포함됩니다. 용액 내 미생물에 UV 가교를 수행하려면 원하는 배지 3.5리터에 효모를 0.05의 시작 OD 600에 접종하고 180rpm에서 연속 진탕하면서 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양액을 성장시킵니다.

세포가 원하는 OD에 도달하면 배양액 500ml를 Vari-X-linker 교차결합제에 직접 붓고 254나노미터 UV 250밀리줄로 조사합니다. 가교 후 진공 여과 장치를 사용하여 세포를 필터링합니다. 여과된 세포가 있는 멤브레인을 말아서 T0라고 표시된 50ml 원추형 튜브에 넣습니다. 나머지 세포를 6개의 서로 다른 필터로 여과하고 멤브레인을 3리터의 예열된 스트레스 유발 배지에 떨어뜨려 피펫으로 50초 동안 세게 혼합합니다. 원하는 시점에 500ml 용량의 세포를 계속 가교결합하고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

부착 세포를 가교하려면 세포가 있는 석영 배양 접시를 특수 트레이에 옮기고 254나노미터 UV의 300밀리줄을 조사합니다. 즉시 접시를 얼음 위에 올려 놓습니다. 접시에서 성장 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 10ml를 추가합니다. 긁어내어 세포를 모아 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 300G에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. PBS로 세포를 세척한 후 PBS를 제거하고 세포 펠릿을 드라이아이스에서 스냅 동결합니다. 필요에 따라 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

원심분리기를 섭씨 4도로 설정하고 용리를 위해 샘플당 1.5밀리리터 튜브 2열을 준비합니다. 니켈 비드로 컬럼을 빠르게 회전시켜 공극 부피를 제거합니다. 그런 다음 용리 튜브의 첫 번째 줄에 컬럼을 놓고 200마이크로리터의 용리 완충액으로 채웁니다.

2분 후 컬럼을 빠르게 회전시켜 튜브의 두 번째 줄로 옮깁니다. 그런 다음 이전에 시연된 대로 용출을 반복합니다. 완료되면 모든 용리액을 5ml 튜브에 결합하고 글리코겐 1밀리리터당 20밀리그램 2마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 샘플에 100마이크로리터의 트리클로로아세트산을 추가하고 30초 동안 와류로 가열합니다. 샘플을 아세톤으로 세척한 후 30마이크로리터의 단백질 로딩 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 가이거 계수기를 사용하여 방사능을 확인합니다.

샘플을 섭씨 65도에서 10분 동안 가열하고 1mm 4-12% 프리캐스트 Bis-Tris 겔에 로드합니다. MOPS 버퍼에서 90볼트에서 125분 동안 젤을 실행합니다. 완료되면 젤을 접착 필름으로 감싸고 테이프로 가볍고 단단한 카세트 내부에 고정합니다.

젤을 자동 방사선 촬영 필름에 노출시킨 후 젤을 덮고 있는 접착 랩을 잘라내어 필름을 현상하고 젤이 움직이지 않도록 하고 이미지를 오프셋합니다. 젤 위에 필름을 놓고 관심 밴드를 잘라냅니다. 젤 슬라이스를 2ml 튜브에 넣고 P1000 피펫 팁으로 으깬다.

그런 다음 proteinase K buffer와 proteinase K를 추가하고 섭씨 55도에서 격렬하게 흔들어 샘플을 배양합니다. 짧은 DNA 단편의 정량화를 위해 적절한 래더를 사용하여 100볼트의 프리캐스트 6%TBE 겔에서 cDNA를 1시간 동안 실행합니다. 완료되면 젤을 덮을 수 있을 만큼 충분한 TBE가 있는 액체 밀폐 용기에 젤을 넣고 적절한 양의 SYBR Safe 염료를 추가합니다.

실온에서 15분 동안 젤을 염색합니다. 그런 다음 SYBR 포함 버퍼를 새 TBE로 교체합니다. 젤을 부드럽게 흔들어 10분 동안 씻습니다.

TBE를 배출하고 젤을 투명 폴더에 넣습니다. 폴더를 적절한 크기로 자르고 이미지 퀀트로 젤을 이미지화합니다. 175에서 400 염기쌍 사이의 DNA 조각을 절제하고 겔 조각을 1.5ml 튜브에 넣습니다.

P1000 피펫 팁으로 젤을 부수고 물 400마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 흔들면서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 드라이아이스에 10분 동안 얼립니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 배양을 반복합니다. 튜브에 배치된 필터 컬럼 내부에 두 개의 유리 극세사 필터를 삽입합니다. 그런 다음 절단된 P1000 피펫 팁을 사용하여 TBE 젤 현탁액을 필터 장치로 옮기고 17, 000G에서 30초 동안 스핀다운합니다.

이 프로토콜은 포도당이 부족한 환경에 노출된 효모 세포에서 Nrd1-RNA 상호 작용을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 포도당이 없는 배지로 전환하기 전과 1분, 2분, 4분, 8분, 14분 및 20분 후에 샘플이 교차결합되었습니다. 실험의 자가방사선 사진은 Nrd1의 예상 분자량에서 강렬한 신호를 보여주었으며, 이는 염기서열분석이 불가능한 짧은 무선 표지 RNA에 결합된 단백질을 나타냅니다.

더 긴 RNA 단편에 가교된 단백질인 이 밴드 위의 신호는 분리되었습니다. 포유류 세포에 대한 kinetic CRAC 프로토콜을 수정하기 위해 부착 세포가 있는 접시의 UV 조사를 허용하는 특수 단계가 개발되었습니다. 이 설정의 효율성은 안정적으로 태그된 GFP RBM7의 가교 및 캡처를 통해 측정되었습니다.

교차결합제는 널리 사용되는 자외선 조사 장치와 유사한 효율로 254나노미터 자외선 조사를 사용하여 포유류 세포에서 단백질 RNA 복합체를 회수할 수 있었습니다. 가교결합 중 UV 투과성 석영 페트리 접시의 개발은 단백질 RNA 복합체의 회수를 더욱 향상시켰습니다. Nrd1 데이터는 단백질이 많은 비암호화 RNA 전사체에 결합하는 것을 보여주며, 이는 이러한 전사체의 분해에 관여한다는 것을 나타냅니다.

포도당 결핍 중에 상향 조절되는 HXT6 및 HXT7을 인코딩하는 전사체에 대한 결합도 입증되었습니다. Kinetic CRAC를 사용하면 세포 발달, 스트레스 반응 및 리보솜 또는 스플라이소솜과 같은 고분자 복합체의 조립 중 단백질 RNA 간의 동적 상호 작용을 측정할 수 있습니다.